Summary
Kombine ön-madde izotopik etiketleme ve izobarik etiketleme (cPILOT) izobarik etiketlerin örnek çoğullama kabiliyetini arttıran bir sayısal proteomik stratejisidir. Bu protokol bir Alzheimer hastalığı fare modeli ve vahşi tipli kontrollerden dokulara cPILOT uygulanmasını tarif etmektedir.
Abstract
Hastalık anlayış ve biyomarker keşfi için birçok biyolojik numunelerin analiz etmek giderek artan bir talep vardır. Birden numunelerin eş zamanlı ölçümü yaygın hale gelir ve büyük ölçüde deneysel maliyetleri ve sürelerini azaltmak gelmiş izin kantitatif proteomik stratejileri. Laboratuvarımız geleneksel izotopik etiketleme veya İzobarik etiketleme yaklaşımların örneği çoklama artırır izotopik etiketleme ve izobarik etiketleme (cPILOT) kombine habercisi olarak adlandırılan bir teknik geliştirdi. Küresel cPILOT hücreler, dokular, vücut sıvıları veya bütün organizmalardan gelen örnekleri uygulanmış ve farklı örnek koşullar arasında görece protein bolluk hakkında bilgi verir edilebilir. cPILOT düşük pH'li bir tampon koşulları kullanılarak: 1) ile çalışır seçici dimethylate peptit, N-terminali ve 2)) Malzemeler / Reaktifler bakınız Tablo (ticari olarak temin edilebilen izobarik reaktifler ile lizin kalıntılarının birincil aminler etiket için yüksek pH tampon koşulları kullanılmasına ilişkindir. derecesiMevcut örnek çoğullama kullanılan ön-madde etiket sayısı ve izobarik etiketleme reaktifi bağlıdır. Burada, tek bir analizde fare dokularından 12 örnekleri analiz etmek için, altı-karmaşık izobarik reaktifler ile birleştirilmiş hafif ve ağır dimetilasyon kullanarak 12-karmaşık analizini. Geliştirilmiş çoğullama az deneysel önyargı yanılma ile, daha da önemlisi, deneysel zaman ve maliyet ve azaltarak birçok örnek koşullarına (biyolojik çoğaltır, hastalık evresi, ilaç tedavileri, genotipi veya boyuna zaman noktalarında) arasında karşılaştırma izin verdiği için yararlıdır. Bu çalışmada, küresel cPILOT yaklaşım Alzheimer hastalığı fare modeli ve sokak türü kontrollerden beyin, kalp, ve biyolojik çoğaltır genelinde karaciğer dokuları analiz etmek için kullanılır. Küresel cPILOT diğer biyolojik süreçleri incelemek için uygulanan ve 20'den daha fazla numune numune çoğullama artırmak için adapte edilebilir.
Introduction
Proteomiks genellikle daha iyi hastalık süreçlerini anlamak için kullanılan pek çok numune, enzim kinetiği, post-translasyonel modifikasyonlar, çevresel uyarılara yanıt ve terapötik tedaviler, belirleyici keşif ya da ilaç mekanizmalarına müdahale analizini içerir. Nicel yöntemler örnekleri üzerinden protein seviyelerinde göreli farklarını ölçmek için ve etiketsiz olabilir ya da izotopik etiketleme (metabolik, kimyasal ya da enzimatik) içeren kullanılabilecektir. pek çok örnekler eş zamanlı olarak analiz edilmesine izin verir ve farklı hücreler, dokular, vücut sıvıları veya bütün organizmalardaki örnekler için uygundur, çünkü kararlı izotop etiketleme yöntemleri popülaritesi büyüdü. İzotop etiketleme yöntemleri, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 artış deneysel verim,edinme zamanı, maliyetleri ve deneysel hatayı azaltırken. Bu yöntemler, peptid tepelerinden proteinlerin nispi bolluklarını ölçmek için ön-madde kütle spektrumları kullanın. Bunun aksine, izobarik etiketleme ayıraçları 8, 9, 10 ya da MS / MS veya MS tespit edilir raportör iyonları üreten 3 11 spektrumları ve bu tepe proteinlerin nispi bolluk rapor etmek için kullanılır.
Proteomik çoklama mevcut state-of-the-art 12 10-karmaşık veya 12-karmaşık izobarik etiket analizi 13 ya da bir. Geliştirilmiş örnek çoklayıcı (yani> 10 numune) yöntemleri hücrelerde 18 analizi için başkaları tarafından dokular 14, 15, 16, 17 için laboratuarda geliştirilmiş ve edilmiştir sup>, 19, 20, 21, ya da hedef peptidleri 22 dokular. Biz İsobarik etiketleme (cPILOT) ile kombine öncü izotopik etiketleme denilen gelişmiş bir çoğullama teknik geliştirdi. Küresel cPILOT farklı örnek koşullarında (≥12) 14 üzerindeki tüm proteinlerin nispi konsantrasyonları hakkında bilgi almak için kullanılır. Şekil 1, genel bir cPILOT akışını gösterir. Triptik veya Lys-C peptidler seçici düşük pH 2 ile dimetilasyon N-terminalinde ve yüksek pH değeri 6-karmaşık reaktifler ile lizin kalıntılarında etiketlenir. Bu strateji, deney maliyetleri ve ek azaltmaya yardımcı olur izobarik reaktifler ile analiz edilebilir numune sayısını iki katına, deneysel adımlar ve zamanı azaltır.
