Name: Ein Protokoll zur Charakterisierung der morphologischen Veränderungen von Clostridium difficile In Antwort auf Antibiotika-Behandlung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 58 s
Description: Lernen Sie eine mikrobiologische Bildgebungsmethode zur Untersuchung morphologischer Veränderungen von Clostridium difficile unter Antibiotikabehandlung. Diese Technik kombiniert hochauflösende Rasterelektronenmikroskopie mit in vitro-Zellkulturverfahren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Diese Experimente wurden durch Forschungszuschüsse von Merck and Co. und Summit, PLC unterstützt.

1. Trennung von C. difficile aus verschiedenen Umwelt- oder klinischen Quellen <ol><li> Umgebungsisolate: Mit einer vorsterilisierten Baumwolllehre (leicht benetzt mit 0,85% NaCl), die Oberfläche eines beliebigen Bereichs (Boden, Tür, Griff, Regal usw. ) abtupfen. 8 Achten Sie darauf, sterile Handschuhe zu tragen und legen Sie den Tupfer in ein sterilisiertes Rohr nach abgeschlossen. </li><li> Klinische Isolate (Stuhl): 10 bis 100 mg klinische Stuhlproben auf Cefoxitin-Cycloserin-Fructose-Agar (CCFA) unter Verwendung einer Impfschleife plattieren und unter strengen anaeroben Bedingungen für 48 - 72 h inkubieren. Lagern Sie isolierte Kolonien von C. difficile Lager in Kryovials bei -80 ° C für weitere Analysen. 7 , 9 , 10 </li><li> Anreichern Sie die Umwelt-Tupferproben in Hirnherz-Infusion (BHI) -brühe mit 0,05% Natriumtaurocholat und legen Sie sie in eine anaerobe Kammer bei 37 ° CFür 5 Tage. 1 ml der Kultur bei 10.000 xg zentrifugieren und das Pellet in 100 ul Ethanol resuspendieren. </li><li> Die resuspendierten Zellen (50 &amp; mgr; l) auf Cycloserinecefoxitin-Fructose-Agar (CCFA) -Platten pipettieren und in einer anaeroben Kammer bei 37 ° C für 40-48 h inkubieren. Lagern Sie isolierte Kolonien von C. difficile Lager in Kryovials bei -80 ° C für weitere Analysen. </li><li> Testen Sie vermutete C. difficile Kolonien unter Verwendung des Latexagglutinationsreagenzes oder der PCR. </li></ol> 2. Kultivierung C. difficile und Killing Kinetic Procedures <ol><li> Wachsen Sie gereinigte umwelt- oder klinische C. difficile- Stämme auf Blut-Agar-Platten in einer anaeroben Kammer bei 37 ° C für 48 h. </li><li> Nehmen Sie eine isolierte Kolonie mit einer Impfschleife, überführen sie in 5 ml BHI-Medium in einem 15-ml-Röhrchen und wachsen für 24 h in einer anaeroben Kammer bei 37 ° C. </li><li> Verdünnen Sie die Vorkulturen 1: 100 bis ca. 10 6 Kolonie bildende EinheitS (CFU) / ml in frischem, vorreduziertem BHIS (BHI plus 5 g / l Hefeextrakt und 1% L-Cystein), ergänzt mit 0,1% Natriumtaurocholat und der entsprechenden Konzentration an Antibiotika (T0). </li><li> Sammeln Sie bei jeder Zeitspanne (T0, T6, T24, T48) eine 1-ml-Probe mit einer Pipette und verteilen Sie ein kleines Aliquot (100 μl in seriellen Verdünnungen) auf eine Blut-Agar-Platte. Die Zellen wachsen auf der Blut-Agar-Platte für 48 h in einer anaeroben Kammer bei 37 ° C und zählen die resultierende Anzahl von Kolonien, um CFU zu bestimmen. </li></ol> 3. Proben für die Rasterelektronenmikroskopie vorbereiten <ol><li> 1 ml Zellen aus jedem Zeitpunkt in Mikrozentrifugenröhrchen sammeln und 10 min bei 10.000 xg zentrifugieren. Den Überstand verwerfen und Zellen in PBS waschen. </li><li> Die Proben bei 10.000 xg für 10 min erneut zentrifugieren und den Überstand verwerfen. Zellen in 1 ml 4% Paraformaldehyd erneut verdünnen und 1 h bei Raumtemperatur inkubieren. </li><li> Zentrifugen Sie die Proben erneut für 10 min bei 10,000 xg und verwerfen den Überstand. Zellen zweimal mit destilliertem Wasser waschen und in 100 μl destilliertem Wasser umspülen. Lautstärke einstellen abhängig von der Trübung der Lösung. HINWEIS: Das Erstellen mehrerer serieller Verdünnungen ist eine gute Idee. </li><li> Etikettendeckel und 40 μl der Probe darauf geben. 