Methodenartikel

Verdunstungsmindernde Kultur Zustand Erhöht die Reproduzierbarkeit von mehrzelligen Sphäroidformation in Mikrotiterplatten

DOI:

10.3791/55403

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7. März 2017

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Molecular and Translational Medicine, Palacky University in Olomouc

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Die ungleichmäßige Verlust von Medium aus Mikrotiterplatten wirkt sich auf die Reproduzierbarkeit einheitlicher vielzelligen Tumor Sphäroidformation. Kulturbedingungen zu verbessern signifikant Medium Verlust zu reduzieren wird die Reproduzierbarkeit der Sphäroidbildung und die Ergebnisse der Sphäroid basierenden Assays unter Verwendung der flüssig overlay-Technik verbessern.

Zusammenfassung

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Tumormodellen , die eng in - vivo - Bedingungen nachahmen werden immer beliebter in der Wirkstoffforschung und Entwicklung für das Screening von potenziellen Anti-Krebs - Medikamente. Vielzellige Tumorsphäroide (MCTSes) effektiv die physiologischen Bedingungen von soliden Tumoren zu imitieren, so dass sie eine ausgezeichnete In - vitro - Modelle für die Lead - Optimierung und Target - Validierung zu machen. Von den verschiedenen Techniken zur Verfügung, für MCTS Kultur, die Flüssig-Overlay-Verfahren auf Agarose ist eine der preiswertesten Methoden zur MCTS-Generation. Jedoch ist die zuverlässige Übertragung von MCTS-Kulturen unter Verwendung von Flüssig-Overlay für Hochdurchsatz-Screening durch eine Reihe von Einschränkungen beeinträchtigt werden, einschließlich der Beschichtung von Mikrotiterplatten (MPs) mit Agarose und die Nichtreproduzierbarkeit einheitlicher MCTS Bildung über Vertiefungen können. Abgeordnete sind deutlich anfälliger Auswirkungen auf Kante, die durch übermäßige Verdunstung des Mediums von der Außenseite der Platte führen, für Arzneimittel, die Verwendung der gesamten Platte zu verhindernTests. Dieses Manuskript enthält detaillierte technische Verbesserungen an der Flüssig-Overlay-Technik, um die Skalierbarkeit und Reproduzierbarkeit einheitlicher MCTS Bildung zu erhöhen. Zusätzlich Details zu einem einfachen, halbautomatische und universell einsetzbare Software-Tool zur Auswertung von MCTS verfügt nach der Arzneimittelbehandlung präsentiert wird.

Einleitung

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Krebszellen in Tumoren sind physiologisch in einem Komplex, 3-dimensionale (3D) Struktur, die durch extrazelluläre Matrix und die Interaktion Zellen umgeben angeordnet ist. Da fast alle Zellen in Geweben in einer 3D - Umgebung befinden, hat sich die Notwendigkeit für mehr physiologisch relevanten in vitro - Tumormodellen , die Tumormerkmale nachahmen 3 in der Entwicklung mehrerer 3D - Kulturtechniken 1, 2 geführt. Diese Modelle werden nun die Grundlagenforschung Werkzeuge für die Untersuchung der Rolle des Tumor - Mikroumgebung auf die Metastasierung und Zellantwort auf Therapeutika in 3D 2. Darüber hinaus, im Vergleich zu 2-dimensionale (2D) 4 - Zellkulturen erlauben 3D - Modelle für ein besseres Verständnis der Tumor-Stroma - Wechselwirkungen, die Zellsignalwege beeinflussen.

Vielzellige Tumorsphäroide (MCTSes) von Krebszelllinien werden häufig in 3D-Zelle c verwendetulture Modelle aufgrund ihrer relativen Nähe zu in vivo Tumoren. Von den verschiedenen Techniken in Gebrauch, die Flüssigkeit-overlay - Technik (LOT) des MCTS Generation auf Agarose-beschichteten Platten hat erhebliches Interesse für Lead - Optimierung und Target - Validierung 5 gewonnen, 6, 7, 8, 9, 10, 11. Dies ergibt sich aus den jüngsten Studien , die erfolgreich in der Lage waren Pilot Bildschirme von Substanzbibliotheken in MCTS Kulturen 7 mit LOT 6, zu laufen. Doch auch zu gut Variabilität in MCTS Morphologie und das Wachstum durch die Verdunstung induzierte uneben Medienverlust sind häufig Hürden, die die LOT mit Mikrotiterplatten (MPs) begleiten. Folglich beeinträchtigt die Bildung von ungleichmäßigen MCTSes die Bedeutung und Relevanzvon Daten aus pharmakologischen Assays 8, 12, 13. Zusätzlich zu den Reproduzierbarkeit Fragen, ein weiteres praktisches Problem, das LOT-basierte Assays mit hohem Durchsatz beeinflusst, ist die Beschichtung der MPs mit Agarose, wenn die automatische Flüssigkeitsabgabeeinheiten verwendet wird. Obwohl die Abgabeeinheit erhitzt gehalten werden kann , das Gelieren von Agarose zu verhindern, ist das Verstopfen der Ausgabekassette und Schläuche ein potenzielles Problem für Robotersysteme 6.

