Summary
組み合わせ前駆同位体標識およびアイソバリックタグ（cPILOT）は、アイソバリックタグのサンプル多重化機能を強化し、定量プロテオミクス戦略です。このプロトコルは、アルツハイマー病のモデルマウスと野生型対照からの組織へのcPILOTの適用を説明しています。
Abstract
病気の理解とバイオマーカー探索のために多くの生物学的サンプルを分析するための需要が高まっています。複数のサンプルの同時測定を可能に定量プロテオミクス戦略が普及し、大幅に実験的なコストと時間を削減しています。私たちの研究室では、伝統的な同位体ラベルまたはアイソバリックタグ付けアプローチのサンプル多重化を強化する同位体標識およびアイソバリックタグ（cPILOT）を組み合わせ、前駆体と呼ばれる技術を開発しました。グローバルcPILOTは、細胞、組織、体液、または生物全体に由来するサンプルに適用し、異なる試料条件を横切る相対タンパク質存在量に関する情報を提供することができます。 cPILOTは（ 材料/試薬の表を参照） を選択dimethylateペプチドのN末端に低pH緩衝液条件を使用し、2）市販のアイソバリック試薬とリジン残基の一級アミンを標識するために高pH緩衝液条件を使用して）1によって働きます。度利用可能なサンプルの多重化が使用される前駆体ラベルおよび同重体標識試薬の数に依存します。ここでは、1回の分析でのマウス組織からの12個のサンプルを分析するために六プレックスアイソバリック試薬と組み合わせ軽および重ジメチル化を使用して、12プレックス分析を提示します。強化多重化は、実験の時間とコストを削減し、より重要なことには、より少ない実験バイアスとエラーを有する多くのサンプル条件を横断比較（生物学的複製、病期、薬物治療、遺伝子型、又は長手方向時点）を可能にするために有用です。この作品では、グローバルcPILOTアプローチは、アルツハイマー病のモデルマウスと野生型対照からの生物学的複製を越え、脳、心臓、および肝臓組織を分析するために使用されます。グローバルcPILOTは、他の生物学的プロセスを研究するために適用され、20個の以上のサンプルにサンプル多重化を増大させるために適合させることができます。
Introduction
プロテオミクスは、多くの場合、より良い疾患プロセスを理解するために使用される多くのサンプルを、酵素反応速度、翻訳後修飾、環境刺激に反応し、治療処置、バイオマーカーの発見、または薬物のメカニズムへの応答の分析を含みます。定量的な方法は、サンプルを横切るタンパク質レベルの相対的差異を測定するために使用することができ、ラベルフリーであるか、または同位体標識（代謝的、化学的、または酵素）を含むことができます。彼らは多くのサンプルを同時に分析することを可能にし、異なる細胞、組織、体液、または生物全体からのサンプルに適しているので、安定同位体標識法は、人気が成長しています。同位体標識法1、2、3、4、5、6、7増加実験スループット、取得時間、コスト、および実験誤差を低減します。これらの方法は、ペプチドピークからのタンパク質の相対存在量を測定するために、前駆体の質量スペクトルを使用します。対照的に、同重体標識試薬は、8、9、10は、いずれかのMS / MS又はMS 3スペクトル11で検出され、これらのピークは、タンパク質の相対存在量について報告するために使用されるレポーターイオンを生成します。
現在の最先端のプロテオミクス多重では、10プレックス12または12重アイソバリックタグの分析13のいずれかです。強化サンプル多重化（ すなわち > 10個のサンプル）の方法は、セル18の分析のために他の人が組織14、15、16、17のために我々の研究室によって開発された、とされていますSUP>、19、20、21、または標的化ペプチド22を組織します。私たちは、アイソバリックタグ（cPILOT）との組み合わせ前駆同位体標識と呼ばれる強化多重化技術を開発しました。グローバルcPILOTは、異なる試料条件（≥12）14を横切る全てのタンパク質の相対濃度に関する情報を取得するために有用です。 図1は、一般的cPILOTワークフローを示します。トリプシンまたはLys-Cペプチドは、選択的に低pH 2を用いてジメチル化とN末端と高いpHを使用して6-プレックス試薬とリジン残基で標識されます。この戦略は、実験的なコストを削減するのに役立ち、さらに、実験の手順や時間を削減するアイソバリック試薬を用いて分析することができ、サンプルの数が2倍になります。