oksidatif post-translasyonel modi incelemek için başka yöntemler geliştirdik olarak cPILOT esnektir3-nitrotirosin modifiye edilmiş proteinler 14 ve S-nitrozilasyonuyla (oxcyscPILOT) 23 sistein içeren peptidlerin dahil fications. Ayrıca, bir amino asit, seçici bir yaklaşım, sistein cPILOT (cyscPILOT) 17 geliştirdik. Bir üst iyon 11 veya seçici-y 1 -iyon yöntemi 15 MS 3 alıcı raportör iyon girişimi azaltmak ve cPILOT kantitatif hassaslığını arttırabilir. Düşük çözünürlüklü iyon kapanı araçları da 24 ile de çalışabilir elde etme yönteminde MS 3'ün kullanımı, Orbitrap kütle analizörü ile bir yüksek çözünürlüklü bir cihaz gerektirir.
Daha önce, cPILOT bir Alzheimer hastalığı fare modelinde karaciğer proteinleri 16 çalışma için kullanılmıştır. Burada, periphe rolünü incelemek için beyin, kalp ve karaciğer homojenatlan kullanılarak küresel cPILOT analizi gerçekleştirmek için nasıl tarifAlzheimer hastalığında ry. Bu deney biyolojik çoğaltma içermektedir. Çünkü cPILOT çok yönlülüğü, ilgilenen kullanıcılar biyolojik sorunlar ve sistemlerin bir dizi diğer dokuları incelemek için tekniği kullanabilirsiniz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik Beyanı: Fareler bağımsız, kar amacı gütmeyen biyomedikal araştırma kurumundan alınan ve Pittsburgh Üniversitesi Hayvan Kaynakları Laboratuarı Bölümü yerleştirildiler. Tüm hayvan protokolleri Pittsburgh Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı.
Kimyasal etiketleme için 1. Protein Ekstraksiyonu ve Peptidlerin üretimi
- Doku hücreleri veya vücut sıvılarından protein ekstrakte edilir.
- Mekanik bir homojenleştirici kullanılarak 8 M üre (500 uL) ile fosfat tamponlu tuzlu su içinde doku (örneğin, beyin, kalp, karaciğer) (1 x PBS) 60-90 mg homojenleştirin. Gerekirse Proteaz veya fosfataz inhibitörleri tampona ilave edilebilir. Bu projede, onlar kullanılmamıştır. homojenleştirici için aşağıdaki parametreler kullanın: matrisi boncuklar, 4 m / s, 20 s lize. Kalp doku homojenizasyon kadar 9 döngüleri gerektirebilir.
Not: Proteaz veya fosfataz inhibitörü gerekli olduğu takdirde tampon ilave edilebilir. Onlar bu çalışmada kullanılmamıştır.- yokedici tüpten, doku homojenatının çıkarın ve bir mikro-santrifüj tüpüne aktarılır. 8 M üre ile PBS 100-500 uL tüpler lize durulayın ve doku homojenatı ile durulama çözeltisi birleştirir.
- Homojenize doku santrifüj (9447 x g, 4 ° C, 15 dakika) ve süpernatan toplamak.
- Mekanik bir homojenleştirici kullanılarak 8 M üre (500 uL) ile fosfat tamponlu tuzlu su içinde doku (örneğin, beyin, kalp, karaciğer) (1 x PBS) 60-90 mg homojenleştirin. Gerekirse Proteaz veya fosfataz inhibitörleri tampona ilave edilebilir. Bu projede, onlar kullanılmamıştır. homojenleştirici için aşağıdaki parametreler kullanın: matrisi boncuklar, 4 m / s, 20 s lize. Kalp doku homojenizasyon kadar 9 döngüleri gerektirebilir.
- Üreticinin talimatlarına uygun olarak bir bisinkoninik asit (BCA) deneyi kullanarak protein konsantrasyonunu belirleyin.
Not: protein konsantrasyonu çok yüksek ise, tamponla daha fazla seyreltmek gerekli olabilir. bu dokulardan numuneler için elde edilen konsantrasyonları 6-13 ug / ml arasında idi.- İsteğe bağlı: oran 1 ug standart bir iç kalite kontrol standart (örneğin sığır alfa kazein veya diğer dışsal protein) ekleyin: 100 ug protein örneği.
- Her bir numunenin protein 100 ug (100 x 10 -6 g) ekleyin bireysel mikro santrifüj tüplerini etiketli. hacim, protein konsantrasyonuna bağlı olan (adım 1.2).
- Her bir örnek için (mol oranı örnek 1 reaktifi 40) ditiyotreitol (DTT) ilave edilir. 2 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edilir. Mol oranının hesaplanması 66.5 x 10 3 g / mol, sığır serum albümin protein kütlesinin (BSA), kapalı dayanır.
- Her bir örnek için (mol oranı örnek 1 ayıracı 80) iodoasetamid (IAM) ekleyin. 2 saat boyunca karanlıkta buz üzerinde inkübe edin. Bu reaksiyon, yan reaksiyonları önlemek için 2 saat buz üzerinde gerçekleştirilir.
- Her bir örnek için (mol oranı örnek 1 reaktifi 40), L-sistein ekleyin. 30 dakika için oda sıcaklığında inkübe edilir.
