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एक विरोधी TNF मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (मॉब) के सापेक्ष शक्ति का निर्धारण TNF द्वारा एक इन विट्रो विश्लेषणात्मक विधि का उपयोग कर बेअसर

Published: September 16, 2017 doi: 10.3791/55376
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2
1Research and Development, Probiomed, 2Bioprocess Research and Development Unit, Instituto Politecnico Nacional

Summary

WEHI १६४ कोशिकाओं के साथ एक बेअसर तंत्र का उपयोग कर एक विरोधी TNFα मॉब के सापेक्ष विरोधी अपोप्तोटिक गतिविधि के निर्धारण के लिए एक प्रोटोकॉल यहां प्रस्तुत किया है । इस प्रोटोकॉल एक ही जैविक कार्यशीलता के साथ विभिंन अणुओं की बेअसर ताकत की तुलना के लिए उपयोगी है ।

Abstract

यह प्रोटोकॉल किसी एंटी-TNFα मॉब का उपयोग करके माउस fibroblast सेल मॉडल (WEHI १६४) में TNFα की अपोप्तोटिक गतिविधि की माप को दिखाता है । इसके अतिरिक्त, इस प्रोटोकॉल का उपयोग अन्य anti-TNFα अणुओं जैसे फ्यूजन प्रोटीन का मूल्यांकन करने के लिए किया जा सकता है । सेलुलर मॉडल यहां कार्यरत TNFα-मध्यस्थता apoptosis के प्रति संवेदनशील है जब एक अतिरिक्त तनाव कारक सेल संस्कृति की स्थिति (जैसे, सीरम अभाव) में प्रेरित है । इस प्रक्रिया मिसाल कैसे इस विश्लेषणात्मक परख निष्पादित करने के लिए, कुंजी नमूना तैयारी, सेल कमजोर पड़ने, apoptosis प्रेरण, और स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक माप है कि सफल परिणाम सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है से संबंधित आपरेशनों पर प्रकाश डाला । इस प्रोटोकॉल apoptosis प्रेरण और कुशल संकेत रिकॉर्डिंग से संबंधित सबसे अच्छा प्रदर्शन की स्थिति का पता चलता है, कम अनिश्चितता मूल्यों के लिए अग्रणी ।

Introduction

जैविक शक्ति परख उत्पाद विशेषताओं है कि प्रासंगिक जैविक गुणों से जुड़े हुए है के आधार पर जैविक गतिविधि के मात्रात्मक उपाय है, मात्रा (मास में व्यक्त), जबकि प्रोटीन सामग्री का एक भौतिक उपाय है । शक्ति परीक्षण, अंय विश्लेषणात्मक तरीके के साथ साथ, उत्पाद अनुरूप, स्थिरता, और तुलनात्मक अध्ययन के भाग के रूप में प्रदर्शन कर रहे हैं । इस अर्थ में, शक्ति मापन के लिए प्रदर्शित किया जाता है कि उत्पाद बैचों महत्वपूर्ण गुणवत्ता विशेषताओं (CQAs) या नैदानिक परीक्षणों के बाद और बाजार की मंजूरी के बाद सभी चरणों के दौरान स्वीकृति मानदंड को पूरा ।

Apoptosis कोशिका मृत्यु क्रमादेशित है, स्वाभाविक रूप से जब कोशिकाओं को एक वायरस से संक्रमित है या जब कोशिकाओं को एक पर्यावरणीय कारक है कि सेलुलर व्यवहार्यता और समारोह1,2समझौता से बल दिया जाता है । दूसरों के अलावा, apoptosis अवरोध, या जैविक बेअसर, मुख्य रूप से mAbs के चिकित्सकीय तंत्र ज्ञात में से एक है, विशेष रूप से पुराने रोगों के उपचार में, प्रतिरक्षा मध्यस्थता भड़काऊ विकारों के रूप में. विरोधी TNFα अणुओं p55 और p75 सेल सतह रिसेप्टर्स3के साथ ट्यूमर परिगलन कारक अल्फा (TNFα) की बातचीत को अवरुद्ध द्वारा उनके चिकित्सीय गुणों डालती है, इस प्रकार के अंत में सेलुलर apoptosis के लिए नेतृत्व के संकेत रास्ते को रोकने.

TNFα कुछ पुरानी बीमारियों में सूजन का उत्पादन कर सकते हैं4. TNFα मैक्रोफेज द्वारा extracellular वातावरण में स्रावित spuriously है, जो जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली के संतरियों होते हैं और इस प्रकार के रोग में मुख्य अभिनेताओं को५. एक आम रास्ते के रूप में, TNFα इन बीमारियों के रोगजनन के साथ जुड़ा हुआ है । नियंत्रण के बिना और लगातार प्रेरण और सेल तनाव के तहत, TNFα कोशिका मृत्यु और ऊतक अध कि पतन, अंततः रुमेटी गठिया, Crohn रोग, और अंय रोग प्रोफाइल6के लिए अग्रणी लाती है ।

TNF विरोधी कि TNF और इसकी रिसेप्टर्स के बीच बातचीत को ब्लॉक तेजी से लक्षण को कम करने और इन रोगों की प्रगति में बाधा के लिए एक प्रभावी चिकित्सा के रूप में इस्तेमाल किया गया है. आजकल, विरोधी TNFα दवा उत्पादों को व्यापक रूप से इस cytokine की प्रणालीगत एकाग्रता को नियंत्रित करने के लिए उपयोग किया जाता है, इस प्रकार शामिल ऊतकों के आगे अध कि रोक । इस अर्थ में, एक प्रतिलिपि और मजबूत करने के लिए अपने जैविक प्रभाव को प्राप्त करने के लिए एक दवा की विशिष्ट क्षमता का वर्णन परख प्रदान करना अनिवार्य है ।

इस प्रोटोकॉल में, महत्वपूर्ण कदम-एक बेअसर परख के विकास के दौरान की पहचान-जैविक शक्ति के सफल माप के लिए, जैव विश्लेषणात्मक विधि निष्पादित करने के लिए आवश्यक कौशल पर एक विशेष जोर देने के साथ प्रकाश डाला जाता है । इस जैव विश्लेषणात्मक विधि विभिंन बैचों या विरोधी TNFα दवा उत्पादों के बीच उपयोगी तुलना जानकारी जब एक नैदानिक परीक्षण संदर्भ पदार्थ की तुलना में प्रदान करता है ।