我々は、酸化翻訳後MODIを研究するために他の方法を開発してきたようcPILOTは柔軟性があります3-ニトロチロシン修飾タンパク質14およびS-ニトロシル化（oxcyscPILOT）23とシステインを含むペプチドを含むfications、。我々はまた、アミノ酸の選択的アプローチ、システインcPILOT（cyscPILOT）17を開発しました。トップイオン11または選択-Y 1 -イオン法15とMS 3獲得は、レポーターイオンの干渉を軽減し、cPILOTの定量精度を向上させることができます。低解像度のイオントラップ機器は、24を動作することができるものの、取得方法におけるMS 3の使用は、オービトラップ質量分析器と高分解能機器を必要とします。
以前は、cPILOTは、アルツハイマー病のモデルマウスからの肝臓タンパク質16を研究するために使用されてきました。ここでは、peripheの役割を研究するために、脳、心臓、肝臓ホモジネートを使用してグローバルcPILOT分析を実行する方法について説明しますアルツハイマー病におけるRY。この実験は、生物学的複製を内蔵しています。そのためcPILOTの汎用性、興味のあるユーザーは、生物学的な問題やシステムの範囲のために他の組織を研究するために技術を使用することができます。
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Protocol
倫理文：マウスは、独立した非営利生物医学研究機関から購入し、ピッツバーグ大学の実験動物資源部門に収容しました。全ての動物プロトコルは、ピッツバーグ大学の施設内動物管理使用委員会によって承認されました。
化学タギング1.タンパク質抽出およびペプチドの生成
- 組織、細胞、または体液からタンパク質を抽出します。
- 機械式ホモジナイザーを用いて8 M尿素（500μL）を用いてリン酸緩衝生理食塩水（1×PBS）で組織の60〜90 mgの（ 例えば 、脳、心臓、および肝臓）を均質化します。必要であれば、プロテアーゼまたはホスファターゼ阻害剤を緩衝液に添加してもよいです。このプロジェクトでは、彼らが使用されませんでした。ホモジナイザーは、次のパラメータを使用する：行列Aビーズ、4メートル/秒、20秒を溶解します。心臓組織は、均質化の最大9サイクルが必要な場合があります。
注：プロテアーゼまたはホスファターゼ阻害剤必要であれば、Sがバッファに追加されてもよいです。彼らは、この研究で使用されませんでした。- 溶解チューブから組織ホモジネートを取り外し、マイクロ遠心チューブに移します。 8 M尿素を含むPBSの100-500μLで管を溶解リンスし、組織ホモジネートと共にリンス液を組み合わせます。
- ホモジナイズした組織を遠心分離（9447×gで、4℃、15分）し、上清を集めます。
- 機械式ホモジナイザーを用いて8 M尿素（500μL）を用いてリン酸緩衝生理食塩水（1×PBS）で組織の60〜90 mgの（ 例えば 、脳、心臓、および肝臓）を均質化します。必要であれば、プロテアーゼまたはホスファターゼ阻害剤を緩衝液に添加してもよいです。このプロジェクトでは、彼らが使用されませんでした。ホモジナイザーは、次のパラメータを使用する：行列Aビーズ、4メートル/秒、20秒を溶解します。心臓組織は、均質化の最大9サイクルが必要な場合があります。
- 製造業者の指示に従ってビシンコニン酸（BCA）アッセイを用いてタンパク質濃度を決定します。
注：タンパク質濃度が高すぎると、バッファとのさらなる希釈が必要な場合があります。これらの組織からの試料について得られた濃度は6-13μgの/μLの間にありました。- オプション：比1μgの標準と内部品質管理基準（ 例えば 、ウシ、アルファカゼインまたはその他の外因性タンパク質）を追加します：100μgタンパク質サンプル。
- 個々のマイクロ遠心管を標識するために、各試料からのタンパク質の100μgの（100×10 -6 g）を加えます。ボリュームは、タンパク質濃度に依存している（ステップ1.2参照）。
- 各サンプルに：（モル比をサンプリングする1試薬40）ジチオスレイトール（DTT）を加えます。 2時間37℃でインキュベートします。モル比の計算は、66.5×10 3グラム/モルであるウシ血清アルブミン（BSA）のタンパク質の質量をオフに基づいています。
- 各サンプルに：（モル比をサンプリングする1試薬80）ヨードアセトアミド（IAM）を加えます。 2時間暗所で氷上でインキュベートします。この反応は、副反応を防止するために、2時間氷上で行われます。
- 各サンプルに：（モル比をサンプリングする1試薬40）L-システインを加えます。室温で30分間インキュベートします。
- 2 Mの最終濃度となるように尿素を希釈するために10mMのCaCl 2を液（pH 8.2）を含む20mMトリス緩衝液を加えます