- 2 M bir son konsantrasyona kadar üre seyreltmek için 10 mM CaCl2 (pH 8.2) ile 20 mM Tris tamponu ekleyin
- Ekle L-1-tosilamido-2-feniletil klorometil keton (TPCK) tripsin ile tedavi edilen (50: 1 alt-tabaka her bir numuneye) mol oranı, enzim ve 24 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edilmiştir.
- Flaş dondurma daha sonra işlenene kadar -80 ° C'de sıvı azot ve mağaza örnek tarafından protein sindirimini sönümlenir.
3. Örnek tuz giderme
- formik asit (FA) eklenerek örnekleri yeniden asitleştirin. % 0.1 bir son konsantrasyon elde etmek için yeterli FA ekleyin. Numuneler -80 ° C'de ilk olarak ise, yeniden asitleştirildi numunelerin buz üzerine çözülme.
- De-tuzu olarak daha önce dengeli C18 hidrofilik lipofilik (HLB) 10 mg kartuşları kullanılarak peptidler 16 tarif.
- ~ 10 uL hacme kadar vakum santrifüj (5 Torr, 45 ° C, 77 x g) örnekleri kurutun.
4. dimetilasyon Etiketleme (N-uçlarında)
- yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) ya da nano saf derece su içinde çözülmüş% 1 asetik asit içinde peptidleri (0.25 ug / ml) ile sulandırın. 50 ^ ı kaldırınG yeni bir mikro santrifüj tüpüne (1.5 mL) bölümü ve -80 ° C 'de kalan saklayın.
- 8 60 mM (% 4) CH uL 2 O (% 37 ağırlık / hacim) ya da 60 mM (% 4) 13 CD 2 O (% 20 ağırlık / hacim) hafif ya da ağır dimetilasyon ile etiketlenmesi için numunelere sırasıyla ekleme . Tipik olarak, reaktif 4 uL peptidlerin 25 ug (Adım 4.2, 4.3, 4.6) ilave edilir.
- Sırasıyla hafif ve ağır dimetilasyon, etiketli örnekler, 24 mM NaBH3 CN ya da 24 mM NaBD 3 CN 8 uL ekleyin.
- Vorteks ve oda sıcaklığında ~ 10 dakika boyunca bir tüp çalkalayıcıda sallayın.
- 5 dakika için,% 1 amonyak (~% 28-30 h / h), 16 uL ilave reaksiyonları söndürüldü. Tipik olarak, reaktif 8 uL peptidlerin 25 ug ilave edilir.
- Yeniden asitleştirmek% 5 FA 8 uL eklenmesiyle reaksiyon karışımları (98% v / v).
- Altı numune toplam üretmek için hafif ve ağır dimetile peptidler (Şekil 1) birleştirin. Tablo 1 Bkz
- adım 3.2 ve 3.3 uygun numune tuz giderme gerçekleştirin.
5. Isobaric Etiketleme (Lys kalıntıları)
- tri-etil amonyum bikarbonat (TEAB) tamponu (pH-8.5), 100 mM dimetile peptitlerin 100 ug (1 ug / ml) ile sulandırın.
- Imalatçının protokolünde belirtildiği gibi izobarik reaktifler hazırlayın (Malzeme / Reaktiflerin Tablo bakınız).
- ~ 10 s için peptidler ve vorteks çözündürülmüş izobarik reaktifler (41 uL) ilave edilir. Yaklaşık 1 saat boyunca bir mikro santrifüj tüpü çalkalayıcı üzerinde örnekleri çalkalayın. 8 uL hidroksilamin ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca numune inkübe (ağırlık / hacim,% 10) ile olan reaksiyonları söndürün.
- bir sonraki kullanıma kadar -80 ° C'de tek bir karışım ve tuzunun giderilmesi (Adım 3.1-3.3) veya deposuna altı etiketli örnekleri havuz.
NOT: proteom kapsamını ve derinliğini artırmak için, çok boyutlu bir ayırma stratejisi önerilirgibi kuvvetli katyon değiştirme (SCX).
6. güçlü katyon alışveriş
- Üreticinin protokolü doğrultusunda SCX gerçekleştirin (Malzeme Tablo).
- amonyum format çözeltilerinin ~ 1 mL (20 mM, 40 mM, 60 mM, 80 mM, 100 mM, 150 mM, 250 mM, ve 500 mM),% 10 asetonitril (ACN),% 0.1 FA (pH 3) ile hazırlanır.
- pipet üstünden kırmızı kapağını çıkarın ve ambalaj malzemesi pipet alt kısmına doğru olduğundan emin olmak için bulamaç ambalaj pipet dokunun.
NOT: Kritik: protokolün sonuna kadar pipet kenara atma. - bir mikro santrifüj tüpüne (2 mL) üst kısmına santrifüj adaptörünü ve iç pipet sabitleyin.
- pipet uçlarına SCX sulandırma tamponu 150 mcL ekleyin.
- Oda sıcaklığında (4,000 xg) 6 dakika pipet uçları santrifüjleyin. Bu adımı iki kez daha tekrarlayın ve atık atın.
- p çözündürülürSCX sulandırma 150 uL tampon içinde peptidlerin. pH değeri 3 olduğundan emin olun.
- pipet uçları, santrifüj (6.1.5 bakınız) peptidleri ekleyin ve eluent tutun.