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Protocol

< p class = "jove_content" >

< p वर्ग = "jove_content" >

< p class = "jove_title" > 1. मीडिया और समाधान की तैयारी

  1. संस्कृति माध्यम तैयार: RPMI-१६४० के साथ 10% FBS, पीएच ७.४.
  2. तैयार परख संस्कृति मध्यम: RPMI-१६४० बिना phenol लाल लेकिन साथ 1% FBS, पीएच ७.४.
  3. तैयार सेल वॉश समाधान: DPBS मिलीग्राम और सीए-०.०२% EDTA, पीएच ७.४.
    4. के साथ नि: शुल्क समाधान
  4. तैयार सेल टुकड़ी समाधान: ०.१२५% trypsin with 1 mM EDTA.
    1. गल १०० मिलीलीटर की एक ०.२५% समाधान की trypsin-EDTA और एक बाँझ ५०० एमएल कुप्पी के लिए स्थानांतरण.
      2. सेल वॉश समाधान के १०० मिलीलीटर के साथ
    2. मिश्रण और 15 मिलीलीटर बाँझ ट्यूबों में 15 मिलीलीटर aliquots वितरण । स्टोर at-७० to-८० & #176; C जब तक use.
    3. के माध्यम से इन समाधानों को फ़िल्टर करें ०.२२-& #181; m झिल्ली और वार्म अप करने के लिए ३७ & #176; C का उपयोग करने से पहले कम से कम 30 मिनट के लिए.
  5. तैयार apoptosis-इंडक्शन स्टॉक सॉल्यूशन TNF & #945; हल पर ३.३ & #181; g/मब.
    1. भंग 20 & #181; के g लए TNF & #945; के साथ ५०० & #181; के एल फ़िल्टर-अपने प्राथमिक कंटेनर में निष्फल पानी और मिश्रण जब तक पूरा विघटन ।
    2. एक 15 मिलीलीटर बाँझ ट्यूब में स्थानांतरण और DPBS मिलीग्राम के ५.५ मिलीलीटर जोड़ें-और इस ट्यूब के लिए सीए मुक्त समाधान । मिश्रण धीरे एक भंवर मिक्सर का उपयोग कर.
    3. Aliquot में हल ७० & #181; L अंश । प्रत्येक aliquot को ०.५ मिलीलीटर microtubes में बांटें और स्टोर पर-८० & #176; C.
  6. तैयार apoptosis प्रेरण समाधान: TNF & #945; ४० एनजी/एमएल पर समाधान
    1. गल apoptosis प्रेरण स्टॉक समाधान के एक aliquot, यह एक पानी में स्नान में मशीन 25 & #730; C के लिए 10 min.
    2. apoptosis प्रेरण स्टॉक समाधान करने के लिए ४० एनजी/एमएल जोड़कर ६१ & #181; L के ३.३ & #181; g/मब TNF & #945; समाधान के लिए ४.९३९ मिलीलीटर परख संस्कृति मध्यम में एक 15 मिलीलीटर बाँझ ट्यूब.
      3. 10 एस के लिए भंवर मिक्सर द्वारा
    3. मिश्रण; उपयोग करने से पहले यह समाधान नए सिरे से तैयार किया जाना चाहिए ।
    4. वार्म अप समाधान ३७ & #176; सी के लिए कम से 30 मिनट पहले वें eneutralization परख में उपयोग करने के लिए ।
  7. सब्सट्रेट समाधान तैयार करें: caspase 3/7 Glo हल < सुप class = "xref" > 7 , < सुप class = "xref" > 8 .
    1. गल caspase बफर सॉल्यूशन (caspase 3/7 Glo बफर) का उपयोग करने से पहले 12 ज.
    2. चलो caspase बफर समाधान और सब्सट्रेट (caspase 3/7 Glo सब्सट्रेट) पर अलग से बैठो 25 & #177; 5 & #176; ग के लिए 30 मिश्रण से पहले मिनट ।
    3. हस्तांतरण सब्सट्रेट शीशी और मिश्रण करने के लिए caspase बफर समाधान के 10 मिलीलीटर.
    4. ंच 25 & #177; 5 & #176; C, लाइट-सुरक्षित जब तक उपयोग.
      नोट: समाधान कमरे के तापमान पर 6 घंटे के लिए स्थिर है ।
< p class = "jove_title" > 2. सेल संवर्धन और काउंटिंग

