Ein Protokoll zur Charakterisierung der morphologischen Veränderungen von Clostridium difficile In Antwort auf Antibiotika-Behandlung

Das übergeordnete Ziel dieses mikrobiologischen Bildgebungsverfahrens ist es, ein aussagekräftigeres Mittel zur Unterscheidung der phänotypischen Wirkungen der pharmakologischen Behandlung bereitzustellen. Diese Methode kann also im Bereich der Infektionskrankheiten wirklich helfen. Speziell geht es um die morphologischen Wirkungen bestimmter Antibiotika und darum, wie sie C.Difficile abtöten.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie hochauflösende Bildgebung mit In-vitro-Zellkulturtechniken kombiniert, um einen detaillierten Überblick über die pharmazeutische Abtötungswirkung zu erhalten. Die Implikation dieser Technik kann sich auf die Therapie der Clostridium-difficile-Infektion, kurz CDI, erstrecken. Der Grund dafür ist, dass diese Technik ein Mittel sein kann, um zu identifizieren, wie ein Antibiotikum bei der Behandlung von CDI nützlich sein kann.

Obwohl diese Methode einen Einblick in die pharmakologische Wirkung geben kann, kann sie auch auf andere Systeme angewendet werden, wie z. B. Mischkulturmodelle oder In-vivo-Tierstudien. Im Allgemeinen haben Einzelpersonen Schwierigkeiten mit dieser neuen Methode, da die Kultivierung von C.difficile und die Bedienung eines Rasterelektronenmikroskops eine Herausforderung darstellt. Die Idee zu dieser Methode hatten wir erstmals, als wir versuchten, zwischen verschiedenen Wirkungsweisen von Antibiotika zu unterscheiden.

Ich möchte Ihnen das Forschungsteam vorstellen, das Sie heute treffen werden. Jahangir Alam ist Professor und Mikrobiologe. Er koordiniert alle Laboraktivitäten, die Sie heute sehen werden.

Tasnuva Rashid ist Doktorandin im Labor. Sie kümmert sich viel um die tägliche Mikrobiologie. Eugenie Bassere ist Postdoc-Stipendiatin.

Sie hat Tasnuva wirklich viele der Fähigkeiten beigebracht und hilft auch im Labor. Brad Endres ist ein weiterer Postdoc im Labor. Er wird mit Hilfe von Long Chang viel Mikroskopie machen.

Um Umgebungsisolate mit sterilen Handschuhen vorzubereiten, verwenden Sie eine vorsterilisierte Wattegaze, um die Oberfläche eines beliebigen Bereichs von Interesse abzutupfen, z. B. eines Bodens, einer Tür, eines Griffs oder eines Regals. Legen Sie dann den Tupfer in ein sterilisiertes Röhrchen. Wechseln Sie die Handschuhe zwischen den Proben.

Zur Vorbereitung klinischer Isolate verwenden Sie eine Impfschlaufe, um 10 bis 100 Milligramm klinischer Stuhlproben auf Cefoxitin-Cycloserin-Fructose-Agar (CCFA) aufzutragen, und intubieren Sie die Proben unter strengen anaeroben Bedingungen für 48 bis 72 Stunden. Lagern Sie isolierte Kolonien des C.Difficile-Bestands in Kryo-Fläschchen bei minus 80 Grad Celsius für weitere Analysen. Reichern Sie die Umgebungsabstrichproben in einer Gehirn-Herz-Infusion oder BHI-Brühe mit 05 % Natriumtaurocholat an und legen Sie die Proben fünf Tage lang in eine anaerobe Kammer bei 37 Grad Celsius.

Zentrifugieren Sie einen Milliliter der Kultur bei 10.000 G und verwenden Sie 100 Mikroliter Ethanol, um das Pellet wieder zu suspendieren. Platten 50 Mikroliter der resuspendierten Zellen auf CCFA-Platten und inkubieren Sie die Kulturen in einer anaeroben Kammer bei 37 Grad Celsius für 40 bis 48 Stunden. Lagern Sie die isolierten Kolonien von C.difficile-Bestand in Kryo-Fläschchen bei minus 80 Grad Celsius für weitere Analysen.

Verwenden Sie das Latex-Agglutinationsreagenz (PCR), um die vermuteten C.difficile-Kolonien zu testen. Züchten Sie gereinigte umweltbedingte oder klinische C.difficile-Stämme auf Blutagarplatten in einer anaeroben Kammer bei 37 Grad Celsius für 48 Stunden. Verwenden Sie eine Impfschlaufe, um eine isolierte Kolonie zu entnehmen und sie in einem 15-Liter-Röhrchen in fünf Milliliter BHI-Medium zu überführen.