- yeni bir mikro santrifüj tüpüne (2 mL) filtre ve pipet aktarın ve 20 mM amonyum format çözeltisinin 150 uL ekleyin. Oda sıcaklığında (4,000 xg) 6 dakika boyunca santrifüj ve eluent tutun.
- Adımı tekrar 6.1.8 ek yedi kez, amonyum format ardışık konsantrasyonlarda (yani, 40 mM, 60 mM, 80 mM, 100 mM, 150 mM, 250 mM ve 500 mM) kullanılarak.
- mikro santrifüj tüplerine (1.5 ml) sekiz SCX fraksiyonlar aktarın ve santrifüj buharlaştırma kullanarak bunları konsantre (adım 3.3).
7. Sıvı Kromatografi-Tandem Kütle Spektrometresi (LC-MS / MS) ve MS3
- % 0.1 FA, filtre ile kütle spektrometresi dereceli su peptitleri sulandırın ve bir otomatik numune şişesine koyun. foll olarak filtre peptidlerakımlarının:
- 0.65 um bir filtre ihtiva eden bir mikro santrifüj tüpüne yeniden peptidleri ekleyin (Malzeme Tablo).
- 1 dakika için 12,000 x g'de santrifüjleyin peptidler. Filtreyi çıkarın atmak ve bir oto-numune şişesine süzülür peptidler ekleyin.
- aşağıdaki mobil faz olarak tamponlar hazırlayın:% 3,% 0.1 FA (A) (v / v) ACN ve% 100 ACN% 0.1 FA (B).
- C18 malzeme (5 um, 200 A gözenek boyutu) ile 2 cm paketlenmiş tuzak kolonuna her SCX fraksiyon numunenin 6 uL enjekte edilir.
Not: aşağıdaki gibi tuzak örnek bir temizlik: 3 dak,% 0 B; 2B, sıvı kromatografi sistemi kullanılarak 3 uL / dakika (Malzeme Tablo). - analitik ayırma yöntemi çalıştırın. Cı-18 malzeme ile dolu, bir 75 um id x 13.2 cm lazer çekilmiş ucu eritilmiş silis kılcal kolonu (5 um, 100 A) kullanın. gradyanı: 0-5 dakika,% 10 B; 5-40 dakika,% 10-15 B; 40-90 dakika, 15-25% B; 90-115 dakika, 25-% 30 B; 115-130 dak, 30-60% B; 130-135 dak, 60-80% B; 135-145 dakika,% 80 B, 145-150 dak, 80-10% B; 150-180 dakika,% 10 B; 300 nL / dakika, 180 dakika.
- Analitik ayırma yöntemi çalışırken kütle spektrometresi için veri toplama çalıştırın.
Not: 400-1,600 m / z, 60.000 çözünürlük, otomatik kazanç kontrol (AGC), 1 x 10 6 iyonları, maksimum püskürtme süresi 500 ms hedef aşağıdaki gibidir: MS araştırması tarama parametrelerdir. Aşağıdaki gibi CID-MS / MS parametreleri şunlardır: en 1-7 ya da en iyi 8-14 veri bağımlı alıcı (DDA), 3 m / z yalıtım genişliği, 500 minimum sinyal,% 35 normalize çarpışma enerjisi (NCE), 0.25 aktivasyon q , 10 ms'lik aktivasyon zaman, 3 x 10 4 AGC, 50 ms maksimum enjeksiyon süresi. Aşağıdaki gibi HCD-MS 3 için parametreler şunlardır: 200 minimum sinyal, 4 m / z izolasyon genişliği,% 60 NCE, 0.1 aktivasyon süresi, 3 x 10 5 AGC, 250 ms IT, 300-1,300 m / z MS / MS seçim aralığı un-parçalı ana iyonu dahil değildir.
8. Veri Analizi 16
- Böyle fare UniProt gibi uygun bir veritabanına karşı protein analizi yazılımı kullanılarak RAW dosyalarını arayın.
NOT: Hafif ve ağır dimetilated peptidler aramak için her RAW dosya için iki iş akışı oluşturmak için önemlidir. - Aşağıdaki parametreler kullanılarak RAW dosyalarını Arama: iki cevapsız bölünmeler, peptid kütle aralığı 300-6.000 Da, 15 ppm, ana kütle toleransı, 1 Da parçalanma toleransı ile tripsin. Statik modifikasyonlar: açık dimetilasyon (28,031 peptit N-ucu) veya heavy dimetilasyon (36,076 Da, peptit N-ucu), carbamidomethyl (57,021 Da, C).