  1. सेल गल और पहली उपसंस्कृति.
    1. WEHI १६४ कक्षों के साथ एक शीशी निकालें < सुप वर्ग = "xref" > 9 को फ्रीजर से ऑन-८० & #730; सी और उन्हें एक आइस-बाथ में ट्रांसफर कर दें ।
    2. पिपेट ऊपर और नीचे 1 मिलीलीटर के साथ नीचे पूर्व गर्म संस्कृति मध्यम तक जमे हुए कोशिकाओं को पूरी तरह से गल.
    3. एक 15 मिलीलीटर बाँझ ट्यूब पर पूर्व गर्म संस्कृति माध्यम के 9 मिलीलीटर तिरस्कृत ।
    4. 15 मिलीलीटर बाँझ ट्यूब में सेल निलंबन हस्तांतरण और धीरे से उलटा करके पांच बार मिश्रण ।
    5. 3 मिनट के लिए १२५ x g पर सेल का निलंबन केंद्रापसारक supernatant त्याग और सेल गोली समग्र ।
    6. ट्यूब करने के लिए संस्कृति मध्यम के 5 मिलीलीटर जोड़ें । मिश्रण जब तक कोशिकाओं को पूरी तरह से reसस्पैंड कर रहे हैं ।
      7. सेल की मतगणना के लिए
    7. , स्थानान्तरण ५० & #181; l को सेल का निलंबन एक ५०० & #181; l microtube और मिश्रण के साथ ५० & #181; l का ०.४% trypan नीला. कोशिकाओं को गिनने और ०.५ x 10 6 कोशिकाओं/एमएल करने के लिए समायोजित करें । चरण २.२, नीचे देखें ।
    8. एक ७५ मिलीलीटर सेल संस्कृति कुप्पी के लिए पूर्व गर्म संस्कृति माध्यम के 13 मिलीलीटर जोड़ें ।
    9. को प्राप्त करने के लिए चरण 2.1.6 से पर्याप्त कोशिका निलंबन की मात्रा का वितरण ०.५ x 10 6 कोशिकाओं/एमएल में सेल संस्कृति कुप्पी और मशीन में ३७ & #176; ग और 5% कं 2 रात भर.
  2. सैल गिनते.
    नोट: देखें संदर्भ < सुप वर्ग = "xref" > १० .
    1. चरण 2.1.6 से समाधान का उपयोग कर, एक hemocytometer के लिए ०.०५ मिलीलीटर हस्तांतरण और trypan नीले अपवर्जन का उपयोग कर एक खुर्दबीन के नीचे सेल घनत्व का निर्धारण ।
    2. कोशिकाओं और व्यवहार्य कोशिकाओं की कुल संख्या को बढ़ाता है ।
    3. ०.५ x 10 6 कोशिकाओं/एमएल.
      के लिए सेल सस्पेंशन समायोजित करें समीकरण 1
      वी कल्चरल मीडियम (ml) = < img alt = "समीकरण 1" src = "//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55376/55376eq1.jpg"/>
      v culture मीडियम (mL) = (5mL-v cell suspension )
      V कल्चर मीडियम (ml) = समायोजित WEHI की मात्रा १६४ सेल सस्पेंशन
      NVC = व्यवहार्य WEHI १६४ कोशिकाओं की संख्या/एमएल
      वी कल्चरल मीडियम (एमएल) = परख संस्कृति मध्यम मात्रा सेल निलंबन को प्राप्त करने के लिए जोड़ा ०.५ x 10 6 कोशिकाओं/एमएल
      ०.५ x 10 6 & #160; = लक्ष्य कोशिका घनत्व
  3. कोशिका टुकड़ी र अर्को र तेस्रो उपसंस्कृति ।
    नोट: एक वैक्यूम प्रणाली के लिए कुप्पी से समाधान निकालने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । डिस्पोजेबल या कांच बाँझ पिपेट किया जा सकता है । यदि पिपेट शीर्ष पर एक कपास रोकना है, यह प्रयोग करने से पहले हटा दिया जाना चाहिए ।
    1. सेल संस्कृति टी से संस्कृति मध्यम निकालें एक 1 मिलीलीटर बाँझ पिपेट और एक निर्वात का उपयोग कर कुप्पी.
    2. में सेल वॉश सॉल्यूशन के 5 मिलीलीटर बांटना संस्कृति टी कुप्पी, धीरे मिश्रण, और समाधान त्यागें । इस चरण को दो बार दोहराएं ।
      नोट: संस्कृति माध्यम के पूर्ण हटाने के कुशल कोशिका टुकड़ी के लिए महत्वपूर्ण है ।
    3. टी के लिए सेल टुकड़ी समाधान के 15 मिलीलीटर-कुप्पी जोड़ें और दो एक मशीन में 3 मिनट के लिए ३७ & #176 पर खड़े हो जाओ; सी और 5% कं 2 .
    4. माइक्रोस्कोप के तहत कुप्पी भीतरी दीवार में संलग्न कोशिकाओं के अभाव का सत्यापन करें । एक 20 मिलीलीटर बाँझ पिपेट का उपयोग कर संस्कृति टी-कुप्पी से कोशिकाओं को निकालें और उन्हें एक ५० मिलीलीटर बाँझ ट्यूब में बांटना ।
    5. 3 मिनट के लिए १२५ x g पर सेल का निलंबन केंद्रापसारक । supernatant त्यागें और संस्कृति माध्यम के एक और 5 मिलीलीटर के साथ गोली स्थगित ।
    6. गणना कोशिकाओं और पर्याप्त संस्कृति माध्यम जोड़ने के लिए वांछित कोशिका एकाग्रता तक पहुंचने के अनुसार समीकरण 1 .
    7. इस निलंबन को एक ७२ सेमी 2 टी-कुप्पी और गर्मी में रात भर ३७ & #176; ग और 5% कं 2 .
    8. उपसंस्कृति कोशिकाओं को बेअसर परख में इनका उपयोग करने से पहले कम से दो बार । अगले दो दिनों के लिए चरण 2.3.1-2.3.8 दोहराएँ ।
  4. परख सैल निलम्बन.
    1. एक WEHI १६४ उपसंस्कृति का चयन करें जिसमें कम से तीन पास हो । चरण २.१.
      2. देखें
    2. अलग और चरणों २.२ और इस प्रोटोकॉल के २.३ के अनुसार कोशिकाओं की गणना ।
    3. समीकरण के अनुसार सेल सस्पेंशन को पतला करें 1 से ०.५ x 10 6 cells/एमएल.
    4. बेअसर परख के लिए इस सेलुलर निलंबन का उपयोग करें । उपयोग करने से पहले भंवर मिक्सर द्वारा सभी सेल सस्पेंशन मिश्रण.
< p class = "jove_title" > 3. एंटीबॉडी तैयारी और कमजोरियां

