Abstract
嫌気性細菌に向けられた新薬開発による抗生物質作用の評価は困難で技術的に要求される。可能なMOAについての洞察を得るために、抗生物質曝露に伴う形態学的変化を走査型電子顕微鏡（SEM）を用いて視覚化することができる。 SEMイメージングを伝統的なキル曲線と統合することで、薬物行動への洞察が向上し、医薬品開発プロセスが進歩する可能性があります。この前提を試験するために、既知の異なるMOA（バンコマイシンおよびメトロニダゾール）を有する薬物を用いて、曲線を殺し、SEM研究を行った。 C. difficile細胞（R20291）を抗生物質の存在下または非存在下で48時間まで増殖させた。 48時間間隔で、複数の時点で細胞を収集して、抗生物質の有効性を判定し、SEMで画像化した。以前の報告と一致して、バンコマイシンおよびメトロニダゾールは、コロニー形成単位（CFU）カウンターによって測定して、24時間の処理後に有意な殺菌活性を有したティン。 SEMイメージングを用いて、メトロニダゾールは、対照およびバンコマイシンと比較して、細胞長（各抗生物質について細胞長の> 50％の減少; P <0.05）に有意な効果を有することが判明した。薬物治療に対する表現型応答はこれまでにこのように報告されていないが、イメージングおよび測定の汎用性および信頼性ならびに他の実験化合物に対するこの技術の適用を実証する薬物のMOAと一致する。
Introduction
Clostridium difficileはグラム陽性の胞子形成細菌であり、米国では毎年約50万の感染を引き起こし、最高レベルのリスクである疾病防除センター（CDC）による脅威レベルの緊急の病原体と考えられています。 1過去10年間に、クロストリジウム・ディフィシレ（C.difficile）に対する抗菌剤の開発が著しかった。 インビトロ研究は、薬物開発プロセスの必要な要素です。伝統的に、 インビトロ感受性および時間殺滅試験は、将来の動物および他のインビボ研究を検証するために使用される。
これらの方法は殺傷作用を評価するために重要な役割を果たすが、薬理学的治療に対する細胞の表現型応答を捕捉しない。スタンドで走査型電子顕微鏡（SEM）を組み込むことにより動力学研究を殺すと、抗生物質の直接的効果のより完全な特徴付けが可能である。ここでは、SEMを抗生物質治療の有効性をプロファイルする手段として使用する方法を提示する。
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Protocol
異なる環境または臨床源からC.ディフィシルを単離する
- 環境分離物：0.85％NaClで軽く濡らした滅菌済み綿ゲージを使用して、関心領域（床、ドア、ハンドル、棚など ）の表面を拭きます。 8滅菌手袋を着用し、綿棒を滅菌済みのチューブに入れてください。
- 臨床分離株（便）：接種ループを使用してセフォキシチン - サイクロセリン - フルクトース寒天（CCFA）上に10〜100mgの臨床便検体をプレートし、厳重な嫌気条件下で48〜72時間インキュベートする。さらなる分析のために、 CryovialsにC.difficileストックの分離したコロニーを-80℃で保存する。 7,9,10
- 0.05％タウロコール酸ナトリウムを含むブレインハートインフュージョン（BHI）ブロスの環境スワブサンプルを濃縮し、37℃の嫌気性チャンバーに入れます5日間。 10,000×gで1mLの培養液を遠心分離し、100μLのエタノールにペレットを再懸濁する。
- 再懸濁した細胞（50μL）をシクロセリン・エキシチン・フルクトース寒天（CCFA）プレート上にプレートし、37℃で40〜48時間嫌気性チャンバーでインキュベートする。さらなる分析のために、 CryovialsにC.difficileストックの分離したコロニーを-80℃で保存する。
- ラテックス凝集試薬またはPCRを用いて疑わしいクロストリジウム・ディフィシル（C.difficile）コロニーを試験する。
C.ディフィシルの培養およびキネティクス手順の殺傷
- 37℃で48時間、嫌気性チャンバー内の血液寒天プレート上の精製された環境的または臨床的C.ディフィシレ株を増殖させる。
- 接種ループで1つの単離コロニーをとり、15 mLチューブで5 mL BHI培地に移し、37℃の嫌気性チャンバーで24時間増殖させます。
- 前培養1：100を約10 6コロニー形成単位0.1％タウロコール酸ナトリウムおよび適切な濃度の抗生物質（T0）を補充した新鮮な予備還元BHIS（BHI + 5g / L酵母抽出物および1％L-システイン）中でのs（CFU）/ mL。
- 各時点（T0、T6、T24、T48）でピペットを用いて1mLのサンプルを採取し、少量（100μLを連続希釈したもの）を血液寒天プレート上に撒き散布する。細胞を37℃の嫌気性チャンバー内で48時間血液寒天プレート上で増殖させ、得られたコロニー数をカウントしてCFUを決定する。
走査型電子顕微鏡のための試料の準備
- マイクロ遠心チューブの各時点から1 mLの細胞を集め、10,000 xgで10分間遠心分離します。上清を捨て、PBSで細胞を洗浄する。