- 50（トリプシン - 処理L-1-トシルアミド-2-フェニルエチルクロロメチルケトン（TPCK）を追加：モル比を酵素に1基板）を各試料に24時間37℃でインキュベートします。
- フラッシュ凍結さらに処理するまで-80℃で液体窒素とストア内のサンプルによるタンパク質消化をクエンチします。
3.サンプルの脱塩
- ギ酸（FA）を添加することによって、サンプルを再酸性化します。 0.1％の最終濃度を得るために十分なFAを追加します。サンプルは-80℃で、元々ある場合は、再酸性化の前に氷上でサンプルを解凍。
- 以前に16を説明したようにC 18の親水性親油性バランス（HLB）10 mgのカートリッジを用いて脱塩ペプチド。
- 〜10μLの体積に真空遠心分離（5トル、45℃、77 XG）によって試料を乾燥させます。
4.ジメチル化標識（N末端）
- 高速液体クロマトグラフィー（HPLC）またはナノ純グレードの水に溶解し、1％酢酸（0.25μgの/μL）でペプチドを再構成します。 50μを削除;グラム新しい微量遠心管に部分（1.5 mL）に溶解し、-80℃で剰余を格納します。
- それぞれ、軽鎖または重ジメチル化で標識するためのサンプルに60 mMの8μL（4％）CH 2 O（37％重量/ V）または60 mMの（4％）13 CD 2 O（20％重量/体積）を追加。典型的には、試薬の4μLは、ペプチドの25μgの（ステップ4.2、4.3、4.6）ごとに添加されます。
- それぞれ、軽鎖または重ジメチル化で標識された試料に24ミリモルのNaBH 3 CNまたは24 mMのNaBD 3 CNの8μLを加えます。
- ボルテックスし、室温で約10分間、チューブシェーカーで振ります。
- 5分間、1％のアンモニア（〜28から30パーセントのV / V）の16μLを添加することにより反応をクエンチしました。典型的には、試薬の8μL、ペプチド25μgのあたりに添加されます。
- 5％FA（98％v / v）での8μLを添加することにより反応混合物を再酸性化。
- 6個のサンプルの合計を生成するために、軽鎖および重ジメチルペプチド（ 図1）を結合します。 表1を参照してください。
- ステップ3.2及び3.3に従ってサンプル脱塩を行います。
5.同重体タギング（リジン残基）
- トリエチルアンモニウム重炭酸塩（TEAB）緩衝液（pH約8.5）を100mMにジメチル化ペプチド100μgの（を1μg/μL）を再構成します。
- 製造業者のプロトコルに記載の同重体試薬を調製し（ 材料/試薬の表を参照のこと）。
- ペプチドおよび〜10秒間ボルテックスに可溶化されたアイソバリック試薬（41μL）を追加します。約1時間のマイクロ遠心チューブシェーカー上でサンプルを振ります。 8μLヒドロキシルアミン（w / vの10％）で反応をクエンチし、室温で15分間、サンプルをインキュベートします。
- さらに使用するまで-80℃でプール単一の混合物に6つの標識された試料と（ステップ3.1-3.3）を脱塩またはストア。
注：プロテオームカバレッジ及び深さを向上させるために、多次元分離戦略が提案されています以下のような強カチオン交換（SCX）。
6.強カチオン交換
- 製造業者のプロトコルに従ってSCXを行う（ 材料表を参照）。
- ギ酸アンモニウム溶液の約1ミリリットル（20ミリメートル、40ミリメートル、60ミリメートル、80ミリメートル、100ミリメートル、150ミリメートル、250ミリメートル、および500 mM）の10％アセトニトリル（ACN）、0.1％FA（PH 3）とを準備します。
- ピペットチップの上部から赤色キャップを取り外し、梱包材料がピペットチップの底部に向かっていることを確実にするためにスラリーを充填してピペットチップをタップ。
注：重要：プロトコルの最後までピペットチップを捨てないでください。 - マイクロ遠心チューブ（2 mL）中の上部に遠心アダプタを配置し、内部ピペットチップを固定します。
- ピペットチップにSCXの再構成緩衝液の150μLを追加します。
- 室温（4,000 XG）で6分間、ピペットチップを遠心。このステップをさらに2回繰り返し、廃棄物を捨てます。
- Pを溶かしますSCXの再構成緩衝液の150μLでeptides。 pHが3であることを確認してください。
- ピペットチップ、遠心分離機（6.1.5を参照）にペプチドを追加し、溶離液を保持します。
- 新しいマイクロ遠心チューブ（2 mL）中にフィルタやピペットを転送し、20mMギ酸アンモニウム溶液の150μLを加えます。室温（4,000 XG）で6分間遠心分離し、溶出液を保ちます。