  1. Quantitation की mAbs.
    1. संदर्भ पदार्थ की एकाग्रता निर्धारित करते हैं, नियंत्रण नमूना, और विश्लेषणात्मक नमूना यूवी अवशोषण के माध्यम से २८० एनएम में उनके बड़े पैमाने पर विलुप्त होने गुणांक का उपयोग (1.39) < सुप वर्ग = "xref" > ११ .
      नोट: मूल सांद्रता दवा उत्पाद लेबल से लिया जा सकता है । हालांकि, यह यूवी अवशोषण द्वारा सत्यापित किया जाना चाहिए ।
  2. मॉब कमजोरियां.
    1. तपसिल में स्वतंत्र रूप से सभी नमूनों को पतला, DPBS मिलीग्राम के साथ-और सीए मुक्त समाधान 2 मिलीलीटर microtubes में, 2 मिलीग्राम/एमएल के लिए नीचे । तपसिल में यूवी अवशोषण द्वारा इस एकाग्रता की पुष्टि करें, DPBS मिलीग्राम का उपयोग कर-और सीए मुक्त समाधान के रूप में खाली.
    2. मिश्रण एक भंवर मिक्सर का उपयोग कर 5 एस के लिए स्टॉक प्रोटीन समाधान ।
    3. पतला १०० & #181; L प्रत्येक 2 मिलीग्राम/एमएल मॉब समाधान के ०.९ एमएल के साथ परख संस्कृति माध्यम.
      4. भंवर मिक्सर द्वारा 5 एस के लिए
    4. मिश्रण.
      नोट: इन समाधानों में २०० & #181; g/mL की एकाग्रता है । कमजोर पड़ने प्रत्येक तपसिल के लिए किया जाना चाहिए.
    5. पतला 10 & #१८१; L प्रत्येक २०० & #181; g/ml मॉब समाधान के साथ ०.९९ एमएल परख संस्कृति माध्यम के । एक भंवर मिक्सर का उपयोग कर 5 एस के लिए मिक्स । इन समाधानों में 2 & #181; g/mL की एकाग्रता होती है । उन्हें बेअसर परख में उपयोग करने से पहले प्रत्येक तपसिल के लिए धारावाहिक कमजोर पड़ने प्रदर्शन ।
    6. कर एंटी-TNF & #945; मॉब कमजोरियां तीन स्वतंत्र microplates । प्रत्येक स्वतंत्र तपसिल से एक डुप्लिकेट बनाओ और उंहें एक microplate में बांटना, के रूप में तालिका 1 में संकेत दिया । संदर्भ पदार्थ < सारणी फो: रख-जुलकर रखें । भीतर पृष्ठ = "1" के लिए फो: रख-साथ-साथ अगला । भीतर पृष्ठ = "हमेशा" के लिए फो: पाठ-संरेखित करें = "केंद्र" > < td colspan = "2" > प्लेट 1 < td colspan = "2" > प्लेट 2 < td colspan = "2" > प्लेट ३ वेल्स नमुना वेल्स नमुना वेल्स नमुना B2: B11 < td rowspan = "2" > संदर्भ पदार्थ B2: B11 < td rowspan = "2" > Control sample b2: B11 < td rowspan = "2" > विश्लेषणात्मक नमूना c2: C11 c2: C11 c2: C11 d2: D11 < td rowspan = "2" > विश्लेषणात्मक नमूना d2: D11 < td rowspan = "2" > संदर्भ पदार्थ D2: D11 < td rowspan = "2" > नियंत्रण नमुना e2: E11 e2: E11 e2: E11 f2: f11 < td rowspan = "2" > Control sample f2: f11 < td rowspan = "2" > विश्लेषणात्मक नमूना F2: F11 < td rowspan = "2" > संदर्भ पदार्थ g2: G11 g2: G11 g2: G11 तालिका 1: Microplate नमूना arrays. एक पूरा बेअसर परख तीन microplates में G11 के लिए 2 निर्देशांक के भीतर चलाया जाना चाहिए । संदर्भ के यादृच्छिक वितरण, विश्लेषणात्मक, और नियंत्रण के नमूने शोधकर्ताओं परख में किसी भी पूर्वाग्रह की पुष्टि करने के लिए अनुमति देते हैं ।
    7. प्रत्येक संदर्भ, नमूना, या नियंत्रण के मॉब कमजोरियां प्रदर्शन, के रूप में तालिका 2 .
      में दिखाया गया नोट: anti-TNF & #945; इस तालिका में वर्णित मॉब सांद्रता बेअसर परख में अंतिम सांद्रता नहीं हैं । < तालिका बॉर्डर = "1" फो: साथ-साथ रखें । भीतर पृष्ठ = "1" फो: रखने के साथ-अगले । भीतर-पृष्ठ = "हमेशा" > प्लेट कॉलम परख की मात्रा संस्कृति माध्यम (& #956; L) संदर्भ पदार्थ, विश्लेषणात्मक नमूना या नियंत्रण की मात्रा नमूना (uL) एकाग्रता में परख प्लेट (एनजी/ 2 0 २३० २००० 3 १५० १५० से लाइन 2 १००० 4 ७५ ७५ से लाइन 3 ५०० 5 १०० ५० से लाइन 3 ३३३ 6 ७५ ७५ से लाइन 4 < टीडी > २५० 7 ७५ ७५ से लाइन 5 १६६ 8 ७५ ७५ से रेखा 6 १२५ 9 ७५ ७५ fro एम लाइन 7 ८३ 10 ७५ ७५ से लाइन 9 ४१ 11 १५० ७५ से लाइन 10 13 T समर्थ 2: Anti-TNF & #945; मॉब कमजोरियां । धारावाहिक कमजोरियां विरोधी TNF & #945; mAbs इस तालिका में प्रदर्शन कर रहे हैं । इस सारणी में वर्णित अंतिम सांद्रता परख में सांद्रता नहीं हैं, जहां anti-TNF & #945; mAbs 3 (मॉब कमजोर पड़ने + कल्चरल मीडियम + cells suspension) के एक कारक द्वारा पतला किया गया । बोल्ड लाइनों 3, 5, 7, 9, और 10 लाइनों से आ रही कमजोरियां का प्रतिनिधित्व करते हैं; गैर-बोल्ड लाइनों लाइनों 3, 4, और 6 से कमजोर पड़ने का प्रतिनिधित्व करते हैं । ये धारावाहिक कमजोर पड़ने के बस बेअसर परख प्रदर्शन करने से पहले किया जाता है । ध्यान pipetting ऊपर और नीचे तीन बार कमजोर पड़ने वितरण से पहले मिश्रण करने के लिए लिया जाना चाहिए ।
    8. 25 & #177 पर प्लेट रखें; 5 & #176; ग तक उपयोग क ֩
< p class = "jove_title" > 4. WEHI १६४ कोशिकाओं के साथ बेअसर परख इस प्रोटोकॉल के किसी भी कदम पर वितरण से पहले सभी सेल सस्पेंशन (०.५ x 10 6 कोशिकाओं/एमएल) भंवर द्वारा
  1. मिश्रण ।
    नोट: इस खंड में, गर्म प्रत्येक समाधान के लिए ३७ & #176 का उपयोग करने से पहले 30 मिनट के लिए सी;
  2. अंतरण ५० & #181; एल के प्रत्येक ६० कुओं को सेल सस्पेंशन के microplates, कॉलम 2 से 11 और लाइन बी से जी.
  3. अंतरण ५० & #181; मॉब संदर्भ, नमूना, और microplates में नियंत्रण कमजोर पड़ने के एल । < सुदृढ वर्ग में दर्शाए गए प्रतिमान का अनुसरण करें = "xfig" > चित्रा १ .
  4. Add ५० & #181; प्रत्येक वेल को apoptosis इंडक्शन सॉल्यूशन के एल.
  5. का उपयोग सेलुलर नियंत्रण के ५० & #181; WEHI १६४ कोशिकाओं के एल, तीन कुओं में तिरस्कृत. एक अच्छी तरह से १५० & #181 के अंतिम मात्रा में लाओ, परख संस्कृति माध्यम के साथ एल ।
  6. ५० & #181 के मिश्रण का एक cytotoxicity नियंत्रण का उपयोग करें; l के WEHI १६४ cells plus ५० & #181; l के apoptosis प्रेरण समाधान । एक अच्छी तरह से १५० & #181 के अंतिम मात्रा में लाओ, परख संस्कृति माध्यम के साथ एल ।
  7. के लिए TNF & #945; नियंत्रण, उपयोग ५० & #181; l के apoptosis प्रेरण समाधान और इसे लाने के लिए १५० & #181; l को परख संस्कृति माध्यम के साथ.
    8. कोरा के लिए
  8. , प्रयोग १५० & #181; परख संस्कृति माध्यम अकेले के एल ।
  9. शेष कुओं को १५० & #181 के साथ भरें; प्लेट वाष्पीकरण प्रभाव से बचने के लिए संस्कृति माध्यम के एल.
  10. दोहराते कदम शुू-4.1.9 दो अनय microplates मे दुगुनी हो जाती है ।
    नोट: microplate में मॉब अंतिम सांद्रता हैं: 0.666, ०.३३३, ०.१६७, ०.१११, ०.०८३, ०.०५६, ०.०४२, ०.०२८, ०.०१४, और ०.००४ & #181; g/mL.
    11. नमूनों को microplates में
  11. लोड करें, जैसा कि < सबल वर्ग में दर्शाया गया है = "xfig" > चित्रा 1 .
    < img alt = "figure 1" class = "xfigimg" src = "//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55376/55376fig1.jpg"/>
    < सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा १: विन्यास प्लेटों में नमूनों का जमाव. B1 करने के लिए G11 अच्छी तरह से microplates में निर्देशांक और स्थितियों जहां नमूना कमजोर पड़ने रखा जाता है का वर्णन कर रहे हैं । लापता निर्देशांक कुओं नियंत्रण और परख संस्कृति मध्यम (A1-A12 और H1-H12) से भर रहे हैं । नमूनों के इस यादृच्छिक वितरण (आगे और microplates में रिवर्स कमजोर पड़ने) मध्यम या अंय चर के वाष्पीकरण के कारण परिणामों में पूर्वाग्रह को खत्म करने में मदद करता है । यह सबसे अच्छा है कि प्रत्येक microplate एक समय में एक विश्लेषक द्वारा किया जाता है । आर: संदर्भ, एस: नमूना, सीएस: नियंत्रण नमूना, दिल: कमजोर पड़ने । < a href = "//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55376/55376fig1large.jpg" target = "blank" > कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।
  12. तीन प्लेट्स पर ३७ & #176; ग और 5% कं 2 के लिए 16 & #177; 2 ज.
  13. चलो caspase 3/7 Glo रिएजेंट स्टैंड पर 25 & #177; 5 & #176; C उपयोग करने से पहले 30 मिनट के लिए.
  14. Add १०० & #181; L के नमूने और नियंत्रण सहित सभी कुओं को इस रिएजेंट के.
  15. 3 मिनट के लिए एक microplate भंवर मिक्सर का उपयोग कर प्लेटें शेक 25 & #177; 5 & #176; सी कुएं में औषधालय के तुरंत बाद.
  16. के लिए प्लेटें २.५ & #177; ०.५ h पर 25 & #177; 5 & #176; ग, प्रकाश से रक्षित.
  17. डालें micluminometer में roplates और अगले सेक्शन को पूरा करें ।
< p class = "jove_title" > 5. परिणामों का विश्लेषण