Dann züchten Sie die Kultur in einer anaeroben Kammer bei 37 Grad Celsius für 24 Stunden. Unter Verwendung von frischem, vorreduziertem BHIS, das mit Natriumtaurocholat und der entsprechenden Konzentration des Antibiotikums ergänzt wird, werden die Vorkulturen von 1 bis 100 bis etwa 10 bis sechs KBE pro Milliliter verdünnt. Entnehmen Sie mit einer Pipette zu jedem Zeitpunkt eine Probe von einem Milliliter und plädieren Sie sie oder verteilen Sie ein kleines Aliquot auf eine Blutagarplatte.

Inkubieren Sie die Platte 48 Stunden lang in einer anaeroben Kammer bei 37 Grad Celsius und zählen Sie die resultierende Anzahl der Kolonien, um die KBE zu bestimmen. Sammeln Sie einen Milliliter Zellen von jedem Zeitpunkt in Mikrozentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie 10 Minuten lang bei 10.000 mal G. Entsorgen Sie den Überstand und verwenden Sie PBS, um die Zellen zu waschen.

Schleudern Sie die Proben erneut und verwerfen Sie den Überstand. Verwenden Sie dann einen Milliliter 4%-Paraformaldehyd, um die Zellen erneut zu verdünnen, und inkubieren Sie die Röhrchen eine Stunde lang bei Raumtemperatur. Nachdem Sie die Proben erneut geschleudert und den Überstand verworfen haben, waschen Sie die Zellen zweimal mit destilliertem Wasser, bevor Sie die Zellen erneut in 100 Mikrolitern destilliertem Wasser verdünnen.

Passen Sie das Volumen je nach Trübung der Lösung an. Nach dem Beschriften der Deckgläser werden 40 Mikroliter der Probe darauf gegeben. Inkubieren Sie die Deckgläser unter einer Strömungshaube 15 Minuten lang, um die Flüssigkeit zu verdampfen und die Zellen am Glas haften zu lassen.

Wenn noch Flüssigkeit vorhanden ist, verwenden Sie ein Gebläse, um sie zu entfernen. Legen Sie die Deckgläser in eine Schreibtisch-Sputtermaschine und kleben Sie sie fest. Sichern Sie sich reines Gold in der Sputtermaschine.

Schalten Sie dann die Maschine ein und beginnen Sie mit dem Sputtern bei niedrigem Druck. Beschichten Sie die Zellen 30 Sekunden lang mit 80 Mikroampere, was einer Goldbeschichtung von 20 Nanometern entspricht. Um die Bildgebung zu starten, entlüften Sie das REM zunächst ordnungsgemäß in der Computersoftware, indem Sie die Entlüftungstaste drücken.

Nachdem Sie die Zellen beschichtet haben, übertragen Sie sie auf das Rasterelektronenmikroskop (REM). Befestigen Sie die beschichteten Deckgläser mit dem Kohleband auf dem Metalltisch. Sobald das SEM entlüftet ist, sollte sich die Tür leicht öffnen lassen.

Verriegeln Sie den Metalltisch mit dem Einschrauben in die REM-Kammer. Klicken Sie anschließend in der Software auf die Schaltfläche Pumpen. Wenn das System in Ordnung ist, ist das SEM einsatzbereit.

Klicken Sie auf der Registerkarte Detektor auf den SE-Detektor. Schalten Sie den Strahl ein, indem Sie auf die Schaltfläche klicken, die die Spannung anzeigt. Beginnen Sie die Bildgebung mit einer niedrigeren Spannung, bevor Sie die Spannung erhöhen.

Nach dem Einschalten des Strahls wird ein Bild angezeigt. Suchen Sie mit der Tracking-Funktion einen Bereich auf den beschichteten Deckgläsern, der abgebildet werden soll. Zoomen Sie in die Region hinein und finden Sie stäbchenförmige Strukturen, die Clostridium difficile darstellen.

Um das System zu kalibrieren, zoomen Sie hinein, fokussieren Sie das Bild grob und verknüpfen Sie Z mit dem freien Arbeitsabstand. Dies sollte in mehreren Arbeitsabständen erfolgen, z. B. bei 15, 9 und 5 Millimetern. Wechseln Sie dann in den Bildgebungsmodus mit ultrahoher Auflösung.

Verwenden Sie die Schalter für die Grob- und Feinschärfe, um mit hoher Vergrößerung zu fokussieren. Passen Sie die Astigmatismus-Umschalter an, um ein klareres Bild zu erhalten, und überprüfen Sie das Bild auf Klarheit, indem Sie die Computersoftware verwenden, um das Bild digital zu vergrößern. Verwenden Sie den langsamen Scan, um ein Bild in hoher Qualität zu erfassen.