- 繰り返しステップ6.1.8さらに7回、ギ酸アンモニウムの連続濃度（ すなわち、40ミリメートル、60ミリメートル、80ミリメートル、100ミリメートル、150ミリメートル、250 mMの500 mm）を使用。
- マイクロ遠心チューブ（1.5 mL）を8つのSCX画分を移し、遠心蒸発を使用してそれらを濃縮する（ステップ3.3参照）。
7.液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析（LC-MS / MS）及びMS 3
- 0.1％FA、フィルターで質量分析グレードの水でペプチドを再構成し、オートサンプラーバイアルに入れます。 follとしてフィルターペプチドOWS：
- （ 材料表を参照） を 0.65μmのフィルターを含むマイクロ遠心チューブに再構成されたペプチドを加えます。
- 1分間12,000×gで遠心分離したペプチド。 、フィルターを取り外し廃棄し、そしてオートサンプラーバイアルに濾過ペプチドを追加します。
- 次のように移動相緩衝液を調製する：3％、0.1％FA（A）と（v / v）のACNから100％ACNと0.1％FA（B）と。
- C 18材料（5μM、200オングストロームの細孔サイズ）で2 cmの充填トラップカラム上に各SCX画分試料の6μLを注入します。
注：次のようにトラップで洗浄サンプル：3分、0％B。 2次元液体クロマトグラフィーシステムを使用して、3μL/分（ 材料表を参照）。 - 分析分離方法を実行します。 C 18材料を充填した75μmのID X 13.2センチメートルレーザプルチップ溶融シリカ毛管カラム（5μM、100オングストローム）を使用します。勾配がある：0~5分、10％B。 5~40分、10~15％B。 40~90分で15~25％のB; 90から115分、25-30％B。 115-130分30〜60％のB。 130-135分、60~80％B。 135-145分、80％のB、145-150分、80から10パーセントのB。 150-180分、10％B。 300 NL /分、180分。
- 分析分離法が実行されている間、質量分析計のためのデータ収集を実行します。
注：次のようにMSサーベイスキャンのパラメータは、400-1,600 のm / z、60,000解像度、自動利得制御（AGC）1×10 6イオン、最大注入時間500ミリ秒を標的とします。次のようにCID-MS / MSのためのパラメータは、次のとおりトップ1-7又はトップ8-14データ依存取得（DDA）3 のm / zの分離幅、500最小信号、35％の正規化衝突エネルギー（NCE）、0.25起動Q 、10ミリ秒の起動時間、3×10 4 AGC、50ミリ秒の最大注入時間。次のようにHCD-MS 3のパラメータは、次のとおり200最小信号4 のm / z分離幅、60％NCE、0.1起動時間、3×10 5 AGC、250ミリ秒IT、300-1,300 のm / z MS / MS選択範囲、非断片化された親イオンを除外する。
8.データ分析16
- 例えば、マウスUNIPROTなど適切なデータベース、に対して、タンパク質解析ソフトウェアを使用してRAWファイルを検索します。
注：これは、軽および重ジメチル化ペプチドを探索するために、各RAWファイル用の2つのワークフローを作成することが重要です。 - 以下のパラメータを用いてRAWファイルを検索2つの逃し切断、ペプチドの質量範囲300-6,000 DA、15ppmの親質量公差、1つのダフラグメンテーション公差とトリプシン。静的変更：光ジメチル化（28.031、ペプチドN末端）またはheavyジメチル化（36.076 DA、ペプチドN末端）、カルバミドメチル（57.021 DA、C）。
注：時々重ジメチル化ピークは約7 DA（35.069 DA、ペプチドN末端）は、光ジメチルピークからなっているので、重ジメチル化ペプチドの探索ワークフローに組み込まれるべきです。動的変更：酸化（15.995 DA、M）、6重アイソバリックタグ（229.163 Daの、K）。アイソバリックタグのレポーターイオン強度を検索するための偽発見率（ 例えば 1〜5％）および定量ノードを生成するおとりデータベース検索を含めます。 - 統計
- タンパク質レポーターイオン値を正規化するために、電子スプレッドシートプログラムにデータをエクスポートします。各タンパク質について、それぞれ、内部標準の内部標準又は生レポーターイオン強度の中央値比によりメディアンレポーターイオン比または生レポーターイオン強度のいずれかを分割します。そのような電子スプレッドシートプログラム、ペールスとして適切な統計ソフトウェアを使用してくださいサンプル条件の間で有意な変化を決定するために、EUS、又はR。