  1. luminescence डिटेक्शन के लिए किसी सॉफ़्टवेयर का उपयोग करते हुए, luminescence मोड और समापन बिंदु फ़ंक्शन का चयन करें ।
  2. एक ९६-अच्छी तरह से स्पष्ट नीचे प्लेट और उसके ८० आंतरिक कुओं का चयन करें, 1 और 12 कॉलम को छोड़कर ।
  3. १,२५० ms के एकीकरण समय का चयन करें और पढ़ने से पहले microplate मिश्रण के लिए 10 एस.
  4. कुओं का चयन करें, जहां संदर्भ पदार्थ, विश्लेषणात्मक पदार्थ, और नियंत्रण नमूना रखा जाएगा और उनकी इसी सांद्रता के साथ की पहचान ।
  5. ने luminometer के साथ microplates में रखे गए नमूनों को पढ़ा ।
  6. परिणामों के विश्लेषण के लिए एक चौथा पैरामीटर समीकरण का उपयोग करें । ग्राफ एक खुराक-प्रतिक्रिया वक्र, के रूप में < मजबूत वर्ग में चित्रित = "xfig" > चित्रा २ .
    < img alt = "figure 2" class = "xfigimg" src = "//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55376/55376fig2.jpg"/>
    < सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा २: दोसे-प्रतिसाद वक्र. Anti-TNF & #945; मॉब एकाग्रता बनाम luminescence (कोशिका व्यवहार्यता) दर्शाया गया है । anti-TNF & #945; mAbs की सुरक्षा का वर्णन करने वाला चौथा पैरामीटर समीकरण एक मॉडल के रूप में उपयोग किया गया था । EC50 मॉब की एकाग्रता है जो TNF & #945 की मात्रा को बेअसर कर सकती है; जो प्रत्येक परख में ५०% कोशिका मृत्यु का कारण है, ग्राफ में ढाल में परिवर्तन के रूप में उदाहरण । पट्टियां प्रत्येक मॉब एकाग्रता के लिए luminescence के मानक विचलन का वर्णन करते हैं । x का प्रतिनिधित्व करता है विरोधी TNF & #945; Ab एकाग्रता और एनजी/एमएल में एक लघुगणकीय समारोह के रूप में दर्शाया गया है, जबकि y मनमाना luminescence इकाइयों में luminescence प्रतिक्रिया का प्रतिनिधित्व करता है । < a href = "//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55376/55376fig2large.jpg" target = "blank" > कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।
    नोट: चौथे पैरामीटर समीकरण में, C प्रभावी एकाग्रता ५० (EC50) है । यह मान संदर्भ पदार्थ की तुलना करने के लिए उपयोग किया जाएगा, विश्लेषणात्मक नमूना, और नियंत्रण नमूना के माध्यम से meaner फ़ंक्शन.
  7. सापेक्ष potencies की गणना के लिए, १००% संदर्भ पदार्थ को ठीक करें और नमूने के potencies की गणना और तदनुसार नियंत्रण ।
    नोट: उन मानों को < सबल वर्ग में दर्शाया गया है = "xfig" > चित्रा 3 .
    < img alt = "चित्रा 3" class = "xfigimg" src = "//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55376/55376fig3.jpg"/>
    < मज़बूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 3: गणितीय समीकरण EC50s और उनके मूल्यों की गणना के लिए इस्तेमाल किया. EC50 मूल्यों, या सी पैरामीटर, उनकी अनिश्चितता मानक त्रुटि के रूप में चित्रित किया है । नमूना और सापेक्ष शक्ति के संदर्भ परिणामों के बीच EC50s की तुलना भी दर्शाया गया है । विश्वास अंतराल एक & #945; = ०.०५ के साथ परिकलित की जाती है । < a href = "//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55376/55376fig3large.jpg" target = "blank" > कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