Speichern Sie das erfasste Bild als TIFF-Datei für die spätere Analyse, und stellen Sie sicher, dass der Datenbalken ausgewählt ist, wenn während der Analyse Messungen durchgeführt werden. Sammeln Sie Bilder aus verschiedenen Winkeln, um mehr Tiefeninformationen anzuzeigen, indem Sie den Tisch auf dem REM neigen. Optimieren Sie Fokus und Astigmatismus, bevor Sie ein Bild mit langsamer Abtastung aufnehmen.

Schalten Sie nach Abschluss der Bildgebung den Strahl aus und erhöhen Sie den Arbeitsabstand auf 20 Millimeter. Entlüften Sie dann die Kammer und entfernen Sie den Tisch. Verarbeiten Sie die Bilder, öffnen Sie die Bilddateien in Fidschi.

Zeichnen Sie mit der Linienfunktion die Maßstabsleiste genau nach. Klicken Sie auf die Registerkarte Analysieren; und wählen Sie dann die Funktion "Skalierung auswählen". Es wird ein Fenster angezeigt, in dem die bekannte Entfernung basierend auf der Maßstabsleiste eingestellt werden muss.

Ändern Sie auch die Längeneinheit und klicken Sie auf OK. Um schließlich die Zellenlänge zu messen, verwenden Sie die Linienfunktion, um die Zelle in ihrer Gesamtheit zu verfolgen. Wählen Sie erneut die Registerkarte Analysieren und klicken Sie dann auf Messen.

Die Länge sollte in den zuvor angegebenen Einheiten angezeigt werden. Diese Bilder zeigen vegetative Zellen von C.difficile, die während der exponentiellen Phase der Wachstumskurve gefangen wurden, sowie Sporenzellen. Vegetative Zellen sind lange, glatte, stäbchenförmige Strukturen; Während Sporen kleine ovale Strukturen sind, die eine raue Außenseite haben.

Wie in dieser Abbildung gezeigt, wachsen die Kontrollzellen und erreichen ein Plateau; Während die mit den Antibiotika Vancomycin und Metronidazol behandelten Zellen die Gesamt-KBE bis zur Nachweisgrenze absenken, was auf eine bakterizide Wirkung hinweist. Wie gezeigt, sind Vancomycin und Metronidazol wirksam bei der Abtötung von C.difficile bei Super-MHK-Konzentrationen. Um den Nutzen der Verwendung von REM für die Bildgebung von C.difficile zu demonstrieren, wurden Zellen vor und nach der medikamentösen Behandlung abgebildet, um festzustellen, wie sich die Morphologie veränderte.

Im Fall von Vancomycin waren einige der Zellwände betroffen und einige mit Metronidazol behandelte Zellen waren kleiner. Um zu testen, ob die Zellgröße beeinflusst wurde, wurde die Zelllänge mit dem Programm Fiji analysiert. Wie in diesem Bild gezeigt, kann die vegetative Zellgröße im Kontrollfall etwas variieren; Die meisten sind aber etwa 6 Mikrometer lang.

Wie in dieser Grafik gezeigt, wurde die Zelllänge jedoch in mit Metronidazol behandelten Zellen beeinflusst, nicht jedoch in Vancomycin-behandelten Zellen. Einmal gemeistert, kann diese Technik in weniger als zwei Tagen durchgeführt werden. Wenn Sie dieses Verfahren ausprobieren, ist es wichtig, daran zu denken, dass Ihre Probe fixiert und vollständig trocken ist, bevor Sie sie beschichtet und abbildet.

Nach diesem Verfahren können wir zusätzliche Methoden durchführen, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. wie Bakterien auf Antibiotikabehandlungen reagieren; Und das kann uns zum Beispiel einen besseren Einblick in das Verständnis der Wirkungsmechanismen von Antibiotika geben. Diese Technik hat ein immenses Potenzial und könnte Forschern auf dem Gebiet der Mikrobiologie den Weg ebnen, die Physiologie und Pharmakologie von Clostridium difficile weiter zu erforschen. Ich hoffe, es hat Ihnen gefallen, dieses Video heute anzusehen.

Ich hoffe, was Sie daraus gelernt haben, ist, wie man C.difficile-Zellen züchtet und charakterisiert, wie man die Abtötungskinetik von Antibiotika gegen C.Difficile betrachtet und wie man dann die morphologischen Veränderungen, die mit diesen Tötungsmustern verbunden sind, mit Hilfe von High-Level-Mikroskopie bewertet. Während wir mit Clostridium difficile arbeiten, müssen wir zusätzliche Vorsichtsmaßnahmen treffen und alle Schutzmaßnahmen