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Representative Results
cPILOTは、N末端およびリジン残基のラベルペプチドを化学的にアミン系化学物質を使用し、サンプル多重化機能を強化します。 図2は、アルツハイマー病のマウスモデルおよび野生型対照からの脳、心臓、および肝臓組織の12プレックスcPILOT分析から得られた代表的なMSデータを示します。 表1に示されているように、アルツハイマー病および野生型マウスのための2つの生物学的反復は、この12-プレックス解析に含まれています。 図2Aは、ペプチドに組み込まれた単一ジメチル基を表す4 のm / z間隔によって分離されて二重荷電ピークのペアを示しています。光このペアの重ジメチル化ピークの両方は、独立して単離し、CIDと断片化されています。ジメチル化ペプチドのそれぞれのためのMS / MSデータは、 図2BおよびCに示されています。検索結果は、このパイを示していますピークのrがT（ジメチル）ELNYFAK（アイソバリックタグ6）軽鎖および重ジメチル化ピークの両方について類似であるタンパク質のホスホグリセリン酸キナーゼ1の最も強いフラグメントイオンは、Y 3+のペプチドに属します。これらのピークは、HCD-MS 3についてさらに単離されると、図2Dおよび2Eに示されるようにレポーターイオン（M / Z 126-131）が観察されます。 MS 3スペクトルの両方のセットは、12個のサンプルに関する情報を取得するために必要です。この例では、脳、肝臓、および心臓組織のためのレポーターイオン比（AD / WT）（アルツハイマー病/野生型コントロール）は2つの生物学的複製を横切る類似しています。各比較のための倍数変化値は、肝臓でのレベルが低いのに対し、脳および心臓におけるホスホグリセリン酸キナーゼ1つのレベルは、ADマウスにおいて高いことを示唆しています。
Figu1再：cPILOTを使用してプロテオミクスのワークフロー。一例として、このワークフローは、12個の個体の試料の分析の概要を示します。組織、細胞、または体液からタンパク質を抽出し、適切なタンパク質の標準（ 例えば、ウシα-カゼイン）を添加します。タンパク質は、トリプシンを用いて消化されます。ペプチドは、TMT 6 -plex（pH約8.5）を使用して、軽鎖または重ジメチル化（pH約2.5）を使用して、およびリジン残基にN末端で標識されます。標識されたペプチドをSCX RP-LC-MS / MS及びMS 3に単一の混合物と被験体にプールされています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：脳、心臓、およびアルツハイマー病のモデルマウスと野生型のコントロールの肝臓組織からのペプチドの例cPILOTデータ。 （A）は、m / zの 643.854及び647.875のピークによって表される軽鎖および重ジメチルペプチドを、示しています。これらのペプチドは、このようなペプチド同定を提供CID-MS / MSスペクトル（B及びC）を生成する、単離された、選択された、断片化しました。追加の選択、単離、及びMS / MSステージにおける軽鎖および重ジメチル化ペプチドの最も強いフラグメントイオンのフラグメンテーションは、それぞれ、HCD-MS 3スペクトル（DおよびE）を生成しました。ペプチド配列は、T（ジメチル）ELNYFAK（アイソバリックタグ6）であり、キナーゼ1.ホスに属し、この図のより大きなバージョンを表示するにはここをクリックしてください。
| アイソバリック試薬0; | ||||||
| 126 | 127 | 128 | 129 | 130 | 131 | |
| 光ジメチル化 | WT A | 広告B | WT | 広告 | WT | 広告 |
| 脳 | ハート | 肝 | ||||
| ヘビージメチル化 | WT | 広告 | WT | 広告 | WT | 広告 |
| ハート | 肝 | 脳 | ||||
| 組織は、野生型コントロール（WT）Aまたはアルツハイマー病マウス（AD）Bからのいずれかです。 | ||||||
表1：ADおよびWT脳、心臓、および肝臓組織のcPILOTグルーピング。
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Discussion
