Ein Protokoll zur Charakterisierung der morphologischen Veränderungen von

Das übergeordnete Ziel dieser mikrobiologischen Bildgebungsmethode besteht darin, eine aussagekräftigere Möglichkeit zur Unterscheidung der phänotypischen Wirkungen pharmakologischer Behandlungen bereitzustellen. Diese Methode kann daher im Bereich der Infektionskrankheiten von großem Nutzen sein, insbesondere bei der Untersuchung der morphologischen Effekte bestimmter Antibiotika und der Art und Weise, wie diese *C. difficile* abtöten.

Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie hochauflösende Bildgebung mit In-vitro-ZellkulturmMethoden kombiniert, um einen detaillierten Einblick in die pharmazeutische abtötende Wirkung zu erhalten. Die Anwendung dieser Technik könnte sich auf die Therapie der Clostridium-difficile-Infektion, kurz CDI, auswirken. Der Grund hierfür ist, dass diese Technik eine Möglichkeit bieten könnte, herauszufinden, wie ein Antibiotikum bei der Behandlung der CDI von Nutzen sein kann.

Obwohl diese Methode Einblicke in die pharmakologische Wirkung ermöglichen kann, lässt sie sich auch auf andere Systeme anwenden, beispielsweise auf Modelle mit Mischkulturen oder tierexperimentelle In-vivo-Studien. Im Allgemeinen bereitet die neue Methode Schwierigkeiten, da das Kultivieren von C. difficile und die Bedienung eines Rasterelektronenmikroskops anspruchsvoll sind. Die Idee zu dieser Methode entstand erstmals, als wir versuchten, zwischen den Wirkmechanismen verschiedener Antibiotika zu unterscheiden.

Ich möchte Ihnen das Forschungsteam vorstellen, dem Sie heute begegnen werden. Jahangir Alam ist Professor und Mikrobiologe. Er koordiniert alle Laboraktivitäten, die Sie heute sehen werden.

Tasnuva Rashid ist eine Doktorandin im Labor. Sie übernimmt einen großen Teil der täglichen mikrobiologischen Arbeiten. Eugenie Bassere ist eine Postdoktorandin.

Sie hat Tasnuva tatsächlich viele der Fähigkeiten beigebracht und hilft zudem im Labor. Brad Endres ist ein weiterer Postdoktorand im Labor. Er wird viel Mikroskopie mit Hilfe von Long Chang durchführen.

Um Umweltproben unter Einhaltung steriler Handschuhe vorzubereiten, verwenden Sie einen vosterilisierten Wattebausch, um die Oberfläche eines beliebigen interessierenden Bereichs, wie beispielsweise eines Bodens, einer Tür, einer Klinke oder eines Regals, abzustreichen. Anschließend geben Sie den Abstrich in ein sterilisiertes Röhrchen. Wechseln Sie zwischen den Proben die Handschuhe.

Zur Vorbereitung klinischer Isolate 10 bis 100 Milligramm klinischer Stuhlproben mit einem Inokulationshaken auf Cefoxitin-Cycloserin-Fructose-Agar, kurz CCFA, ausstreichen und die Proben 48 bis 72 Stunden unter streng anaeroben Bedingungen inkubieren. Die isolierten Kolonien der C. Difficile-Stammsammlung zur weiteren Analyse in Kryoröhrchen bei minus 80 Grad Celsius lagern. Umweltabstrichproben in Brain-Heart-Infusion, kurz BHI-Brühe, mit 0,5 % Natriumtaurocholat anreichern und die Proben fünf Tage lang bei 37 Grad Celsius in einer anaeroben Kammer inkubieren.

Zentrifugieren Sie ein Milliliter der Kultur bei 10.000 × g und verwenden Sie 100 Mikroliter Ethanol, um das Pellet erneut aufzuschwemmen. Impfen Sie 50 Mikroliter der resuspendierten Zellen auf CCFA-Platten aus und inkubieren Sie die Kulturen in einer anaeroben Kammer bei 37 Grad Celsius für 40 bis 48 Stunden. Lagern Sie die isolierten Kolonien von C. difficile-Stämmen in Kryoröhrchen bei minus 80 Grad Celsius für weitere Analysen.

Verwenden Sie das Latex-Agglutinationsreagenz oder die PCR, um die verdächtigen C.difficile-Kolonien zu testen. Züchten Sie gereinigte Umwelt- oder klinische C.difficile-Stämme auf Blutagarplatten in einer anaeroben Kammer bei 37 Grad Celsius für 48 Stunden. Nehmen Sie mit einem Inokulationshaken eine isolierte Kolonie und überführen Sie sie in fünf Milliliter BHI-Medium in einem 15-Milliliter-Röhrchen.