Um einige dieser Herausforderungen zu bewältigen, haben wir vor kurzem ein paar Änderungen in der LOT für MCTS Kultur 8 entwickelt. Diese Modifikationen werden hauptsächlich auf mögliche Wege zu einer ungleichmäßigen Medium Verlust zu verhindern von den Abgeordneten mit Hilfe von Instrumenten, die zu finden sind, in Hochdurchsatz-Screening-Labors. Eine detaillierte Prozedur des modifizierten LOT für die Erzeugung von gleichmäßiger Größe und reproduzierbaren MCTSes über 384-Well-Platten (WPs) wird hier vorgestellt. Das Manuskript stellt auch eine halbautomatische Routine zur Auswertung von MCTS Größe, insbesondere in teilweise zersetzten, arzneimittelbehandelten MCTSes, die für die Messung der Querschnittsfläche keine klar definierte Grenze aufweisen.

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Protokoll

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1. Herstellung von Agarose-beschichteten Platten

  1. Man wiegt 0,75 g mit niedrigem Schmelzpunkt Agarose und fügen Sie ihn in 100 ml McCoy 5A Medium (mit oder ohne Phenol rot) ohne Serum. Die Lösung wird in einer Mikrowelle und wirbeln alle 1-2 min vollständig die Agarose aufzulösen. Autoclave die Lösung um sie zu sterilisieren.
  2. Kühlen Sie die autoklaviert Agarose auf etwa 70 ° C und filtern sie durch einen 500 ml, 0,22 & mgr; m-Filter oben durch Vakuumfiltration in einem Laminar-Flow-Box. Aliquot der 0,75% gefiltert Agarose-Lösung (FAS) in kleineren Mengen, wenn nicht die gesamte Lösung sofort verwenden. Bewahren Sie diese ready-to-use Agarose-Lösung aseptisch in einem kalten Raum oder 4 ° C Kühlschrank für bis zu 4 Wochen.
  3. Bringen Sie ein kleines Röhrchen mit einem Plastik- oder Metallbestückte Abgabe Kassette an einen Combi-Reagenzspender und grundieren die Kassette mit 70% Ethanol (EtOH) und dann mit steriler phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) in einem Strömungsfeld.
  4. Vor der Verwendung erwärmen, um eine gespeicherte aliquote Menge von FAS i n die Mikrowellen es zu schmelzen. Prime die Abgabekassette mit Agarose-Lösung und Mantel 384-Well-Gewebekultur (TC) -behandelten "special" Mikrotiterplatten mit 15 & mgr; l von FAS. Lassen Sie die Agarose in der Platte für 15-20 Minuten abkühlen lassen, bevor die Zellen Aussaat. Lagern Sie die Agarose-beschichteten Platten aseptisch, in einem Polyethylenbeutel in einem kalten Raum eingewickelt oder bei 4 ° C und vor direktem Licht.
    HINWEIS: Vermeiden wiederholter Erwärmung der 0,75% FAS eine Änderung in der Konzentration der Agarose in der Stammlösung zu verhindern. Agarose-beschichteten Platten können für bis zu 2 Wochen gelagert werden, wenn sie unter den oben genannten Bedingungen gelagert. Die FAS erfordert keine Erwärmung während der Beschichtung von Platten.
  5. Reinigen Sie die Abgabekassette indem sie sie mit 70-80 ° C steriles Wasser Grundierung alle verbleibenden Agarose in den Kassettenspitzen und Schläuche zu entfernen.