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Representative Results

खुराक-प्रतिक्रिया ग्राफ (नियंत्रण के साथ)
चित्रा 1 मॉब एकाग्रता बनाम luminescence प्रतिक्रिया का प्रतिनिधित्व करता है । इस sigmoidal समारोह मिसाल caspase 3 और 7 परख संस्कृति माध्यम में रिलीज के कारण सेल lysis । कोशिका मृत्यु सीरम भुखमरी प्लस TNFα संकेतन प्रेरण द्वारा बढ़ाया है । इसलिए, विरोधी TNFα अणु (मॉब) cytokine के साथ बातचीत, बाधा (steric बाधा द्वारा) TNF सेल रिसेप्टर के साथ अपनी बातचीत. यह उच्च मॉब सांद्रता में सेल अस्तित्व का कारण बनता है ।

विधि में इस्तेमाल नियंत्रण थे: परख संस्कृति माध्यम, कोशिकाओं से अधिक TNFα प्लस परख संस्कृति माध्यम के साथ कोशिकाओं, और परख संस्कृति mediumalone । FBS भुखमरी के तहत परख संस्कृति माध्यम के साथ अकेले कोशिकाओं apoptosis से गुजरना नहीं था, इस प्रकार luminescence विकासशील । इसके अलावा, TNFα अकेले उजागर कोशिकाओं लेकिन संस्कृति माध्यम के साथ खेती वास्तव में जीवित था ।

एक अंय महत्वपूर्ण नियंत्रण परख संस्कृति अकेले माध्यम है । इस नियंत्रण के माध्यम से संबंधित आणविक हस्तक्षेप की समझ के साथ मदद करता है, विशेष रूप से प्रोटीन है कि caspase सब्सट्रेट पचा सकता है, इस प्रकार एक झूठी सकारात्मक luminescent संकेत का संकेत. EC50 और सापेक्ष शक्ति परिणाम तालिका 3में चित्रित कर रहे हैं ।

नमूना EC50 सापेक्ष शक्ति (%) विश्वास अंतराल (%) RDS (%)
संदर्भ पदार्थ २४१.५ १०० -- --
२४३.६
२३४.२
विश्लेषणात्मक नमूना २२५.२ ९९.७ 86.0-115.1 ८.५
२४०.३
२५८.८
नियंत्रण नमूना २३०.५ ९७.१ 86.5-108.7 ६.९
२६४
२४८.४

तालिका 3: सापेक्ष शक्ति परिणाम. विश्लेषणात्मक नमूना एक ज्ञात शक्ति नमूना, संदर्भ के रूप में तालिका में वर्णित की तुलना में है, एक निश्चित १००% शक्ति के साथ. संबंध प्रत्येक नमूने के EC50 के साथ गणना की है । अंतराल ९५% विश्वास (α = ०.०५) पर परिकलित की जाती है । RSD: सापेक्ष मानक विचलन ।

तालिका 3 सापेक्ष शक्ति, प्रतिशत में, एक संदर्भ मॉब और जांच के तहत एक नमूना के बीच से पता चलता है । तुलना संदर्भ के 80-120% की एक सीमा के भीतर माना जाता है । हालांकि, कई बार संदर्भ बैचेस के बीच बड़ी परिवर्तनशीलता है; इसलिए, स्वीकृति की सीमा बदल सकते हैं । इसलिए, यह विनिर्माण के एक छोटी अवधि के भीतर संदर्भ बैचों का चयन करें, भौतिक गुण और स्वीकृति अंतराल कस वांछित है ।

इस तालिका से पता चलता है कि संदर्भ १००% की शक्ति है, जबकि विश्लेषणात्मक नमूना ९९.७% की शक्ति है । इस परिणाम का मतलब है कि नमूना द्वारा TNFα बेअसर क्षमता संदर्भ की तुलना में है । यह आशा की जाती है कि cytokine के प्रतिव्यक्तीकरण से संबंधित व्याधियों को इन mAbs से नियंत्रित किया जा सकता है.