15 Minuten lang in einer Durchflusshaube inkubieren, um die Flüssigkeit zu verdampfen und den Zellen zu erlauben, an dem Deckglas zu haften. Wenn Flüssigkeit noch vorhanden ist, verwenden Sie ein Gebläse, um die Flüssigkeit zu entfernen. </li><li> Legen Sie markierte Deckgläser mit Zellen in einem Schreibtisch Sputter-Maschine und Klebeband nach unten. Sichern Sie reines Gold in der Sputtermaschine. Maschine einschalten und bei niedrigem Druck (50 mTorr) mit Sputtern beginnen. Coat Zellen für 30 s bei 80 mA, was auf 20 nm Goldbeschichtung übersetzt. </li><li> Übertragen Sie beschichtete Zellen auf das Rasterelektronenmikroskop. </li></ol> 4. Imaging C. difficile Zellen auf einem Rasterelektronenmikroskop <ol><li> Entlüftung des Rasterelektronenmikroskops (SEM) durch prDie Entlüftungsknopf auf der Computer-Software. </li><li> Mit Kohleband befestigen Sie die beschichteten Deckgläser auf die Metallstufe. Sobald die SEM belüftet ist, sollte sich die Tür leicht öffnen. Verriegeln Sie die Metallstufe in die SEM-Kammer, indem Sie sie einschrauben. </li><li> Klicken Sie auf die PUMP-Taste auf der Computersoftware. Der SEM wird nutzbar sein, wenn das System &quot;Vac OK&quot; liest. </li><li> Klicken Sie auf den SE-Detektor unter der Registerkarte Detektoren. Schalten Sie den Strahl ein, indem Sie auf die Schaltfläche klicken, die die Spannung anzeigt. Starten Sie die Bildgebung bei einer niedrigeren Spannung (5 kV), bevor Sie die Spannung erhöhen (bis zu 15 kV). Nach dem Einschalten des Strahls erscheint ein Bild. </li><li> Mit der Tracking-Funktion finden Sie einen Bereich auf den beschichteten Deckgläschen zum Bild. Untersuche die Region und findet stabförmige Strukturen. Diese sind clostridium difficile . </li><li> Vergrößern und fokussieren Sie das Bild, um das System zu kalibrieren. Dies sollte bei mehreren Arbeitsabständen erfolgen: 15, 9 und 5 mm. Bild bei einem Arbeitsabstand von 5 mm. </li><li> Schalte die u einLtra hochauflösenden Imaging-Modus und beginnen zu konzentrieren und optimieren Astigmatismus. </li><li> Beginne bei hoher Vergrößerung. Verwenden Sie dazu den Grob- und Feinfokus. Passen Sie auch Astigmatismus an, um ein klareres Bild zu erhalten. <ol><li> Den Astigmatismus bei hoher Vergrößerung anpassen. Um dies zu tun, passen Sie die Astigmatismus-Toggles (sie sehen ähnlich wie die feinen / groben Fokus schaltet) und überprüfen Sie das Bild für Klarheit durch digitales Zoomen auf der Computer-Software. </li></ol></li><li> Se die langsame Scan-Funktion, um ein qualitativ hochwertiges Bild zu sammeln. Speichern Sie das gesammelte Bild als .TIFF-Datei, die für die Analyse verwendet wird. Vergewissern Sie sich, dass die Datenleiste ausgewählt ist, wenn während der Analyse Messungen vorgenommen werden. </li><li> Sammeln Sie Bilder in verschiedenen Winkeln (bis zu 52 ° durch manuelles Drehen des Winkels direkt auf dem SEM. Abgewinkelte Bilder neigen dazu, mehr Tiefeninformationen zu enthüllen. </li><li> Wechseln Sie die Strahlspannung abhängig von den abgebildeten Zellen. Halten Sie dies vor allem zwischen 5 - 15 kV für alle Experimente. </liAufrechtzuerhalten <li> Nachdem die Bildgebung abgeschlossen ist, schalten Sie den Strahl aus und erhöhen den Arbeitsabstand auf 20 mm. Die Kammer kann dann entlüftet und die Bühne entfernt werden. Kopiere alle Bilder auf ein Laufwerk zur weiteren Analyse. </li></ol> 5. Bildverarbeitung und -analyse <ol><li> Laden und installieren Sie die frei verfügbare Software, FIJI (http://fiji.sc), auf den Computer. </li><li> Öffnen Sie die Bilddatei in FIJI. </li><li> Verwenden Sie die Linienfunktion, um die Waage genau zu verfolgen. </li><li> Klicken Sie auf die Registerkarte Analysieren im FIJI-Programm und wählen Sie die Select Scale-Funktion aus. Es erscheint ein Fenster, das die Einstellung der bekannten Distanz auf der Skala benötigt. Ändern Sie die Längeneinheit und klicken Sie auf OK. </li><li> Nun, da das Programm für die Entfernung kalibriert ist, verwenden Sie die Linienfunktion, um die Zelllänge zu messen. Um die Länge zu erhalten, benutze die Linienfunktion, um die Zelle in ihrer Gesamtheit zu verfolgen. Wählen Sie erneut die Registerkarte Analysieren und klicken Sie dann auf Messen. Die Länge sollte appOhr in den zuvor genannten Einheiten. </li></ol>