cPILOTは12個の以上のユニークなサンプルの同時測定が可能になります。ペプチドの両方のN末端及びリジン残基で成功したタグを確保するためには、反応の各セットのための正しいpHを有し、かつ第一のペプチド標識のためのジメチル化反応を行うことが不可欠です。 N末端での選択的ジメチル化は、（±0.2）〜2.5でpHを有することによって行われます。これは、リジンおよびN末端にアミノ基のpKaのの違いを利用することによって達成されます。 pHが2.5で、リジンが非アクティブである（PKA〜10.5）。 pHが弱酸性である場合は、（ すなわち pHが5-7）、または基本的な、両方のN末端およびリジン残基がジメチル化されます。同重体標識は、低pHで最初に実行された場合に加えて、N末端は、等圧のラベルとリジン残基がジメチル化されなければなりません。これは、Bイオンを選択する必要があるようにMS 3のために選択される以下のフラグメントを生じ得ます。ジメチルの相対的なコストエーションの反応は、市販のアイソバリック試薬に比べて安価です。 1が100μgのあたり全体のアイソバリック試薬のバイアルを使用することができますが、我々はまた、同等の標識効率と100μgのあたりの試薬瓶の半分を使用して成功を収めています。これはかなり個々cPILOT実験のためのコストを削減し、より多くのサンプルを分析することができます。また、我々が以前に14を実証してきたように、他のアイソバリックタグ付け試薬は、このプロトコルで使用されるアイソバリック試薬の代わりに使用することができることに注意することが重要です。高ラベリングとタグ付け効率性を確保するために、すぐにサンプルに試薬を添加することが重要です。サンプルはほぼ同じ反応時間を持つようにするためにこれができるようになります。定量的な目的のために、各サンプルは、ジメチル化及び同重体標識手順でサンプルをプールに同一特に前に処理されなければなりません。最後に、requir初期段階で同時に多くのサンプルを扱うことに留意すべきですサンプルの取り扱いにユーザースキルと注意慎重ES。
最も理想的なシナリオは、12個のサンプルを横切って混合物中のすべてのタンパク質のレポーターイオンを得ることです。しかし、これは、多数のタンパク質の場合はそうではありません。 cPILOT及び他の拡張多重接近するための定量情報を検出したペプチドの数は、サンプルタイプ、サンプルの分別および処理工程、MSデータ取得方法、および器具の種類を含むいくつかの要因に依存します。ジメチル化およびアイソバリックタグ付け手順の両方が、〜95から99パーセントの高いペプチドの標識効率を有するが、レポーターイオンの情報は含まれませんMS 3データの〜20％が依然として存在しています。これは、アイソバリック試薬の無取り込みにつながるアルギニンで終了するペプチドを生成し、トリプシンを使用することに一部起因します。このことは、タンパク質同定25の潜在的なトレードオフで、例えばのLysCなどの他の酵素を使用して解決することができます。また、重いためペプチドをジメチル化、断片化のために選択されたピークは、異なる強度を有するM又はM-1ピーク、とすることができ、MS 3段階で観察されたレポーターイオンの強度に影響を与えます。したがって、いくつかのサンプルについて検出されないいくつかの低強度のレポーターイオンが存在してもよいです。このような状況は、多くの場合、一般的にMS 3段階のために分離されている低強度MS / MSフラグメントについて観察されています。この問題に対する最適なソリューションは、代わりにMS 3について単一ノッチ選択を使用する、マルチノッチ又は複数のMSを使用tribrid質量分析計に組み込まれている/ MSは、26フラグメント。
汎用性の多くは、特に単一分析で比較することができるサンプルの数（ すなわち 、商業同重体試薬と20まで）及び使用される組織の種類に関してcPILOTアプローチです。私たちは、脳、心臓からの正確な定量的な情報を得ることが容易であることを実証し、疾患の文脈で同じ解析で肝組織。この方法は、同様に他の多重化方式へ、一度に複数のサンプルの分析を可能にし、細胞、組織、体液、または全生物体由来の試料に適用可能です。また、cPILOT標識されたペプチドは、低い24または高解像度（60,000）器具のいずれかを使用して分析されることが可能です。比較して、他の多重化方式を使用して成功した測定は、18サンプルの特定のタイプ（ すなわち、セル）に限定してもよい得、非常に高い解像度20、又は安定同位体ラベルにアクセス器具を必要とするかもしれません。 cPILOTは、疾患の理解、バイオマーカーの発見、薬物または治療的介入、または多くの時点間の縦の変化に応じて、関心のあるユーザーに最適です。さらに、大きなショットガンプロテオミクスのための（Nが大きい場合には、数百〜数千）臨床サンプル、CPの分析ILOTは、実験コストと時間を削減することが適当です。将来的には、cPILOTは、既存および新規の同位体および同重体ラベルを使用して多数のサンプルを多重化するように拡張されます。