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Discussion

यह लक्षण वर्णन करने में मदद करता है एक प्राथमिकताओं विकास के तहत एक अणु के जैविक व्यवहार महंगा और समय लेने वाली नैदानिक परीक्षणों से पहले आयोजित की जाती हैं । यह भी एक अनुमोदित दवा उत्पाद के बैच के लिए बैच जारी करने के लिए उपयोगी है । यह उल्लेख है कि इन परख अगर एक अणु एक पर्याप्त जैविक कार्रवाई के अपने तंत्र के बारे में प्रभाव है निर्धारित करने के लिए उपयोगी होते है लायक है । जैव विश्लेषणात्मक इस ट्यूटोरियल में प्रस्तुत विधि अलग विरोधी TNFα अणुओं की तुलना करने के लिए महत्वपूर्ण है । आम भौतिक विधि के बावजूद, इस पद्धति का निर्धारण करने में सक्षम है, जैविक साधनों के माध्यम से, शक्ति और एक गुणवत्ता विशेषता के रूप में एक दवा की प्रभावकारिता, इस प्रकार प्रभाव के कार्यों का पूरा और पूरा महत्व दिखा.

सामांयतः, सेल apoptosis जवाबदेही TNFα करने के लिए शोधकर्ताओं के लिए एक चुनौतीपूर्ण कार्य किया जा सकता है प्रदर्शन करने के लिए । समस्या निवारण सेल बैंक है कि एक दैनिक आधार पर इस जैविक विधि मानकीकरण से पहले प्रयोग किया जाता है के लक्षण वर्णन के माध्यम से आयोजित किया जा सकता है । एक उदाहरण के सेल से संबंधित एक समय अवधि के भीतर कोशिका प्रतिक्रिया परिवर्तनशीलता है लाइन उंर बढ़ने12। यह समस्या-८० डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए एक मास्टर सेल बैंक का उपयोग कर समाप्त हो गया है । कार्यरत सेल बैंक को एक डो R & #38;D या गुणवत्ता नियंत्रण प्रयोगशाला में उपयोग के लिए एक वर्ष की अवधि के द्वारा किए गए अध्ययन की आवश्यकताओं को कवर करने के लिए पर्याप्त बड़ा होना चाहिए । इसके अलावा, इस जवाबदेही तापमान स्थिर समाधान का उपयोग कर उंहें कोशिकाओं को इस प्रोटोकॉल के दौरान किसी भी कदम पर जोड़ने से पहले तय किया जा सकता है । एक बेअसर परख चलाने और समय है कि कोशिकाओं को सतत संस्कृति में अनुकूलन और जनसंख्या गतिशीलता12,13के कारण हो रहे है की लंबाई सीमित करने से पहले एक से कम तीन गुजरता प्रदर्शन किया जाना चाहिए ।

TNFα अणु फ्रीज-गल चक्र से संरक्षित किया जाना चाहिए, इस प्रोटीन की शक्ति के रूप में काफी अगर स्थिर नहीं आंका । cytokine तैयारी के लिए14 अन्यत्र उद्धृत योगों का सुझाव दिया जाता है जब पुनर्गठन cytokine संग्रहीत किया जाएगा, TNFα की एकाग्रता के रूप में प्रोटोकॉल सफलता के लिए महत्वपूर्ण है । एक cytokine के लिए एक कोशिका की जवाबदेही सेल प्रति रिसेप्टर्स की संख्या पर निर्भर करता है. इसलिए, इष्टतम TNFα एकाग्रता सेल लाइन और घनत्व15,16पर निर्भर करता है । हम १३.३ एनजी/एमएल के अंतिम एकाग्रता को TNFα पतला और सेल घनत्व २५,००० कोशिकाओं के आसपास एक वक्र का उपयोग कर समायोजित/ इसलिए, कोशिका घनत्व प्रत्येक TNFα एकाग्रता के लिए सत्यापित किया जाना चाहिए ।

केमाको-Villegas एट अल. १.२५ एनजी/एमएल के एक TNFα अंतिम एकाग्रता रिपोर्ट; यह समूह भी actinomycin डी एक तनाव सेल फैक्टर9,17,18के रूप में उपयोग करता है । हम बजाय 10% से 1% करने के लिए संस्कृति माध्यम से FBS को परख मध्यम बदल गया है, एक मजबूत तनाव देने के लिए अकेले TNFα के साथ WEHI १६४ कोशिकाओं में apoptosis प्रेरित संकेत, प्रोटोकॉल से एक और चर को नष्ट करने । अंय समूह रिपोर्ट कक्ष व्यवहार्यता का उपयोग MTT । एक luminescence caspase 37के लिए संवेदनशील सब्सट्रेट का उपयोग कर के तरीके, बजाय स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक विधि जहां यूवी की तुलना में अवशोषण पदार्थ संस्कृति माध्यम में मौजूद हैं या कोशिकाओं को खुद (जैसे, phenol लाल अवशोषित कोशिकाओं द्वारा), संकेत के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं. इस प्रकार, परख की संवेदनशीलता इस Ac-DEVD-ॄणा luminescentreactant का उपयोग करके बढ़ाई गई थी, क्योंकि संस्कृति माध्यम में luminescent पदार्थों (बैकग्राउंड) की उपस्थिति अपेक्षित नहीं है ।

इस विधि की एक सीमा है कि यह केवल TNFα-संवेदी कक्षों के लिए लागू किया जा सकता है; अंय कोशिकाओं लाइनों और परीक्षण किया जाना चाहिए cytokine एकाग्रता एक अनुकूलित सेलुलर प्रतिक्रिया के लिए समायोजित । इसके अलावा, निरपेक्ष प्रतिक्रिया नहीं मापा जा सकता है, के रूप में हम एक प्राथमिक सेल लाइन या एक vivo में परख का उपयोग नहीं कर रहे हैं; इसके बजाय, ओर्थोगोनल इज़ोटेर्माल अनुमापन calorimetry (आईटीसी) प्रयोगों प्रारंभिक विधि समायोजन के लिए सुझाव दिया जाता है । आईटीसी से जानकारी विकास के तहत एक नए अणु के साथ TNFα संबध स्थापित करने और जैविक विधि में आरंभिक स्थितियों को निर्दिष्ट करने के लिए सहायक है ।