- 10,000xgで10分間再度サンプルを遠心分離し、上清を捨てる。 1mLの4％パラホルムアルデヒドで細胞を再希釈し、室温で1時間インキュベートする。
- サンプルを再び1分間10分間遠心分離する。0,000xgで上清を捨てる。細胞を蒸留水で2回洗浄し、100μLの蒸留水で再希釈する。溶液の濁度に応じて容量を調整する。
注：複数の連続希釈を行うことは良い考えです。 - カバースリップにラベルを貼り、40μLのサンプルを加えます。フローフード内で15分間インキュベートして液体を蒸発させ、細胞をカバーグラスに接着させる。液体がまだ残っている場合は、ブロワーを使用して液体を取り除いてください。
- 机上のスパッタリング装置に細胞をラベルしたカバースリップを置き、テープを剥がします。スパッタリング装置に純金を固定します。機械をオンにし、低圧（50mTorr）でスパッタリングを開始する。 80nmで30秒間被覆し、20nmの金コーティングとなる。
- コーティングされた細胞を走査電子顕微鏡に移す。
4.走査電子顕微鏡上のC.ディフィシレ細胞の画像化
- 走査電子顕微鏡（SEM）を適切に通気するコンピュータソフトウェアのベントボタンを押す。
- カーボンテープを使用して、コーティングされたカバーガラスを金属ステージに固定します。 SEMが通気されると、ドアは容易に開くはずです。金属ステージをねじ込むことでSEMチャンバーに固定します。
- コンピュータソフトウェアのPUMPボタンをクリックします。 SEMが "Vac OK"と表示されているときにSEMを使用できます。
- DetectorタブのSE検出器をクリックします。電圧を表示するボタンをクリックしてビームをオンにします。電圧を上げる前に、より低い電圧（5 kV）でイメージングを開始します（最大15 kV）。ビームがオンになった後に画像が表示されます。
- トラッキング機能を使用して、コーティングされたカバースリップの画像を描く領域を見つけます。領域を拡大し、棒状の構造を見つける。これらはクロストリジウム・ディフィシルである。
- システムを較正するために、画像を拡大して焦点を合わせる。これは、複数の作業距離（15,9および5 mm）で行う必要があります。 5mmの作動距離で画像。
- あなたのスイッチを入れて高解像度のイメージングモードを開始し、非点収差の焦点合わせと最適化を開始します。
- 高倍率でピントを合わせ始める。これを行うには、粗くて細かいフォーカストグルを使用します。非点収差も同様に調整して、より鮮明な画像を得る。
- 高倍率で非点収差を調整する。これを行うには、非点収差トグル（微妙な/粗いフォーカストグルに似ています）を調整し、コンピュータソフトウェアをデジタルズームして画像を明瞭に確認します。
- スロースキャン機能を使用して高品質の画像を収集します。収集した画像を解析に使用する.TIFFファイルとして保存します。分析中に測定が行われる場合は、データバーが選択されていることを確認してください。
- 角度を変えて画像を収集する（手動で角度をSEMで直接回転させることで最大52°まで）角度のついた画像はより深い情報を示す傾向があります。
- 撮影されている細胞に応じてビーム電圧を変更します。これは、ほとんどの場合、5〜15 kVの間で行います。 イメージングが完了したら、ビームをオフにし、作動距離を20 mmに上げます。その後、チャンバを通気することができ、ステージを取り外すことができる。さらに分析するために、すべての画像をドライブにコピーします。
5.画像処理と解析
- 自由に利用できるソフトウェアFIJI（http://fiji.sc）をコンピュータにダウンロードしてインストールします。
- FIJIで画像ファイルを開きます。
- ライン機能を使用して、スケールバーを正確にトレースします。
- FIJIプログラムのAnalyzeタブをクリックし、最後にSelect Scaleを選択します。スケールバーに基づいて既知の距離の設定が必要なウィンドウが表示されます。長さの単位も変更し、[OK]をクリックします。
- プログラムが距離に対して校正されたので、ライン関数を使用してセルの長さを測定します。長さを取得するには、line関数を使用して、セル全体をトレースします。 [分析]タブを再度選択し、[測定]をクリックします。長さはappでなければならない以前に示されたユニットの耳。
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Representative Results
クロストリジウム・ディフィシル（Clostridium difficile）は胞子形成細菌であるため、機能的分析の前に栄養細胞と胞子細胞との形態学的相違を決定することが不可欠である。 図1は、増殖曲線および胞子細胞の指数期の間に捕捉された栄養細胞の代表的な画像を示す。図示のように、栄養細胞は長くて滑らかな棒状の構造であるのに対し、胞子は粗い外形を有する小さい楕円形の構造である。機能的には、栄養細胞は急速に増殖および分裂し、毒素を分泌することによりクロストリジウム・ディフィシレ感染の病原性の原因となるが、胞子は通常はほとんど活性がなく休眠する。したがって、抗生物質はほとんどが栄養細胞に対して活性であり、胞子は、DNAでコアを保護するいくつかの層および生理学的活性の欠如のために、薬物治療に通常耐性がある。これらの事実のために、形態学的分析のうちの1つは栄養細胞に焦点を当てている。 11,12