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Disclosures
著者は何の競合する利害を持っていません。
Acknowledgments
著者はRASRにピッツバーグ大学のスタート・アップ・ファンドおよびNIH、NIGMS R01の助成金（GM 117191から01）を認めます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Water - MS Grade | Fisher Scientific | W6-4 | 4 L quantity is not necessary |
| Acetonitrile - MS Grade | Fisher Scientific | A955-4 | 4 L quantity is not necessary |
| Acetic Acid | J.T. Baker | 9508-01 | |
| Ammonium hydroxide solution (28 - 30%) | Sigma Aldrich | 320145-500ML | |
| Ammonium formate | Acros Organics | 208-753-9 | |
| Formic Acid | Fluka Analytical | 94318-250ML-F | |
| BCA protein assay kit | Pierce Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| Urea | Biorad | 161-0731 | |
| Tris | Biorad | 161-0716 | |
| Dithiothreiotol (DTT) | Fisher Scientific | BP172-5 | |
| Iodoacetamide (IAM) | Acros Organics | 144-48-9 | |
| L-Cysteine | Sigma Aldrich, Chemistry | 168149-25G | |
| L-1-tosylamido-2 phenylethyl cholormethyl ketone (TPCK)-treated Trypsin from bovine pancreas | Sigma Aldrich, Life Science | T1426-100MG | |
| Formaldehyde (CH2O) solution; 36.5 - 38% in H2O | Sigma Aldrich, Life Science | F8775-25ML | |
| Formaldehyde (13CD2O) solution; 20 wt % in D2O, 98 atom % D, 99 atom % 13C | Sigma Aldrich, Chemistry | 596388-1G | |
| Sodium Cyanoborohydride; reagent grade, 95% | Sigma Aldrich | 156159-10G | |
| Sodium Cyanoborodeuteride; 96 atom % D, 98% CP | Sigma Aldrich, Chemistry | 190020-1G | |
| Strong Cation Exchange (SCX) spin tips sample prep kit | Protea BioSciences | SP-155-24kit | |
| Triethyl ammonium bicarbonate (TEAB) buffer | Sigma Aldrich, Life Science | T7408-100ML | |
| Isobaric Tagging Kit (TMT 6 plex) - 6 reactions (1 x 0.8 mg) | Thermo Fisher Scientific | 90061 | |
| Hydroxylamine hydrochloride | Sigma Aldrich, Chemistry | 255580-100G | |
| Standard vortex mixer | Fisher Scientific | 2215365 | any mixer can be used |
| Oasis HLB 1 cc (10 mg) extraction cartridges | Waters | 186000383 | These are C18 cartridges |