2. Zellkultur und MCTS Formation

  1. Kultur menschlicher Zellen HCT116 kolorektalen Karzinomen, wie zuvor beschrieben,lass = "xref"> 8.
  2. Entfernen Sie die erforderliche Anzahl von Agarose-beschichteten, 384er, TC-behandelten Mikrotiterplatten von Kühl- und äquilibrieren sie auf Raumtemperatur (RT) für 15 min.
  3. Bereiten Sie den Combi-Reagenz Spender für Zellbesiedelung durch eine Standard-Rohrabgabekassette mit 70% EtOH und sterilem PBS Grundierung. Stellen Sie die Aussaat Volumen auf die erforderliche ul und die Abgabegeschwindigkeit zu Medium, um die manuelle Einstellung Tasten auf dem Dispenser.
    HINWEIS: Die gesamte Zelle seeding Verfahren wird unter sterilen Bedingungen durchgeführt und in einer Laminar-Flow-Box.
  4. Dissoziieren adhärenten Zellen von der Gewebekulturflasche ein rekombinantes zell Dissoziation Enzym verwendet. Machen Sie eine Zellsuspension Lager in einem sterilen Becher mit Samenzellen in einer Dichte von 2,5 x 10 4 Zellen / ml pro Vertiefung in 50 & mgr; l komplettem Wachstumsmedium. Wenn mehr als ein 384-WP Säen, rühren die Zellen einen Magnetrührer mit ihnen auf den Boden des Becherglases absetzen zu verhindern.
  5. Lassen Sie diePlatten für 30 min bei RT und dann zentrifugieren für 15 min bei 4 x g zu liegen kommt.
  6. Inzwischen nehmen eine Verdampfungsmindernden Umwelt Deckel und füllen Sie es mit 8 ml sterilem H 2 O oder 5% Dimethylsulfoxid (DMSO) in den kurzen Seiten (links und rechts) mit einer 5 - ml - Pipette (1A). Zunächst verzichtet werden 4 ml durch Fegen der Pipettenspitze langsam nach oben und unten Flüssigkeit in die linksseitige Wanne zu füllen. Wiederholen Sie diesen Schritt mit dem rechten Trog.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher , dass die Flüssigkeit zu den Seitenrinnen hinzugefügt verschmelzen nicht in der Mitte des Deckels, und lassen Sie eine Lücke für den Gasaustausch (1A). Zugabe einer überschüssigen Menge an H 2 O ergibt die Versickerung von H 2 O zu der Außenseite des Deckels und anschließend in die äußeren Vertiefungen der 384-Well - Platten TC.
  7. Füllen Sie den Flüssigkeitsbehälter des 384-Well - TC Platte mit sterilem H 2 O und ersetzen die regulären Platte Deckel mit den flüssigkeitsgefüllten Umwelt Deckel (2A).
  8. Legen Sie die Platten in einem 37 ° C Inkubator Rotations mit 95% Feuchtigkeit, 5% CO 2 und 20% O 2 und damit die Zellen in MCTSes für 4 Tage zu aggregieren. Vermeiden Sie den Inkubator Tür öffnen zu lange in den folgenden Tagen, um das Feuchtigkeitsniveau absinkt abrupt zu verhindern.

3. Trägeraustausch ein Robotersystem verwenden

  1. Am Tag 4 folgende MCTS Bildung, fügen Sie 30 ul vorgewärmte Medium pro Vertiefung eines automatisierten Mikrotiterplatten-Waschspender verwenden. Lassen Sie die MCTSes für weitere 3 Tage wachsen. Ersetzen Sie das Medium regelmäßig alle 3 Tage, bis sie die gewünschte Größe für Experimente erreichen.
  2. Um aus jeder Vertiefung ein definiertes Volumen des Mediums aspirieren, empirisch die z -Höhe der Scheibe vielfältig anpassen. Absaugen 30 ul Medium pro Vertiefung und ersetzen Sie es mit 30 ul frisch, vorgewärmte Medium.
    HINWEIS: Stellen Sie die Abgabegeschwindigkeit und die Geschwindigkeit, mit der die Scheibe Verteiler nach unten bewegtin Vertiefungen mit der niedrigsten Rate Turbulenz in den Vertiefungen zu minimieren.