<ol><li>Lessa, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burden+of+Clostridium+difficile+infection+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Burden of Clostridium difficile infection in the United States.</a> N Engl J Med. 372 (9), 825-834 (2015).</li>
<li>Vickers, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ridinilazole%3A+a+novel+therapy+for+Clostridium+difficile+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Antimicrob+Agents%22%5BJournal%5D)">Ridinilazole: a novel therapy for Clostridium difficile infection.</a> Int J Antimicrob Agents. 48 (2), 137-143 (2016).</li>
<li>Shah, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clostridium+difficile+infection%3A+update+on+emerging+antibiotic+treatment+options+and+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Anti+Infect+Ther%22%5BJournal%5D)">Clostridium difficile infection: update on emerging antibiotic treatment options and antibiotic resistance.</a> Expert Rev Anti Infect Ther. 8 (5), 555-564 (2010).</li>
<li>Ambrose, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+EMA+guideline+for+antimicrobial+development%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">New EMA guideline for antimicrobial development.</a> Lancet Infect Dis. 12 (4), 265-266 (2012).</li>
<li>Bassères, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+on+toxin+production+and+cell+morphology+in+Clostridium+difficile+by+ridinilazole+%28SMT19969%29%2C+a+novel+treatment+for+C.+difficile+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antimicrob+Chemother%22%5BJournal%5D)">Impact on toxin production and cell morphology in Clostridium difficile by ridinilazole (SMT19969), a novel treatment for C. difficile infection.</a> J Antimicrob Chemother. 71 (5), 1245-1251 (2016).</li>
<li>Endres, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+imaging+the+pharmacological+effects+of+antibiotic+treatment+on+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22Anaerobe%22%5BJournal%5D)">A novel method for imaging the pharmacological effects of antibiotic treatment on Clostridium difficile.</a> Anaerobe. 40, 10-14 (2016).</li>
<li>Endres, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+the+Effects+of+Surotomycin+Treatment+on+Clostridium+difficile+Toxin+A+and+B+Production%2C+Immune+Response%2C+and+Morphological+Changes%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Evaluating the Effects of Surotomycin Treatment on Clostridium difficile Toxin A and B Production, Immune Response, and Morphological Changes.</a> Antimicrob Agents Chemother. 60 (6), 3519-3523 (2016).</li>
<li>Alam, M. J., Anu, A., Walk, S. T., Garey, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+potentially+pathogenic+Clostridium+difficile+contamination+in+household+environs%5BTitle%5D)+AND+%22Anaerobe%22%5BJournal%5D)">Investigation of potentially pathogenic Clostridium difficile contamination in household environs.</a> Anaerobe. 27, 31-33 (2014).</li>
<li>Aitken, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+the+Endemic+Setting%2C+Clostridium+difficile+Ribotype+027+Is+Virulent+But+Not+Hypervirulent%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Control+Hosp+Epidemiol%22%5BJournal%5D)">In the Endemic Setting, Clostridium difficile Ribotype 027 Is Virulent But Not Hypervirulent.</a> Infect Control Hosp Epidemiol. , 1-6 (2015).</li>
<li>Basseres, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+on+toxin+production+and+cell+morphology+in+Clostridium+difficile+by+ridinilazole+%28SMT19969%29%2C+a+novel+treatment+for+C.+difficile+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antimicrob+Chemother%22%5BJournal%5D)">Impact on toxin production and cell morphology in Clostridium difficile by ridinilazole (SMT19969), a novel treatment for C. difficile infection.</a> J Antimicrob Chemother. 71 (5), 1245-1251 (2016).</li>
<li>Walters, B. A., Roberts, R., Stafford, R., Seneviratne, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relapse+of+antibiotic+associated+colitis%3A+endogenous+persistence+of+Clostridium+difficile+during+vancomycin+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Relapse of antibiotic associated colitis: endogenous persistence of Clostridium difficile during vancomycin therapy.</a> Gut. 24 (3), 206-212 (1983).</li>
<li>Chilton, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+effect+of+oritavancin+on+Clostridium+difficile+spore+germination%2C+outgrowth+and+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antimicrob+Chemother%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the effect of oritavancin on Clostridium difficile spore germination, outgrowth and recovery.</a> J Antimicrob Chemother. 68 (9), 2078-2082 (2013).</li>
<li>Ofosu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clostridium+difficile+infection%3A+a+review+of+current+and+emerging+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Clostridium difficile infection: a review of current and emerging therapies.</a> Ann Gastroenterol. 29 (2), 147-154 (2016).</li>
<li>McDonald, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+epidemic%2C+toxin+gene-variant+strain+of+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22New+Eng+J+Med%22%5BJournal%5D)">An epidemic, toxin gene-variant strain of Clostridium difficile.</a> New Eng J Med. 353 (23), 2433-2441 (2005).</li>
</ol>