Anschließend die Kultur in einer anaeroben Kammer bei 37 Grad Celsius für 24 Stunden inkubieren. Unter Verwendung von frischem, vorher reduziertem BHIS, das mit Natriumtaurocholat und der geeigneten Konzentration eines Antibiotikums ergänzt wurde, die Vorkulturen im Verhältnis 1 zu 100 auf etwa 10 hoch sechs KBE pro Milliliter verdünnen. Mit einer Pipette zu jedem Zeitpunkt eine Probe von einem Milliliter entnehmen und einen kleinen Aliquot auf eine Blutagarplatte auftragen oder verteilen.

Die Platte 48 Stunden lang in einer anaeroben Kammer bei 37 Grad Celsius inkubieren und die Anzahl der entstandenen Kolonien zählen, um die KBE zu bestimmen. Ein Milliliter Zellen von jedem Zeitpunkt in Mikrozentrifugenröhrchen sammeln und 10 Minuten bei 10.000 × g zentrifugieren. Den Überstand verwerfen und die Zellen mit PBS waschen.

Zentrifugieren Sie die Proben erneut und entfernen Sie den Überstand. Verdünnen Sie die Zellen anschließend mit einem Milliliter 4 % Paraformaldehyd und inkubieren Sie die Röhrchen eine Stunde lang bei Raumtemperatur. Nach erneutem Zentrifugieren und Entfernen des Überstands waschen Sie die Zellen zweimal mit destilliertem Wasser, bevor Sie sie in 100 Mikroliter destilliertem Wasser erneut resuspendieren.

Passen Sie das Volumen je nach der Trübung der Lösung an. Nach dem Beschriften der Deckgläser pipettieren Sie 40 Mikroliter der Probe darauf. Inkubieren Sie die Deckgläser unter einem Flussgehäuse 15 Minuten lang, um die Flüssigkeit verdunsten zu lassen und die Zellen an das Glas haften zu lassen.

Falls noch Flüssigkeit vorhanden ist, entfernen Sie diese mit einem Gebläse. Legen Sie die Deckgläser in eine Tisch-Sputteranlage und befestigen Sie sie mit Klebeband. Befestigen Sie reines Gold in der Sputteranlage.

Schalten Sie dann das Gerät ein und beginnen Sie das Sputtern bei niedrigem Druck. Beschichten Sie die Zellen 30 Sekunden lang bei 80 Mikroampere, was einer Goldbeschichtung von 20 Nanometern entspricht. Um die Bildaufnahme zu starten, entlüften Sie das REM zunächst ordnungsgemäß in der Computersoftware, indem Sie die Schaltfläche Vent betätigen.

Nachdem die Zellen beschichtet wurden, überführen Sie sie in das Rasterelektronenmikroskop (REM). Befestigen Sie mit Hilfe des Kohleklebebands die beschichteten Deckgläser auf der Metallstufe. Sobald das REM entlüftet ist, sollte sich die Tür leicht öffnen lassen.

Verriegeln Sie die Metallstufe, indem Sie sie in die SEM-Kammer einschrauben. Klicken Sie anschließend im Softwaremenü auf die Taste „Pump“. Wenn das System „okay“ zurückmeldet, ist das REM betriebsbereit.

Unter der Registerkarte „Detector“ klicken Sie auf den SE-Detektor. Schalten Sie den Strahl ein, indem Sie auf die Schaltfläche klicken, die die Spannung anzeigt. Beginnen Sie mit der Aufnahme bei einer niedrigeren Spannung, bevor Sie die Spannung erhöhen.

Ein Bild erscheint, nachdem der Strahl eingeschaltet wurde. Suchen Sie mithilfe der Tracking-Funktion einen Bereich auf den beschichteten Deckgläsern, der abgebildet werden soll. Zoomen Sie in den Bereich hinein und suchen Sie stabförmige Strukturen, die Clostridium difficile darstellen.

Um das System zu kalibrieren, zoomen Sie heran, fokussieren Sie das Bild grob und verknüpfen Sie Z mit dem freien Arbeitsabstand. Dies sollte bei mehreren Arbeitsabständen durchgeführt werden, beispielsweise bei 15, 9 und 5 Millimetern. Danach wechseln Sie in den Ultrahochauflösungs-Bildmodus.

Verwenden Sie die Grob- und Feinfokus-Regler, um bei hoher Vergrößerung zu fokussieren. Stellen Sie die Astigmatismus-Regler für ein schärferes Bild ein und überprüfen Sie die Bildklarheit, indem Sie mit der Computer-Software digital in das Bild hineinzoomen. Nutzen Sie den Langsamscan, um ein Bild von hoher Qualität aufzunehmen.