4. Hoch Inhalt Imaging von MCTS und halbautomatische Bildanalyse

  1. Bild der MCTS in einem High-Content-automatisierten Abbildungssystem ein 4X Luftziel mit (NA 16).
  2. Stellen Sie die Belichtungszeit auf 11 ms und die Binning bis 4 x 4. Passen Sie die Anzahl und der Abstand der z -stacks und das Pixel - Binning wie für das Experiment gewünscht , ein ganzes MCTS pro Vertiefung zu erfassen.
  3. Verarbeiten Sie die Bilder schrittweise, wie in der beschriebenen "Readme" über eine eigene Routine in Programmiersprache geschrieben.
    HINWEIS: Die .m Code und .txt Readme - Dateien sind als Zusatz - Code - Dateien (Abbildung 1B). Die Routine misst die MCTS-Bereich, Haupt- und Nebenachsen, Umfang und Festigkeit aus den 2D-Bildern.

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Abbildung 1:Herstellung von Umwelt Deckel und ein Flussdiagramm der halbautomatischen Routine. (A) Bild eines Verdampfungsmindernden Umwelt Deckel gefüllt mit der richtigen (links) und Überschuss (rechts) Menge an Flüssigkeit füllen (hier 5% DMSO). Der Pfeil zeigt die Kurzseiten-Trog für das Hinzufügen von Flüssigkeit. Das Sternchen zeigt die Lücke in der Mitte des Deckels nach der Zugabe des korrekten Volumens von DMSO. (B) Ein Workflow zeigt die Schritte , die an der halbautomatischen Bildanalyseroutine. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Ergebnisse

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Die ungleichmäßige Verlust von Medium, insbesondere aus dem peripheren Brunnen, ist ein häufig auftretendes Problem in MPs mit kleinen Kulturvolumina. Deutlich verbesserte Kulturbedingungen, wie Inkubatoren mit gut kontrollierten Temperatur- / Luftbefeuchtungssysteme und Verdunstung mindernde MPs und Platte Deckel, reduzieren 8 den erheblichen Verlust von Medium über Brunnen. Um die relative Verdunstung, gleiche Volumina von Orange G (OG) messen wurden in jede Ver...

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Diskussion

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Die Beschichtung 384-Well TC Platten mit Filtered Agarose

Die gängige Praxis in LOT ist ein 1-1,5% niedrig schmelzender Agarose zu beschichten , um die Platten zu verwenden, die die Agarose und / oder Abgabeeinheit erfordert gehalten werden erhitzt , um die Gelierung der Agarose 6 zu verhindern. Das Gelieren der Agarose ist potenziell besorgniserregende, während mehrere Platten unter Verwendung von flüssigem Dispensierkassetten kleinen Schlauchöffnungen im Bereich zwisch...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem tschechischen Ministerium für Bildung, Jugend und Sport (LO1304) und der Technischen Agentur der Tschechischen Republik (TE01020028) unterstützt. Die Autoren möchten sich für die Aufnahme von Standbildern von Umwelt Deckel Dr. Lakshman Varanasi zu danken.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
AgaroseSigma-AldrichA9414Tiefschmelzende
McCOY's 5A MediumSigma-AldrichM8403
" schnell" Filtermax FilterTPP995050,22 μ m, 500 mL
Multidrop™ Kombi-Reagenzien-Dispenser Thermo Fisher Scientific5840300
Dosierkassette für kleine TubenThermo Fisher Scientific24073295Metall Spitze
384-Well-TC-Platte PerkinElmer6057308Plattentyp - CellCarrier
Standard Tube Dispensing CassetteThermo Fisher Scientific24072670
MicroClime Environmental LidLabcyteLLS-0310
DMSOSigmaD4540
Rotary Incubator (SteriStore )HighRes Biosolutions23641Serien-Nr.: D00384
Mikrotiterplatten-Waschmaschinen-Spender BioTekNicht spezifiziertesModell: EL406 
High-Content-Imaging-System (CellVoyager)Yokogawa Electric CorporationNicht näher spezifiziertesModell: CV7000
Orange GNew England BiolabsB7022S
TrypLE & Handel; Rekombinantes Express-Reagenz für die ZelldissoziationThermo Fisher Scientific12604021Phenolrot frei

Referenzen

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Liquid Overlay TechnikReduzierung der VerdunstungBeschichtung von MikrotiterplattenHerstellung von Agarose L sungenProtokoll zur ZellaussaatWachstumsbedingungen f r Sph roideautomatisierte BildanalyseAuswertung der WirkstoffbehandlungMinimierung von Randeffekten

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