KWG hat frühere und aktuelle Forschungsunterstützung von Merck & Co. und Summit, PLC, erhalten.

Das Ziel der vorliegenden Studie war es, eine Hochdurchsatzmethode zur Isolierung von C. difficile und zur Untersuchung von Antibiotika-Suszeptibilität mittels Rasterelektronenmikroskopie (SEM) als Mittel zur gründlicheren Charakterisierung der pharmakologischen Wirkung des Antibiotikums zu schaffen. Mit den hier skizzierten Protokollen haben wir gezeigt, dass die bildgebung der phänotypischen Antwort der Zelle auf die antibiotische Behandlung einen Einblick in die pharmakologische Wirkung des Arzneimittels zei...

Clostridium difficile ist ein gram-positives, sporenbildendes Bakterium, das jährlich etwa 500.000 Infektionen in den USA verursacht und als Bedrohungsstufe für die Disease Control and Prevention (CDC), das höchste Risiko, als Bedrohungsniveau angesehen wird. 1 Das vergangene Jahrzehnt hat eine beträchtliche Arzneimittelentwicklung in antimikrobiellen Mitteln mit Aktivität gegen C. difficile beobachtet . 2 , 3 In-vitro- Studien sind ein notwendiger Bestandteil des Arzneimittelentwicklungsprozesses. 4 Herkömmlicherweise werden in vitro- Anfälligkeit und Zeit - Tötungsstudien verwendet, um zukünftige Tier- und andere in vivo- Studien zu validieren. Während diese Methoden eine wichtige Rolle bei der Bewertung von Tötungsaktionen spielen, erfassen sie nicht die phänotypische Reaktion der Zellen auf die pharmakologische Behandlung. Durch die Einbeziehung der Rasterelektronenmikroskopie (SEM) mit StandarD töten kinetische Studien, eine gründlichere Charakterisierung der antibiotischen direkten Effekte ist möglich. 5 , 6 , 7 Hier stellen wir ein Verfahren vor, bei dem SEM als Mittel zur Profilierung der Wirksamkeit der Antibiotika-Behandlung verwendet wird.

<table><tbody><tr><td>Baumwollgaze&nbsp;</td><td>Caring</td><td>PRM21408C</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Macron</td><td>7532</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Röhrchen</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Gehirn Herzinfusion (BHI)&nbsp;</td><td>Kriterium</td><td>C5141</td><td></td></tr><tr><td>L-Cystein</td><td>Alfa Aesar</td><td>A10389</td><td></td></tr><tr><td>Hefeextrakt</td><td>Kriterium</td><td>C741</td><td></td></tr><tr><td>Natriumtaurocholat</td><td>Alfa Aesar</td><td>A18346</td><td></td></tr><tr><td>anaerobe Kammer</td><td>Coy</td><td></td><td>Vinyl anaerobe Kammer</td></tr><tr><td>Cycloserinecefoxitin Fructose-Agar (CCFA) Platten</td><td>Anaerobe systems</td><td>AS-213</td><td></td></tr><tr><td>Blut-Agar-Platten</td><td>Hardy Diagnostics</td><td>A-10</td><td></td></tr><tr><td>Latex-Agglutinationsreagenz</td><td>Oxoid</td><td>DR1107A</td><td>C. diff Testkit</td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>Eppendorf</td><td>222363204</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-031</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldehyd</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-259-98</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger</td><td>J. Melvin freed brand</td><td>7525M</td><td>75 x 25mm</td></tr><tr><td>Durchflusshaube</td><td>Labconco</td><td>Klasse II Typ A2&nbsp;</td><td>Biosicherheitswerkbank</td></tr><tr><td>Tisch-Sputtermaschine</td><td>Denton Vacuum Desk</td><td>II</td><td></td></tr><tr><td>Klebeband</td><td>Kunststoffkern</td><td>05072-AB</td><td>SPI Doppelseitiges Klebeband Kohleband</td></tr><tr><td>gold</td><td>Denton Vacuum</td><td>TAR001-0158</td><td>2.375" Durchmesser x .002" Dickes Rasterelektronenmikroskop aus Goldfolie</td></tr><tr><td></td><td>FEI</td><td>XL-30</td><td></td></tr></tbody></table>

ein protokoll zur charakterisierung der morphologischen veränderungen von<em&gt; clostridium difficile</em&gt; in antwort auf antibiotika-behandlung

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

Die Beurteilung von Antibiotika-Maßnahmen mit neuer Arzneimittelentwicklung, die auf anaerobe Bakterien gerichtet ist, ist schwierig und technisch anspruchsvoll. Um einen Einblick in mögliche MOA zu erhalten, können morphologische Veränderungen, die mit der Antibiotika-Exposition verbunden sind, mittels Rasterelektronenmikroskopie (SEM) sichtbar gemacht werden. Die Integration von SEM-Imaging mit traditionellen Kill-Kurven kann unsere Einsicht in die Drogen-Aktion verbessern und den Drogenentwicklungsprozess vorantreiben. Um diese Prämisse zu testen, wurden Killkurven und SEM-Studien unter Verwendung von Arzneimitteln mit bekannten, aber unterschiedlichen MOA (Vancomycin und Metronidazol) durchgeführt. C. difficile Zellen (R20291) wurden mit oder ohne Anwesenheit von Antibiotika bis zu 48 h gezüchtet. Während des 48-Stunden-Intervalls wurden die Zellen zu mehreren Zeitpunkten gesammelt, um die antibiotische Wirksamkeit und die Bildgebung auf dem SEM zu bestimmen. In Übereinstimmung mit früheren Berichten hatten Vancomycin und Metronidazol eine signifikante bakterizide Aktivität nach 24 h Behandlung, gemessen durch eine koloniebildende Einheit (CFU)Ting Mit SEM-Bildgebung haben wir festgestellt, dass Metronidazol signifikante Auswirkungen auf die Zelllänge hatte (&gt; 50% Reduktion der Zelllänge für jedes Antibiotikum, P &lt;0,05) im Vergleich zu Kontrollen und Vancomycin. Während die phänotypische Reaktion auf die medikamentöse Behandlung bisher nicht auf diese Weise dokumentiert wurde, stimmen sie mit dem MOA des Arzneimittels überein, das die Vielseitigkeit und Zuverlässigkeit der Bildgebung und Messungen und die Anwendung dieser Technik für andere experimentelle Verbindungen zeigt.