इस विधि के नए अणुओं के परीक्षण के लिए उपयोगी है जब शोधकर्ताओं ने एक बेसल रिश्तेदार प्रतिक्रिया प्राप्त करने के लिए एक संदर्भ पदार्थ है; इस प्रकार, एक जैव के मूल्यांकन बेहतर या एक आणविक सेल संरक्षण से संबंधित प्रतिक्रिया की सिफारिश की है । इसे दूसरे एंटी-TNFα प्रोटीन पर लागू किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, यह Etanercept, Infliximab, Certolizumab, या Golimumab19के सापेक्ष जैविक शक्ति का मूल्यांकन करने के लिए लागू है । तथापि, इन सभी विरोधी TNFα अणुओं cytokine के लिए अलग समानताएं है; इसलिए, उनकी सांद्रता व्यक्तिगत रूप से समायोजित किया जाना चाहिए । इस विधि का एक और लाभ के प्रयोगों की दीक्षा और परिणामों की उपलब्धि के बीच कम समय है, यह आसान लागू करने के लिए और पशु मॉडलों की तुलना में सस्ती है । इसके अलावा, इस विधि एक पूरी तरह से सक्रिय TNFα अणु के साथ मॉब की बातचीत के उपाय, सुझाव है कि मॉब TNFα ट्रिमर को पहचानने और है कि अणु भंडारण या प्रयोगशाला हेरफेर के दौरान संशोधित नहीं किया गया । दूसरी ओर, एक शुद्ध भौतिक परख परिणाम अभी भी संदिग्ध है । उदाहरण के लिए, TNFα और एक मॉब एक पारंपरिक एलिसा का उपयोग कर के बीच बातचीत एक संरचनात्मक cytokine रासायनिक स्थिरीकरण के कारण परिवर्तन से संबंधित विरूपण साक्ष्य हो सकता है; इसलिए, अपनत्व प्रभावित हो सकता है और माप समझौता । इसके अलावा, आईटीसी विश्लेषण के दौरान, कमजोर पड़ने समाधान TNFα या मॉब की संरचना को संशोधित कर सकते हैं, इस प्रकार बाधा TNFα ट्रिमर गठन, मॉब बातचीत, या artifactual epitope पीढ़ी । इस विधि में प्राथमिक कक्ष रेखाओं के उपयोग की मांग की जा सकती है; बहरहाल, TNFα के खिलाफ संरक्षण दिलचस्प परिणाम दे सकते हैं, vivo प्रतिक्रियाओं में नकल उतार ।

हम इस विधि का पालन करने के लिए आसान हो और प्रतिलिपि बनाया । के रूप में luminescence phenol लाल या अंय यूवी विज़ पदार्थों से नकाबपोश नहीं किया जा सकता है, लगभग हर संस्कृति मध्यम additive कोशिकाओं की खेती के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । यह संशोधन cytokine उपचार के बाद व्यवहार्यता के लिए एक पूर्ण जांच प्रतिक्रिया के साथ, सेल लाइनों की मांग के अध्ययन में एड्स शोधकर्ताओं । बेअसर परख को क्रियान्वित करने से पहले न्यूनतम तीन सेल मार्ग और कोशिका घनत्व समायोजन का आयोजन किया जाना चाहिए । इसके अलावा, cytokine और उसकी एकाग्रता स्थिर है, साथ ही वार्मिंग और संस्कृति माध्यम और समाधान में सह2 एकाग्रता equilibrating परख सफलता के लिए महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं । कुल मिलाकर, यह लेख एक में इन विट्रो जैविक परीक्षण का उपयोग कर एक मॉब के साथ TNFα cytokine बेअसर करने के लिए आवश्यक कदम से पता चलता है एक संदर्भ और विकास के तहत एक नमूने की तुलना.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है

Acknowledgments

यह काम विज्ञान और प्रौद्योगिकी के राष्ट्रीय परिषद (CONACYT), मेक्सिको ग्रांट पी CONACYT २०१५ २२०३३३, अध्ययन के डिजाइन में भाग लेने के बिना द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
WEHI 164 ATCC CRL-1751 Fibrosarcoma cells from Mus musculus
RPMI-1640 Medium ATCC 30-2001 Store medium at 2 °C to 8 °C
RPMI 1640 Medium, no phenol red GIBCO 11835-030 Store medium at 2 °C to 8 °C
Trypsin-EDTA(0.25%),phenol red GIBCO 25200-056 Store medium at -10 °C to -20 °C
DPBS, no calcium, no magnesium GIBCO 14190-136 Store medium at 2 °C to 8 °C
Recombinant Human TNF-alpha Protein R&D Systems 210-TA-020 Store at -20 °C to -70 °C
Fetal Bovine Serum (U.S), Super Low IgG HyClone SH3089803 Store at -10 °C to -20 °C
Fetal Bovine Serum (U.S.), Characterized HyClone SH3007103 Store at -10 °C to -20 °C
Caspase-Glo 3/7 Assay kit Promega G8093 Store the Caspase-Glo. 3/7 Substrate and Caspase-Glo. 3/7 Buffer at –20 ºC protected fromLight
EDTA, Disodium Salt, Dihydrate, Crystal, A.C.S. Reagent J.T.Baker 8993-01 --
Sample mAb Adalimumab Probiomed NA Final concentrations in the microplate are:  0.666, 0.333, 0.167, 0.111, 0.083, 0.056, 0.042, 0.028, 0.014 and 0.004 μg/mL
Reference and Control mAb Adalimumab Abbvie NA Final concentrations in the microplate are:  0.666, 0.333, 0.167, 0.111, 0.083, 0.056, 0.042, 0.028, 0.014 and 0.004 μg/mL
Microplate Reader Molecular Devices 89429-536 SpectraMax M3 Multi-Mode
Microplate reader Software  Molecular Devices -- SoftMax Pro 6.3 GxP
Incubator  Revco  30482 Revco RNW3000TABB Forced-Air CO2
Laminar Flow Hood  The Baker Company   200256 Baker SG603A-HE | High Efficiency, Class II Type A2          

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References

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