抗生物質殺傷曲線は、増殖中の細菌に対する抗生物質効力を示すための標準的な方法論である。クロストリジウム・ディフィシレ菌株R20291を用いた濃度は、MIC値に基づいており、バンコマイシンについては1μg/ mL、メトロニダゾールについては0.51μg/ mLであった。 図2に示すように、対照細胞は増殖してプラトーに達するが、処理された細胞は全コロニー形成単位（CFU）で検出限界（LOD）まで減少し、殺菌効果を示す。示されているように、バンコマイシン（ 図2A ）およびメトロニダゾール（ 図2B ）は、supraMIC濃度（4xMIC） でC.ディフィシレを殺すのに有効である 。抗生物質の殺傷曲線は類似しているように見えるかもしれませんが、薬はACの異なるメカニズムを持っています（バンコマイシンは細胞壁合成を妨げるが、メトロニダゾールはDNA複製に影響を及ぼす）。したがって、我々は、抗生物質死滅曲線が、これらの抗生物質間の詳細な差異を提供するのに十分な差別的能力を持たないことを提案する。より多くの差別を提供するために顕微鏡検査を使用しました。
その微視的なサイズのため、 C.ディフィシルは高倍率なしでは像形成することができない。これは、細胞に直接抗生物質治療の詳細な影響を評価するために、ナノメートルスケールで解像度を得ることができるイメージング法である走査型電子顕微鏡（SEM）の使用の機会を提供している。このアプローチの有用性を実証するために、形態学がどのように変化したかを決定するために薬物処理の前後に細胞を画像化した（ 図3A ）。示されているように、バンコマイシンの場合のように、細胞の壁のいくつかが影響を受け、細胞のいくつかはサイズがより小さく、メトロニダゾールの場合と同様に。細胞サイズが影響を受けているかどうかを試験するために、我々はプログラムFIJIを用いて細胞長を分析した。植物細胞の大きさは対照の場合にはいくらか変化することがあるが、大部分は長さが約6μmである（ 図3B ）。対照および処置設定からの多くの細胞を考慮すると、細胞長がメトロニダゾールにおいて優先的に影響を受けるが、バンコマイシン処置の影響を受けないことがすぐに分かる（ 図3C ）。
図1： 走査型電子顕微鏡による細胞型の区別。示されているのは、 クロストリジウム・ディフィシレ植物および胞子細胞の代表的な画像である。植物細胞は、長くて鞭打った棒構造です。対照的に、胞子細胞は小さく、粗くて凹凸のあるコートを有する。芽胞は画像purpoのための偽色の赤です唯一のものです。画像上にスケールバーが表示されます。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図2： 抗生物質タイムキル曲線。バンコマイシン（A） 、メトロニダゾール（B）の 4種類の抗生物質についてSupraMIC殺傷曲線を実施した。これらの抗生物質はC.ディフィシル株R20291に対して有意な死滅作用を有し、コロニー形成単位（CFU）を計数するための検出限界（LOD）に近づいた。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図3：抗生物質治療の薬理学的効果を調べる。処理細胞および非処理細胞の画像は、死滅動力学試験（A）を通して複数の時点で採取した。示されるのは、長さ（B）について測定された対照栄養細胞の代表的な例である。処理細胞および非処理細胞を測定し、比較した（C） 。実験は、少なくとも重複して実施され、> 17個の細胞がグループごとに測定された。 *対照およびバンコマイシン処置群と比較してP <0.05。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
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Discussion
現在の研究の目的は、C.difficileを単離し、抗生物質の薬理学的作用のより完全な特徴付けのための手段として走査型電子顕微鏡（SEM）を用いて抗生物質感受性を試験するためのハイスループット法を作製することであった。本明細書で概説したプロトコールを用いて、抗生物質治療に対する細胞の表現型応答を画像化することにより、薬物の薬理学的作用についての洞察を明らかにすることができた。合計で、このプロトコールのイメージング部分は、細胞を収集した後、約2時間の時間を要するが、典型的な殺傷動力学研究単独よりもはるかに差別的であり得る。 SEMを使用することを学ぶことは技術的に要求されることがありますが、サンプルの準備は比較的簡単で高速です。我々は、ここに概説されたこれらのプロトコルが、抗生物質治療の薬理学的作用を評価する客観的アプローチを提供すると考えている。