Clostridium difficile ist ein sporenbildendes Bakterium und daher ist es wichtig, die Morphologieunterschiede zwischen vegetativen und Sporenzellen vor einer funktionellen Analyse zu bestimmen. Abbildung 1 zeigt repräsentative Bilder von vegetativen Zellen, die während der exponentiellen Phase der Wachstumskurve und Sporenzellen eingefangen wurden. Wie dargestellt, sind vegetative Zellen lange, glatte, stabförmige Strukturen, während Sporen kleine, ovale Struktu...

Die Wirksamkeit von Antibiotika wird am häufigsten durch die Durchführung von kinetischen Abtötungsstudien und die Messung von koloniebildenden Einheiten (KBE) bestimmt. Durch die Integration der Rasterelektronenmikroskopie (REM) in diese Standardmethoden können wir die pharmakologischen Wirkungen der Behandlung zwischen verschiedenen Antibiotika unterscheiden.

Ein Protokoll zur Charakterisierung der morphologischen Veränderungen von<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; In Antwort auf Antibiotika-Behandlung

Assessment of antibiotic action with new drug development directed towards anaerobic bacteria is difficult and technically demanding. To gain insight into ...

Das übergeordnete Ziel dieser mikrobiologischen Bildgebungsmethode besteht darin, eine aussagekräftigere Möglichkeit zur Unterscheidung der phänotypischen Wirkungen pharmakologischer Behandlungen bereitzustellen. Diese Methode kann daher im Bereich der Infektionskrankheiten von großem Nutzen sein, insbesondere bei der Untersuchung der morphologischen Effekte bestimmter Antibiotika und der Art und Weise, wie diese *C. difficile* abtöten.Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie hochauflösende Bildgebung mit In-vitro-ZellkulturmMethoden kombiniert, um einen detaillierten Einblick in die pharmazeutische abtötende Wirkung zu erhalten. Die Anwendung dieser Technik könnte sich auf die Therapie der Clostridium-difficile-Infektion, kurz CDI, auswirken. Der Grund hierfür ist, dass diese Technik eine Möglichkeit bieten könnte, herauszufinden, wie ein Antibiotikum bei der Behandlung der CDI von Nutzen sein kann.Obwohl diese Methode Einblicke in die pharmakologische Wirkung ermöglichen kann, lässt sie sich auch auf andere Systeme anwenden, beispielsweise auf Modelle mit Mischkulturen oder tierexperimentelle In-vivo-Studien. Im Allgemeinen bereitet die neue Methode Schwierigkeiten, da das Kultivieren von C. difficile und die Bedienung eines Rasterelektronenmikroskops anspruchsvoll sind. Die Idee zu dieser Methode entstand erstmals, als wir versuchten, zwischen den Wirkmechanismen verschiedener Antibiotika zu unterscheiden.Ich möchte Ihnen das Forschungsteam vorstellen, dem Sie heute begegnen werden. Jahangir Alam ist Professor und Mikrobiologe. Er koordiniert alle Laboraktivitäten, die Sie heute sehen werden.Tasnuva Rashid ist eine Doktorandin im Labor. Sie übernimmt einen großen Teil der täglichen mikrobiologischen Arbeiten. Eugenie Bassere ist eine Postdoktorandin.Sie hat Tasnuva tatsächlich viele der Fähigkeiten beigebracht und hilft zudem im Labor. Brad Endres ist ein weiterer Postdoktorand im Labor. Er wird viel Mikroskopie mit Hilfe von Long Chang durchführen.Um Umweltproben unter Einhaltung steriler Handschuhe vorzubereiten, verwenden Sie einen vosterilisierten Wattebausch, um die Oberfläche eines beliebigen interessierenden Bereichs, wie beispielsweise eines Bodens, einer Tür, einer Klinke oder eines Regals, abzustreichen. Anschließend geben Sie den Abstrich in ein sterilisiertes Röhrchen. Wechseln Sie zwischen den Proben die Handschuhe.Zur Vorbereitung klinischer Isolate 10 bis 100 Milligramm klinischer Stuhlproben mit einem Inokulationshaken auf Cefoxitin-Cycloserin-Fructose-Agar, kurz CCFA, ausstreichen und die Proben 48 bis 72 Stunden unter streng anaeroben Bedingungen inkubieren. Die isolierten Kolonien der C. Difficile-Stammsammlung zur weiteren Analyse in Kryoröhrchen bei minus 80 Grad Celsius lagern. Umweltabstrichproben in Brain-Heart-Infusion, kurz BHI-Brühe, mit 0,5 % Natriumtaurocholat anreichern und die Proben fünf Tage lang bei 37 Grad Celsius in einer anaeroben Kammer inkubieren.Zentrifugieren Sie ein Milliliter der Kultur bei 10.000 × g und verwenden Sie 100 Mikroliter Ethanol, um das Pellet erneut aufzuschwemmen. Impfen Sie 50 Mikroliter der resuspendierten Zellen auf CCFA-Platten aus und inkubieren Sie die Kulturen in einer anaeroben Kammer bei 37 Grad Celsius für 40 bis 48 Stunden. Lagern Sie die isolierten Kolonien von C. difficile-Stämmen in Kryoröhrchen bei minus 80 Grad Celsius für weitere Analysen. Verwenden Sie das Latex-Agglutinationsreagenz oder die PCR, um die verdächtigen C.difficile-Kolonien zu testen. Züchten Sie gereinigte Umwelt- oder klinische C.difficile-Stämme auf Blutagarplatten in einer anaeroben Kammer bei 37 Grad Celsius für 48 Stunden. Nehmen Sie mit einem Inokulationshaken eine isolierte Kolonie und überführen Sie sie in fünf Milliliter BHI-Medium in einem 15-Milliliter-Röhrchen.Anschließend die Kultur in einer anaeroben Kammer bei 37 Grad Celsius für 24 Stunden inkubieren. Unter Verwendung von frischem, vorher reduziertem BHIS, das mit Natriumtaurocholat und der geeigneten Konzentration eines Antibiotikums ergänzt wurde, die Vorkulturen im Verhältnis 1 zu 100 auf etwa 10 hoch sechs KBE pro Milliliter verdünnen. Mit einer Pipette zu jedem Zeitpunkt eine Probe von einem Milliliter entnehmen und einen kleinen Aliquot auf eine Blutagarplatte auftragen oder verteilen.Die Platte 48 Stunden lang in einer anaeroben Kammer bei 37 Grad Celsius inkubieren und die Anzahl der entstandenen Kolonien zählen, um die KBE zu bestimmen. Ein Milliliter Zellen von jedem Zeitpunkt in Mikrozentrifugenröhrchen sammeln und 10 Minuten bei 10.000 × g zentrifugieren. Den Überstand verwerfen und die Zellen mit PBS waschen.Zentrifugieren Sie die Proben erneut und entfernen Sie den Überstand. Verdünnen Sie die Zellen anschließend mit einem Milliliter 4 % Paraformaldehyd und inkubieren Sie die Röhrchen eine Stunde lang bei Raumtemperatur. Nach erneutem Zentrifugieren und Entfernen des Überstands waschen Sie die Zellen zweimal mit destilliertem Wasser, bevor Sie sie in 100 Mikroliter destilliertem Wasser erneut resuspendieren.Passen Sie das Volumen je nach der Trübung der Lösung an. Nach dem Beschriften der Deckgläser