| Visiprep SPE vacuum manifold, DL (disposable liner), 24 port model | Sigma Aldrich | 57265 | A 12 port model is also sufficient |
| Speed-vac | Thermo Scientific | SPD1010 | any brand of speed vac is sufficient |
| Water bath chamber | Thermo Scientific | 2825/2826 | Any brand of a water bath chamber with controlled temperatures is sufficient. |
| Mechanical Homogenizer (i.e. FastPrep-24 5G) | MP Biomedicals | 116005500 | |
| Eksigent Nano LC - Ultra 2D with Nano LC AS-2 autosampler | Sciex | - | This model is no longer available. Any nano LC with an autosampler is sufficient. |
| LTQ Orbitrap Velos Mass Spectrometer | Thermo Scientific | - | This model is no longer available. Other high resolution instruments (e.g. Orbitrap Elite, Orbitrap Fusion, or Orbitrap Fusion Lumos) can be used. |
| Protein software (e.g. Proteome Discoverer) | Thermo Scientific | IQLAAEGABSFAKJMAUH | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | AL54 | |
| Stir plate | VWR | 12365-382 | Any brand of stir plates are sufficient |
| pH meter (Tris compatiable) | Fisher Scientific (Accumet) | 13-620-183 | Any brand of a pH meter is sufficient |
| pH 10 buffer | Fisher Scientific | 06-664-261 | Any brand of pH buffer 10 is sufficient |
| pH 7 buffer | Fisher Scientific | 06-664-260 | Any brand pH buffer 7 is sufficient |
| 1.5 mL eppendorf tubes, 500 pk | Fisher Scientific | 05-408-129 | Any brand of 1.5 mL eppendorf tubes are sufficient |
| 0.6 mL eppendorf tubes, 500 pk | Fisher Scientific | 04-408-120 | Any brand of 0.6 mL eppendorf tubes are sufficient |
| 0.65 µm Ultrafree MC DV centrifugal filter units | EMD Millipore | UFC30DV00 | |
| 2 mL microcentrifuge tubes, 72 units | Thermo Scientific | 69720 | |
| C18 packing material (5 µm, 100 Å) | Bruker | PM5/61100/000 | This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient |
| C18 packing material (5 µm, 200 Å) | Bruker | PM5/61200/000 | This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient |
References
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