Not: Bazı durumlarda ağır dimetile zirvesidir ~ 7 Da (35,069 Da, peptit N-ucu) ışık dimetile tepe noktasından ve böylece ağır dimetile peptidler için arama akışı içine dahil edilmelidir. Dinamik modifikasyonlar oksidasyon (15,995 Da, E), 6-karmaşık izobarik etiketi (229,163 Da, K). Yanlış keşif oranlarını elde etmek için bir yem veritabanı arama (örneğin 1, 5%) ve izobarik etiketlerin haberci iyon yoğunlukları aramak için kantitasyon düğümü içerir. - istatistik
- amacıyla bir elektronik tablo programa İhracat verileri proteini raportör iyon değerlerini normalize etmek. Her bir protein için, sırası ile, iç standart iç standart veya ham raportör iyon yoğunluklarının ortalama oranı ile medyan raportör iyon oranlarına veya ham raportör iyon yoğunluklar ya bölün. Bu tür bir elektronik çizelge programı Pers olarak uygun istatistiksel yazılım kullanıneus, ya da R örnek koşullar arasında önemli değişiklikler tespit etmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
cPILOT N-terminus lisin kalıntılarında etiket peptidleri kimyasal olarak amin bazlı kimyası kullanır ve örnek çoğullama kabiliyetini artırır. Şekil 2, bir Alzheimer hastalığı fare modeli ve vahşi tipli kontrollerden beyin, kalp, karaciğer ve bir doku 12-karmaşık cPILOT analizinden elde edilen temsili MS verilerini gösterir. Tablo 1'de gösterildiği gibi, Alzheimer hastalığı ve vahşi tip fareler için iki biyolojik çoğaltır Bu 12 plex analize dahil edilmiştir. Şekil 2A, peptidin içine dahil edilmiş, tek bir dimetil grubuna işaret 4 m / z aralığı ile ayrılan bir çift yüklü tepe çiftini göstermektedir. hafif ve bu dil çiftindeki ağır dimetile tepe Hem CID ile bağımsız bir şekilde, izole edilmiş ve parçalıdır. Dimetile Peptidlerin her birisi için, MS / MS verileri Şekil 2B ve C olarak gösterilmiştir. Arama sonuçları bu pai belirtmekpiklerin R, (dimetil) ELNYFAK (izobarik etiket 6) hafif ve ağır dimetile tepe için benzer olan proteinin fosfogliserat kinaz 1. En yoğun parça iyon y 3+ peptit aittir. Bu pikler HCD-MS 3 ayrıca izole edilir ve Şekiller 2D ve 2E'de gösterildiği gibi raportör iyonları (m / z 126-131) gözlemlenmiştir. MS 3 spektrumun iki seti 12 numuneleri hakkında bilgi almak için gereklidir. Bu örnekte, beyin, karaciğer ve kalp dokuları için haberci iyon oranları (AD / ağırlık) (Alzheimer hastalığı / Yabani tip kontrol) iki biyolojik çoğaltır arasında benzerdir. her bir karşılaştırma için kat-değişim değerleri karaciğer düzeyleri daha düşük iken, beyin ve kalp fosfogliserat kinaz 1 seviyeleri, AD farelerde daha yüksek olduğunu göstermektedir.
Figu1 re: Proteomiks akışı cPILOT kullanılmıştır. Bir örnek olarak, bu iş akışı 12 bireysel numunelerin analizini özetlenmektedir. Dokular, hücreler veya vücut sıvılarından proteinler ekstre edilir ve uygun bir protein standardı (örneğin, sığır alfa-kazein) ilave edilir. Proteinler tripsin kullanılarak sindirilir. Peptidler TMT 6 -plex (pH 8.5) kullanarak, hafif ya da ağır dimetilasyon (pH 2.5) ve lizin kalıntıları ile kullanarak, N-terminalinde etiketlenir. Etiketli peptitlerin SCX RP-LC-MS / MS ve MS 3 tek bir karışım ve konu birleştirilir. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Şekil 2: beyin, kalp, ve Alzheimer hastalığı fare modeli ve vahşi tip kontrol karaciğerlerinden peptidlerin Örnek cPILOT verileri. (A) ', m / z 643,854 ve 647.875 piklere ile temsil edilen, hafif ve ağır dimetile peptidleri gösteriyor. Dolayısıyla bu peptidler peptid teşhisini temin CID-MS / MS spektrumları (B ve C), üreten, izole edilmiş, seçilen ve parçalanmış edildi. MS / MS aşamasında hafif ve ağır dimetile peptidlerin en yoğun fragman iyonun ilave bir seçimi, izolasyon ve parçalanma sırasıyla HCD-MS 3 spektrumlarını (D ve E) oluşturulur. Peptid dizisi, T (dimetil) ELNYFAK (izobarik etiket 6) ve kinaz 1. fosfogliserat ait bu şekilde daha büyük bir sürüm görüntülemek için tıklayın.