pipettieren Sie 40 Mikroliter der Probe darauf. Inkubieren Sie die Deckgläser unter einem Flussgehäuse 15 Minuten lang, um die Flüssigkeit verdunsten zu lassen und die Zellen an das Glas haften zu lassen.Falls noch Flüssigkeit vorhanden ist, entfernen Sie diese mit einem Gebläse. Legen Sie die Deckgläser in eine Tisch-Sputteranlage und befestigen Sie sie mit Klebeband. Befestigen Sie reines Gold in der Sputteranlage.Schalten Sie dann das Gerät ein und beginnen Sie das Sputtern bei niedrigem Druck. Beschichten Sie die Zellen 30 Sekunden lang bei 80 Mikroampere, was einer Goldbeschichtung von 20 Nanometern entspricht. Um die Bildaufnahme zu starten, entlüften Sie das REM zunächst ordnungsgemäß in der Computersoftware, indem Sie die Schaltfläche Vent betätigen.Nachdem die Zellen beschichtet wurden, überführen Sie sie in das Rasterelektronenmikroskop (REM). Befestigen Sie mit Hilfe des Kohleklebebands die beschichteten Deckgläser auf der Metallstufe. Sobald das REM entlüftet ist, sollte sich die Tür leicht öffnen lassen.Verriegeln Sie die Metallstufe, indem Sie sie in die SEM-Kammer einschrauben. Klicken Sie anschließend im Softwaremenü auf die Taste „Pump“. Wenn das System „okay“ zurückmeldet, ist das REM betriebsbereit.Unter der Registerkarte „Detector“ klicken Sie auf den SE-Detektor. Schalten Sie den Strahl ein, indem Sie auf die Schaltfläche klicken, die die Spannung anzeigt. Beginnen Sie mit der Aufnahme bei einer niedrigeren Spannung, bevor Sie die Spannung erhöhen.Ein Bild erscheint, nachdem der Strahl eingeschaltet wurde. Suchen Sie mithilfe der Tracking-Funktion einen Bereich auf den beschichteten Deckgläsern, der abgebildet werden soll. Zoomen Sie in den Bereich hinein und suchen Sie stabförmige Strukturen, die Clostridium difficile darstellen.Um das System zu kalibrieren, zoomen Sie heran, fokussieren Sie das Bild grob und verknüpfen Sie Z mit dem freien Arbeitsabstand. Dies sollte bei mehreren Arbeitsabständen durchgeführt werden, beispielsweise bei 15, 9 und 5 Millimetern. Danach wechseln Sie in den Ultrahochauflösungs-Bildmodus.Verwenden Sie die Grob- und Feinfokus-Regler, um bei hoher Vergr&ouml;&szlig;erung zu fokussieren. Stellen Sie die Astigmatismus-Regler f&uuml;r ein sch&auml;rferes Bild ein und &uuml;berpr&uuml;fen Sie die Bildklarheit, indem Sie mit der Computer-Software digital in das Bild hineinzoomen. Nutzen Sie den Langsamscan, um ein Bild von hoher Qualit&auml;t aufzunehmen.Speichern Sie das aufgenommene Bild als TIFF-Datei für die spätere Analyse und stellen Sie sicher, dass die Datenleiste ausgewählt ist, falls während der Analyse Messungen durchgeführt werden. Nehmen Sie Bilder aus verschiedenen Winkeln auf, um durch Kippen des Stages im REM mehr Tiefeninformationen zu erhalten. Optimieren Sie Fokus und Astigmatismus, bevor Sie ein Bild mit langsamer Abtastung aufnehmen.Nach Abschluss der Bildaufnahme schalten Sie den Strahl aus und erhöhen den Arbeitsabstand auf 20 Millimeter. Danach entlüften Sie die Kammer und entfernen den Probentisch. Bearbeiten Sie die Bilder und öffnen Sie die Bilddateien in Fiji.Verwenden Sie die Linienfunktion, um die Maßstabsleiste präzise nachzuzeichnen. Klicken Sie auf den Reiter Analysieren und wählen Sie dann die Funktion Skala festlegen. Ein Fenster erscheint, in dem die bekannte Distanz basierend auf der Maßstabsleiste eingestellt werden muss.Ändern Sie auch die Längeneinheit und klicken Sie auf „Okay“. Um schließlich die Zelllänge zu messen, verwenden Sie die Linienfunktion, um die Zelle vollständig nachzuzeichnen. Wählen Sie erneut den Reiter „Analysieren“ und klicken Sie dann auf „Messen“.Die Länge sollte in den zuvor angegebenen Einheiten angezeigt werden. Diese Bilder zeigen C.difficile-Vegetativzellen, die während der exponentiellen Phase der Wachstumskurve aufgenommen wurden, sowie Sporenzellen. Vegetativzellen sind lange, glatte, stabförmige Strukturen; Sporen hingegen sind kleine, ovale Strukturen mit einer rauen Oberfläche.Wie in dieser Abbildung gezeigt, wachsen die Kontrollzellen und erreichen eine Plateauphase; hingegen nimmt die Gesamtanzahl an KBE bei den mit den Antibiotika Vancomycin und Metronidazol behandelten Zellen bis an die Nachweisgrenze ab, was auf eine bakterizide Wirkung hinweist. Wie gezeigt, wirken Vancomycin und Metronidazol effektiv abtötend auf C.difficile bei Konzentrationen oberhalb der MIC. Um die Eignung der REM-Bildgebung von C.difficile zu zeigen, wurden Zellen vor und nach der Behandlung mit dem Wirkstoff abgebildet, um morphologische Veränderungen zu bestimmen.Im Fall von Vancomycin waren einige der Zellwände betroffen, und einige mit Metronidazol behandelte Zellen waren kleiner. Um zu testen, ob die Zellgröße beeinflusst wurde, wurde die Zelllänge mit dem Programm Fiji analysiert. Wie in diesem Bild gezeigt, kann die Größe vegetativer Zellen im Kontrollfall etwas variieren; die meisten haben jedoch eine Länge von etwa 6 Mikrometern.Jedoch wie in diesem Diagramm gezeigt, wurde die Zelllänge in Metronidazol-behandelten Zellen beeinflusst, nicht jedoch in Vancomycin-behandelten Zellen. Sobald die Methode beherrscht ist, kann sie in weniger als zwei Tagen durchgeführt werden. Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass Ihre Probe vor der Beschichtung und der Bildaufnahme fest fixiert und vollständig trocken ist.Mit dieser Methode können wir weitere Verfahren durchführen, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise wie Bakterien auf Antibiotikabehandlungen reagieren; dies kann uns weitere Einblicke in das Verständnis der Wirkmechanismen von Antibiotika verschaffen. Diese Technik hat ein immenses Potenzial und könnte für Forschende auf dem Gebiet der Mikrobiologie den Weg ebnen, die Physiologie und Pharmakologie von Clostridium difficile weiter zu erforschen. Ich hoffe, Ihnen hat das Anschauen dieses Videos heute gefallen.Ich hoffe, Sie haben gelernt, wie man C.difficile-Zellen kultiviert und charakterisiert, wie man die Abtötungskinetik von Antibiotika gegen C.difficile untersucht und anschließend die mit diesen Abtötungsmustern verbundenen morphologischen Veränderungen mithilfe hochauflösender Mikroskopie bewertet. Da wir mit Clostridium difficile arbeiten, müssen wir besondere Vorsichtsmaßnahmen ergreifen und sämtliche Schutzvorkehrungen treffen