Speichern Sie das aufgenommene Bild als TIFF-Datei für die spätere Analyse und stellen Sie sicher, dass die Datenleiste ausgewählt ist, falls während der Analyse Messungen durchgeführt werden. Nehmen Sie Bilder aus verschiedenen Winkeln auf, um durch Kippen des Stages im REM mehr Tiefeninformationen zu erhalten. Optimieren Sie Fokus und Astigmatismus, bevor Sie ein Bild mit langsamer Abtastung aufnehmen.

Nach Abschluss der Bildaufnahme schalten Sie den Strahl aus und erhöhen den Arbeitsabstand auf 20 Millimeter. Danach entlüften Sie die Kammer und entfernen den Probentisch. Bearbeiten Sie die Bilder und öffnen Sie die Bilddateien in Fiji.

Verwenden Sie die Linienfunktion, um die Maßstabsleiste präzise nachzuzeichnen. Klicken Sie auf den Reiter Analysieren und wählen Sie dann die Funktion Skala festlegen. Ein Fenster erscheint, in dem die bekannte Distanz basierend auf der Maßstabsleiste eingestellt werden muss.

Ändern Sie auch die Längeneinheit und klicken Sie auf „Okay“. Um schließlich die Zelllänge zu messen, verwenden Sie die Linienfunktion, um die Zelle vollständig nachzuzeichnen. Wählen Sie erneut den Reiter „Analysieren“ und klicken Sie dann auf „Messen“.

Die Länge sollte in den zuvor angegebenen Einheiten angezeigt werden. Diese Bilder zeigen C.difficile-Vegetativzellen, die während der exponentiellen Phase der Wachstumskurve aufgenommen wurden, sowie Sporenzellen. Vegetativzellen sind lange, glatte, stabförmige Strukturen; Sporen hingegen sind kleine, ovale Strukturen mit einer rauen Oberfläche.

Wie in dieser Abbildung gezeigt, wachsen die Kontrollzellen und erreichen eine Plateauphase; hingegen nimmt die Gesamtanzahl an KBE bei den mit den Antibiotika Vancomycin und Metronidazol behandelten Zellen bis an die Nachweisgrenze ab, was auf eine bakterizide Wirkung hinweist. Wie gezeigt, wirken Vancomycin und Metronidazol effektiv abtötend auf C.difficile bei Konzentrationen oberhalb der MIC. Um die Eignung der REM-Bildgebung von C.difficile zu zeigen, wurden Zellen vor und nach der Behandlung mit dem Wirkstoff abgebildet, um morphologische Veränderungen zu bestimmen.

Im Fall von Vancomycin waren einige der Zellwände betroffen, und einige mit Metronidazol behandelte Zellen waren kleiner. Um zu testen, ob die Zellgröße beeinflusst wurde, wurde die Zelllänge mit dem Programm Fiji analysiert. Wie in diesem Bild gezeigt, kann die Größe vegetativer Zellen im Kontrollfall etwas variieren; die meisten haben jedoch eine Länge von etwa 6 Mikrometern.

Jedoch wie in diesem Diagramm gezeigt, wurde die Zelllänge in Metronidazol-behandelten Zellen beeinflusst, nicht jedoch in Vancomycin-behandelten Zellen. Sobald die Methode beherrscht ist, kann sie in weniger als zwei Tagen durchgeführt werden. Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass Ihre Probe vor der Beschichtung und der Bildaufnahme fest fixiert und vollständig trocken ist.

Mit dieser Methode können wir weitere Verfahren durchführen, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise wie Bakterien auf Antibiotikabehandlungen reagieren; dies kann uns weitere Einblicke in das Verständnis der Wirkmechanismen von Antibiotika verschaffen. Diese Technik hat ein immenses Potenzial und könnte für Forschende auf dem Gebiet der Mikrobiologie den Weg ebnen, die Physiologie und Pharmakologie von Clostridium difficile weiter zu erforschen. Ich hoffe, Ihnen hat das Anschauen dieses Videos heute gefallen.

Ich hoffe, Sie haben gelernt, wie man C.difficile-Zellen kultiviert und charakterisiert, wie man die Abtötungskinetik von Antibiotika gegen C.difficile untersucht und anschließend die mit diesen Abtötungsmustern verbundenen morphologischen Veränderungen mithilfe hochauflösender Mikroskopie bewertet. Da wir mit Clostridium difficile arbeiten, müssen wir besondere Vorsichtsmaßnahmen ergreifen und sämtliche Schutzvorkehrungen treffen