tの類似点を考慮して抗生物質殺傷曲線（ 図2 ）では、細胞の薬理学的治療に対する応答に違いがあるかどうかを調べようとした。 SEMを用いて、本発明者らは、メトロニダゾールが薬剤のsupraMIC濃度で細胞長に影響を及ぼすことを確認した。これらの表現型はこれまでに報告されていないが、抗生物質の作用機序と一致しており、細胞代謝および増殖に及ぼす影響を示唆している。対照的に、バンコマイシンは細胞壁に有意な作用を及ぼし、その作用機序とも一致していた。これらの抗生物質の間の死滅動態の間に類似点があるが、SEM画像から明らかな表現型の違いがあることは明らかである。抗生物質表現型ライブラリーを作製することにより、リジニルゾールの場合のように、明確な作用機序を示さない可能性がある薬物のより完全な特徴付けが可能になる。
ベアウスこの方法は技術的に困難であり、一貫した細胞調製および金コーティングのスパッタリングの変更を含む科学的問題に取り組むために改造を行う必要があります。コーティングが多すぎると、細胞の外部への影響をぼかすことがありますが、十分なコーティングがビームの帯電を招き、画像を歪める可能性があります。これを避けるには、スパッタリング時間を最適化するために金コーティングの量を変えてサンプルを準備します。最後に、研究間の一貫した方法論により、実験間の比較が可能になる。
SEMを使用する限界は、細胞形態の変化を観察することに限定されていることである。したがって、疑わしい応答を確認するために機能的研究が必要である。このため、我々はこのイメージングプロトコルが機能的研究を導く手段として使用できると考えている。この制限にもかかわらず、免疫金標識はSEMを使用してタンパク質輸送または凝集の疑わしい変化を確認することができます。しかし、我々はまだこれらの実験を行っていない。
クロストリジウム・ディフィシレ（C.difficile）治療のための新しい抗生物質のパイプラインが有効であるため、薬物作用のより完全な評価が必要である。ここに示すように、SEMは薬理作用を特徴づける独特の、高いスループットで、信頼できる機会を提供します。クロストリジウム・ディフィシレの異なる菌株間で多くの異なる抗生物質効果を画像化することにより、いくつかの抗生物質が027 / NAP1 / BI流行株のような特定の病原性菌株に対して他のものより効果的である理由を理解することができる。さらに、SEM分析は、リボタイプまたは株間の抗生物質効果を識別するのに有用であり、広範な適用性を示す他の細菌種を研究するために使用することができる。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cotton gauze | Caring | PRM21408C | |
| NaCl | Macron | 7532 | |
| 50 mL tubes | Falcon | 352098 | |
| Brain Heart Infusion (BHI) | Criterion | C5141 | |
| L-cysteine | Alfa Aesar | A10389 | |
| yeast extract | Criterion | C741 | |
| sodium taurocholate | Alfa Aesar | A18346 | |
| anaerobic chamber | Coy | vinyl anaerobic chamber | |
| cycloserinecefoxitin fructose agar (CCFA) plates | Anaerobe systems | AS-213 | |
| blood agar plates | Hardy diagnostics | A-10 | |
| latex agglutination reagent | Oxoid | DR1107A | C. diff test kit |
| microcentrifuge tubes | Eppendorf | 222363204 | |
| PBS | Gibco | 10010-031 | |
| 4% paraformaldehyde | Fisher Scientific | 50-259-98 | |
| microscope slides | J. Melvin freed brand | 7525M | 75 x 25mm |
| flow hood | Labconco | Class II type A2 | biosafety cabinet |
| desk sputtering machine | Denton Vacuum | Desk II | |
| tape | Plastic Core | 05072-AB | SPI Double Sided Adhesive Carbon Tape |
| gold | Denton Vacuum | TAR001-0158 | 2.375” Diameter x .002” Thick Gold foil |
| scanning electron microscope | FEI | XL-30 |
References
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