| Isobaric Reaktif0; | ||||||
| 126 | 127 | 128 | 129 | 130 | 131 | |
| Işık dimetilasyonu | WT a | AD b | WT | AD | WT | AD |
| beyin | kalp | karaciğer | ||||
| Ağır dimetilasyonu | WT | AD | WT | AD | WT | AD |
| kalp | karaciğer | beyin | ||||
| Doku ya vahşi tip kontrol (WT) a veya Alzheimer hastalığı fare (AD), b. | ||||||
Tablo 1: AD ve WT Beyin, Kalp ve Karaciğer Dokuların cPILOT gruplama.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
cPILOT fazla 12 farklı numune eş zamanlı olarak ölçülmesini sağlar. peptidlerin N-terminali ve hem de lizin kalıntılarının başarılı etiketleme sağlamak amacıyla, reaksiyonların her set için doğru pH değerine sahip olması ve peptit etiketleme için ilk dimetilasyon reaksiyonu gerçekleştirmek için zorunludur. N-ucunda seçici dimetilasyon (± 0.2) ~ 2.5 bir pH değerine sahip olması ile gerçekleştirilir. Bu lisin üzerindeki amino gruplarının pKa farklılıklarını ve N-terminali kullanılmasıyla elde edilir. pH değeri 2.5 'de, lizin aktif (pKa ~ 10.5); pH, hafif (örneğin pH 5-7) asidik ya da bazik bir, ancak, N-terminali ve lizin kalıntıları hem dimetile edilecektir. izobarik etiketleme düşük pH değerlerinde birinci gerçekleştirilir, buna ek olarak, N-terminali izobarik etiketi ve lizin kalıntıları dimetilleştirilebilmektedir sahip olacak. Bu B-iyonlar seçilmesi gerekir gibi MS 3 seçilmektedir az parçalarının neden olabilir. dimetil nispi maliyetiasyon reaksiyonlar, ticari izobarik reaktifler kıyasla daha ucuzdur. Bir 100 ug başına bütün izobarik reaktif flakon kullanmak mümkün olmakla birlikte, aynı zamanda benzer etiketleme verimliliği ile 100 ug başına reaktif flakonun yansı kullanılarak başarıya sahiptir. Bu önemli ölçüde bireysel cPILOT deneyler için maliyetleri azaltmak için yardımcı olur ve daha fazla numune analiz edilmesini sağlar. Ayrıca daha önce 14 gösterdiği gibi diğer izobarik etiketleme reaktifleri Bu protokolde kullanılan İzobarik reaktif yerine kullanılabileceğini dikkat etmek önemlidir. yüksek etiketleme ve etiketleme verimliliği sağlamak için, hızlı bir şekilde numunelerine reaktif eklemek önemlidir. Numuneler yaklaşık aynı tepki süresine sahip olması için bu izin verecektir. Kantitatif amacıyla, her bir örnek dimetilasyon izobarik ve etiketleme adımları numuneler havuzu özdeş özellikle önceden tedavi edilmelidir. Son olarak, not edilmelidir ki requir ilk adımda aynı anda pek çok numune çalışmaes dikkatli kullanıcı beceri ve dikkat işlemeyi örnek.
En ideal senaryo 12 örnek üzerinde karışımı içinde, her bir protein için raportör iyonları elde etmektir. Ancak, bu proteinlerin çok sayıda durum böyle değildir. kantitatif cPILOT için bilgileri ve diğer gelişmiş çoğullama yaklaşan ile tespit peptidlerin sayısı örnek tipi, örnek parçalanması ve işlem adımları, MS verileri elde etme yöntemleri ve alet tipi de dahil olmak üzere çeşitli faktörlere bağlıdır. Dimetilasyon izobarik ve etiketleme adımlar,% 95-99 aralığında bir yüksek peptit etiketleme verimliliği sahip olmakla birlikte, hala ~ raportör iyon bilgi içermez, MS 3 verilerin% 20. Bu izobarik reaktifin bir esas neden arginin-sonlu peptidleri oluşturan tripsin kullanılarak kısmen bağlıdır. Bu protein kimlikleri 25 muhtemel bir ödünleşime ile, örneğin lysC gibi başka enzimleri kullanılarak çözülebilir. Ayrıca ağır içindimetile peptidler, parçalanma için seçilmiş en yüksek farklı yoğunluklarda ve MS3 aşamada gözlenen raportör iyon yoğunlukları etkileyecek M ya da M-1 pik, olabilir. Böylece, bazı örnekler için algılanmaz bir düşük yoğunluklu raportör iyonlar olabilir. Bu gibi durumlar, genellikle yaygın MS 3 adım için izole edilir, düşük yoğunluklu MS / MS fragmanları gözlenmiştir. Bu sorun için büyük bir çözeltisi yerine, MS 3 tek çentik seçimi kullanarak, çoklu bir çentik ya da birden fazla MS kullanımı tribrid kütle spektrometresi, dahil edilmiştir / MS 26 parçaları.
Özellikle (ticari izobarik reaktifler ile 20 kadar, yani,) tek bir analizde karşılaştırılabilir numune sayısı açısından ve kullanılan doku tipleri ile cPILOT yaklaşımda çok yönlü bir çok. Biz beyninden, kalbinden doğru kantitatif bilgi elde etmek kolay olduğunu gösterdi veBir hastalığı bağlamında aynı analizde karaciğer dokuları. Bu yöntem, benzer şekilde diğer çoğullama yöntemlerine, bir kerede çok sayıda örneğin analiz edilmesine izin vermektedir, ve hücreler, dokular, vücut sıvıları veya bütün organizmalardan gelen numuneler için de geçerlidir. Buna ek olarak, cPILOT etiketli peptidler düşük bir 24 ya da yüksek çözünürlük (60,000) aleti kullanılarak analiz edilmesi mümkün bulunmaktadır. Buna karşılık, diğer çoğullama yöntemleri kullanılarak başarılı bir ölçümünün elde izotop etiketlere çok yüksek çözünürlükte 20 veya erişimi olan bir alet gerektirir numunenin belirli bir tip (yani, hücre) 18, sınırlı olabilir. cPILOT hastalığı anlayış, biyolojik belirtileri bulmaya, bir ilaç ya da terapötik müdahale veya birçok zaman noktalarındaki uzunlamasına değişikliklere tepki olarak ilgilenen kullanıcılar için mükemmeldir. Ayrıca, büyük bir av tüfeği proteomik (N büyük, binlerce yüzlerce) klinik örneklerde, cP analizleriILOT deneysel maliyetleri ve süreyi azaltmak için uygun olabilir. Gelecekte, cPILOT mevcut ve yeni izotopik izobarik ve etiketler kullanılarak numune daha büyük bir sayı multipleks genişletilecektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar herhangi bir çıkar var.