a-protocol-to-characterize-morphological-changes-clostridium

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Quelle: Winston, J. A. et al. Cefoperazon-behandeltes Mausmodell des klinisch relevanten Clostridium difficile Stamms R20291. J. Vis. Exp. (2016)Dieses Video demonstriert die Quantifizierung von Clostridium difficile in Fäkalproben aus einem infizierten Mausmodell mittels selektiver Kulturtechniken. Es beschreibt die Verfahren zur Probenentnahme, anaeroben Verarbeitung, serieller Verdünnung und Koloniezählung, um die bakterielle Besiedlung und die Wirts-Pathogen-Interaktionen zu bewerten.

Quantifizierung von Clostridium difficile in Fäkalproben aus einem infizierten Mausmodell

Dieses Video zeigt einen Assay zur Messung der Akkumulation einer fluoreszierenden Antibiotikasonde in Bakterienzellen. Die Exposition gegenüber einem Effluxpumpenhemmer stört den Transmembran-Protonengradienten in Bakterienzellen, woraufhin ein Fluorophor-konjugiertes Antibiotikum zugesetzt wird. Die Hemmung der Effluxpumpen aufgrund des gestörten Protonengradienten führt zu einer Akkumulation des Antibiotikums in den Bakterien. Bakterienzellen werden lysiert und die Fluoreszenzintensität...