Acknowledgments
Yazarlar RASR için Pittsburgh Başlangıç Fon Üniversitesi ve NIH, NIGMS R01 hibe (GM 117191-01) kabul eder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Water - MS Grade | Fisher Scientific | W6-4 | 4 L quantity is not necessary |
| Acetonitrile - MS Grade | Fisher Scientific | A955-4 | 4 L quantity is not necessary |
| Acetic Acid | J.T. Baker | 9508-01 | |
| Ammonium hydroxide solution (28 - 30%) | Sigma Aldrich | 320145-500ML | |
| Ammonium formate | Acros Organics | 208-753-9 | |
| Formic Acid | Fluka Analytical | 94318-250ML-F | |
| BCA protein assay kit | Pierce Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| Urea | Biorad | 161-0731 | |
| Tris | Biorad | 161-0716 | |
| Dithiothreiotol (DTT) | Fisher Scientific | BP172-5 | |
| Iodoacetamide (IAM) | Acros Organics | 144-48-9 | |
| L-Cysteine | Sigma Aldrich, Chemistry | 168149-25G | |
| L-1-tosylamido-2 phenylethyl cholormethyl ketone (TPCK)-treated Trypsin from bovine pancreas | Sigma Aldrich, Life Science | T1426-100MG | |
| Formaldehyde (CH2O) solution; 36.5 - 38% in H2O | Sigma Aldrich, Life Science | F8775-25ML | |
| Formaldehyde (13CD2O) solution; 20 wt % in D2O, 98 atom % D, 99 atom % 13C | Sigma Aldrich, Chemistry | 596388-1G | |
| Sodium Cyanoborohydride; reagent grade, 95% | Sigma Aldrich | 156159-10G | |
| Sodium Cyanoborodeuteride; 96 atom % D, 98% CP | Sigma Aldrich, Chemistry | 190020-1G | |
| Strong Cation Exchange (SCX) spin tips sample prep kit | Protea BioSciences | SP-155-24kit | |
| Triethyl ammonium bicarbonate (TEAB) buffer | Sigma Aldrich, Life Science | T7408-100ML | |
| Isobaric Tagging Kit (TMT 6 plex) - 6 reactions (1 x 0.8 mg) | Thermo Fisher Scientific | 90061 | |
| Hydroxylamine hydrochloride | Sigma Aldrich, Chemistry | 255580-100G | |
| Standard vortex mixer | Fisher Scientific | 2215365 | any mixer can be used |
| Oasis HLB 1 cc (10 mg) extraction cartridges | Waters | 186000383 | These are C18 cartridges |
| Visiprep SPE vacuum manifold, DL (disposable liner), 24 port model | Sigma Aldrich | 57265 | A 12 port model is also sufficient |
| Speed-vac | Thermo Scientific | SPD1010 | any brand of speed vac is sufficient |
| Water bath chamber | Thermo Scientific | 2825/2826 | Any brand of a water bath chamber with controlled temperatures is sufficient. |
| Mechanical Homogenizer (i.e. FastPrep-24 5G) | MP Biomedicals | 116005500 | |
| Eksigent Nano LC - Ultra 2D with Nano LC AS-2 autosampler | Sciex | - | This model is no longer available. Any nano LC with an autosampler is sufficient. |
| LTQ Orbitrap Velos Mass Spectrometer | Thermo Scientific | - | This model is no longer available. Other high resolution instruments (e.g. Orbitrap Elite, Orbitrap Fusion, or Orbitrap Fusion Lumos) can be used. |
| Protein software (e.g. Proteome Discoverer) | Thermo Scientific | IQLAAEGABSFAKJMAUH | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | AL54 | |
| Stir plate | VWR | 12365-382 | Any brand of stir plates are sufficient |
| pH meter (Tris compatiable) | Fisher Scientific (Accumet) | 13-620-183 | Any brand of a pH meter is sufficient |
| pH 10 buffer | Fisher Scientific | 06-664-261 | Any brand of pH buffer 10 is sufficient |
| pH 7 buffer | Fisher Scientific | 06-664-260 | Any brand pH buffer 7 is sufficient |
| 1.5 mL eppendorf tubes, 500 pk | Fisher Scientific | 05-408-129 | Any brand of 1.5 mL eppendorf tubes are sufficient |
| 0.6 mL eppendorf tubes, 500 pk | Fisher Scientific | 04-408-120 | Any brand of 0.6 mL eppendorf tubes are sufficient |
| 0.65 µm Ultrafree MC DV centrifugal filter units | EMD Millipore | UFC30DV00 | |
| 2 mL microcentrifuge tubes, 72 units | Thermo Scientific | 69720 | |
| C18 packing material (5 µm, 100 Å) | Bruker | PM5/61100/000 | This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient |
| C18 packing material (5 µm, 200 Å) | Bruker | PM5/61200/000 | This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient |
References
- Ong, S. -E., et al. Stable Isotope Labeling by Amino Acids in Cell Culture, SILAC, as a Simple and Accurate Approach to Expression Proteomics. Mol Cell Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).
- Koehler, C. J., Arntzen, M. Ø, de Souza, G. A., Thiede, B. An Approach for Triplex-Isobaric Peptide Termini Labeling (Triplex-IPTL). Anal. Chem. 85 (4), 2478-2485 (2013).
- Langen, H. F., Evers, M., Wipf, S., Berndt, B., P, From Genome to Proteome 3rd Siena 2D Electrophoresis Meeting. , Wiley-VCH. Weinheim, Germany, Siena. (1998).
- Yao, X., Freas, A., Ramirez, J., Demirev, P. A., Fenselau, C. Proteolytic 18O Labeling for Comparative Proteomics: Model Studies with Two Serotypes of Adenovirus. Anal. Chem. 73 (13), 2836-2842 (2001).
- Reynolds, K. J., Yao, X., Fenselau, C. Proteolytic 18O Labeling for Comparative Proteomics: Evaluation of Endoprotease Glu-C as the Catalytic Agent. J. Proteome Res. 1 (1), 27-33 (2002).
- Gygi, S. P., et al. Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags. Nat Biotech. 17 (10), 994-999 (1999).
- Schmidt, A., Kellermann, J., Lottspeich, F. A novel strategy for quantitative proteomics using isotope-coded protein labels. PROTEOMICS. 5 (1), 4-15 (2005).
- Thompson, A., et al. Tandem Mass Tags: A Novel Quantification Strategy for Comparative Analysis of Complex Protein Mixtures by MS/MS. Anal. Chem. 75 (8), 1895-1904 (2003).
- Ross, P. L., et al. Multiplexed Protein Quantitation in Saccharomyces cerevisiae Using Amine-reactive Isobaric Tagging Reagents. Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).
- Xiang, F., Ye, H., Chen, R., Fu, Q., Li, L. N,N-Dimethyl Leucines as Novel Isobaric Tandem Mass Tags for Quantitative Proteomics and Peptidomics. Anal. Chem. 82 (7), 2817-2825 (2010).
- Ting, L., Rad, R., Gygi, S. P., Haas, W. MS3 eliminates ratio distortion in isobaric multiplexed quantitative proteomics. Nat Meth. 8 (11), 937-940 (2011).
- McAlister, G. C., et al. Increasing the Multiplexing Capacity of TMTs Using Reporter Ion Isotopologues with Isobaric Masses. Anal. Chem. 84 (17), 7469-7478 (2012).
- Frost, D. C., Greer, T., Li, L. High-Resolution Enabled 12-Plex DiLeu Isobaric Tags for Quantitative Proteomics. Anal. Chem. 87 (3), 1646-1654 (2015).
- Robinson, R. A. S., Evans, A. R. Enhanced Sample Multiplexing for Nitrotyrosine-Modified Proteins Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging. Anal. Chem. 84 (11), 4677-4686 (2012).
- Evans, A. R., Robinson, R. A. S. Global combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging (cPILOT) approach with selective MS(3) acquisition. Proteomics. 13 (22), 3267-3272 (2013).
- Evans, A. R., Gu, L., Guerrero, R., Robinson, R. A. S. Global cPILOT analysis of the APP/PS-1 mouse liver proteome. PROTEOMICS - Clin Appl. 9 (9-10), 872-884 (2015).
- Gu, L., Evans, A. R., Robinson, R. A. S. Sample Multiplexing with Cysteine-Selective Approaches: cysDML and cPILOT. J. Am. Soc Mass Spectrom. 26 (4), 615-630 (2015).
- Dephoure, N., Gygi, S. P. Hyperplexing: A Method for Higher-Order Multiplexed Quantitative Proteomics Provides a Map of the Dynamic Response to Rapamycin in Yeast. Sci Signal. 5 (217), rs2 (2012).
- Hebert, A. S., et al. Neutron-encoded mass signatures for multiplexed proteome quantification. Nat Meth. 10 (4), 332-334 (2013).
- Merrill, A. E., et al. NeuCode Labels for Relative Protein Quantification. Mol Cell Proteomics. 13 (9), 2503-2512 (2014).
- Braun, C. R., et al. Generation of Multiple Reporter Ions from a Single Isobaric Reagent Increases Multiplexing Capacity for Quantitative Proteomics. Analytical Chemistry. 87 (19), 9855-9863 (2015).
- Everley, R. A., Kunz, R. C., McAllister, F. E., Gygi, S. P. Increasing Throughput in Targeted Proteomics Assays: 54-Plex Quantitation in a Single Mass Spectrometry Run. Anal. Chem. 85 (11), 5340-5346 (2013).
- Gu, L., Robinson, R. A. S. High-throughput endogenous measurement of S-nitrosylation in Alzheimer's disease using oxidized cysteine-selective cPILOT. Analyst. 141 (12), 3904-3915 (2016).
- Cao, Z., Evans, A. R., Robinson, R. A. S. MS3-based quantitative proteomics using pulsed-Q dissociation. Rapid Commun Mass Spectrom. 29 (11), 1025-1030 (2015).
- Swaney, D. L., Wenger, C. D., Coon, J. J. Value of Using Multiple Proteases for Large-Scale Mass Spectrometry-Based Proteomics. J. Proteome Res. 9 (3), 1323-1329 (2010).
- McAlister, G. C., et al. MultiNotch MS3 Enables Accurate, Sensitive, and Multiplexed Detection of Differential Expression across Cancer Cell Line Proteomes. Anal. Chem. 86 (14), 7150-7158 (2014).