Ein Assay zur Messung der Akkumulation einer fluoreszierenden Antibiotikasonde in Bakterienzellen

Clostridium difficile ist ein pathogenes Bakterium, das eine strikte Anaerobier ist und bewirkt, dass Antibiotika-assoziierten Diarrhoe (AAD). Hier, Methoden zur Isolierung, Kultivierung und Pflege von C. difficile vegetativen Zellen und Sporen werden beschrieben. Diese Techniken erfordern eine anaerobe Kammer, die regelmäßige Wartung erfordert, um den richtigen Bedingungen sorgen für optimale C. difficile Anbau.

Kultivierung und Pflege<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; In einer anaeroben Umgebung

Dieses Protokoll beschreibt die Cefoperazon Maus - Modell von Clostridium difficile - Infektion (CDI) eine klinisch relevante und genetisch-lenkbar - Stamm verwenden, R20291. Schwerpunkt auf der klinischen Krankheitsüberwachung, C. difficile Bakterien-Enumeration, Toxin Zytotoxizität und histopathologischen Veränderungen im gesamten CDI in einem Mausmodell werden im Protokoll aufgeführt.

Cefoperazon behandelten Maus-Modell der klinisch relevanten<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; Dehnungs R20291

Dieser Artikel beschreibt eine einfache Protein Microarray Methode für Clostridium Difficile Antigene im menschlichen Serum Profilerstellung humorale Immunantworten auf einer 7-Plex Jury hoch gereinigt werden. Das Protokoll kann zur Bestimmung der spezifischen Antikörperantworten in die Vorbereitungen der polyklonalen intravenöses Immunglobulin erweitert werden.

Ein Protein-Microarray-Assay für die serologische Bestimmung der Antigen-spezifische Antikörper Antworten folgende Clostridium Difficile Infektion

Fluoreszierend getaggte Antibiotika sind leistungsstarke Werkzeuge, die verwendet werden können, um mehrere Aspekte der antibiotika-resistenz zu untersuchen. Dieser Artikel beschreibt die Herstellung von fluoreszierend markierten Antibiotika und ihre Anwendung auf die Untersuchung von Antibiotikaresistenzen bei Bakterien. Sonden können verwendet werden, um Mechanismen der bakteriellen Resistenz (z. B. Efflux) durch Spektrophotometrie, Durchflusszytometrie und Mikroskopie zu untersuchen.

Visualisierung der bakteriellen Resistenz mit fluoreszierenden Antibiotikasonden

Hier stellen wir ein Protokoll zur Etablierung des Antibiotika-induzierten pseudo-keimfreien Dextransulfat-Natrium-induzierten Colitis-Mausmodells vor, um die Rolle der Darmmikrobiota bei der Regulierung der positiven Auswirkungen von Bacillus cereus auf Colitis zu untersuchen.

Untersuchung der lindernden Wirkung der Verabreichung von Bacillus cereus auf Colitis durch Modulation der Darmmikrobiota

Die Antibiotikapersistenz beschreibt die Fähigkeit kleiner Subpopulationen innerhalb einer empfindlichen isogenen Population, hohe Dosen bakterizider Antibiotika vorübergehend zu tolerieren. Das vorliegende Protokoll kombiniert Ansätze zur Charakterisierung des Antibiotika-Persistenz-Phänotyps auf molekularer und zellulärer Ebene, nachdem Escherichia coli tödlichen Dosen von Ofloxacin ausgesetzt wurde.

Populations- und Einzelzellanalyse der Antibiotikapersistenz in Escherichia coli

Aktuelle Diagnostik antimikrobiellen Empfindlichkeitsprüfung beruht auf der Plankton-Wachstum von Isolaten in nährstoffreichen, aeroben Bedingungen. Hier beschäftigen wir eine Alternative künstliche Sputum mittel-bis Antimikrobielle Empfindlichkeit von Pseudomonas aeruginosa Biofilmen unter aeroben und mikroaerophilen Bedingungen mehr repräsentativ für die Mukoviszidose-Lunge zu untersuchen.

Einsatz von künstlichen Sputum Mittlere bis antibiotische Wirkung gegen die getestet<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; AGB in einen engeren Bezug zu den Mukoviszidose-Lunge

Dieser Artikel konzentriert sich auf die Identifizierung von High-Interaktion zuversichtlich Datensätze zwischen Wirt und Pathogen-Proteine ​​mit einer Kombination aus zwei orthogonal Methoden: Hefe-Zwei-Hybrid von einem High-Throughput-Assay Interaktion in Säugerzellen namens HT-GPCA gefolgt.

Komparativen Ansatz, um die Landschaft von Wirt-Pathogen-Protein-Protein-Wechselwirkungen charakterisieren

Lernen Sie eine mikrobiologische Bildgebungsmethode zur Untersuchung morphologischer Veränderungen von Clostridium difficile unter Antibiotikabehandlung. Diese Technik kombiniert hochauflösende Rasterelektronenmikroskopie mit in vitro-Zellkulturverfahren.

Ein Protokoll zur Charakterisierung der morphologischen Veränderungen von Clostridium difficile In Antwort auf Antibiotika-Behandlung (Video) | JoVE Journal

Ein Protokoll zur Charakterisierung der morphologischen Veränderungen von

Weitere Videos entdecken