Methodenartikel

Die Verwendung eines β-Lactamase-basierte Conductimetric Biosensor-Assays, biomolekulare Wechselwirkungen zu erkennen

DOI:

10.3791/55414

⸱

1. Februar 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Life Science Department, University of Liège, 2Institute of Condensed Matter and Nanoscience, Catholic University of Louvain, 3Laboratory of Clinical Microbiology, Catholic University of Louvain, 4Biotechnology Department, CER Group

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dabei berichten wir über eine neue Methode, um Protein-Protein-Interaktionen mit Hilfe eines conductimetric Biosensors basierend auf die β-Lactamase-Hybridtechnologie zu studieren. Diese Methode beruht auf der Freisetzung von Protonen bei der Hydrolyse des β--Lactame.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biosensoren werden immer wichtiger und implementierte in verschiedenen Bereichen wie Erregernachweis, molekulare Diagnostik, Umweltüberwachung und Kontrolle der Lebensmittelsicherheit. In diesem Zusammenhang wird β-Lactamases als effiziente Reporter Enzyme in mehreren Studien der Protein-Protein-Interaktion verwendet. Darüber hinaus fördert ihre Fähigkeit, Einfügungen von Peptiden oder strukturierte Proteine/Domains stark anzunehmen die Nutzung dieser Enzyme um Chimären Proteinen zu erzeugen. In einer aktuellen Studie einer einzelnen Domäne Antikörper-Fragment in der Bacillus Licheniformis BlaP β-Lactamase eingelegt werden. Diese kleinen Domänen, auch genannt Nanobodies, gelten als Antigen-bindenden Domänen einzelne Kette Antikörper von Camelids. Wie üblich Doppelkette Antikörper zeigen sie hohen Affinitäten und Besonderheiten für ihre Ziele. Das daraus resultierende Chimäre Protein ausgestellt eine hohe Affinität gegen sein Ziel unter Beibehaltung der β-Lactamase-Aktivität. Dies deutet darauf hin, dass die gemeinnützige und β-Lactamase Moieties funktionsfähig bleibt. In der vorliegenden Arbeit berichten wir ein detailliertes Protokoll, das unsere Hybrid-β-Lactamase-System der Biosensor-Technologie kombiniert. Die spezifische Bindung der gemeinnützige Ziel kann dank einer conductimetric Messung der Protonen durch die katalytische Aktivität des Enzyms freigegeben erkannt werden.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biosensoren sind analytische Geräte, die eine Bio-molekulare Interaktion mit physikalischen oder chemischen Signalgeber als Wandler1kombinieren. Die aufgezeichneten Signale können dann interpretiert und umgewandelt, um die Wechselwirkungen zwischen den freien und immobilisierten Partnern zu überwachen. Die meisten der Biosensoren beinhalten die Verwendung eines Antikörpers Analyten wie Hormone oder andere Erreger Marker2zu erkennen. Anderen Sensor-Formate können verwendet werden und sind Masse-basierte, magnetische, optische oder elektrochemische Biosensoren. Letztere gehören zu den am häufigsten verwendeten Sensoren und Funktion durch eine verbindliche Veranstaltung in ein elektrisches Signal umwandeln. Die Aufführungen und Empfindlichkeiten aller Antikörper-basierten Biosensoren sind stark abhängig von im Wesentlichen zwei Parameter: (i) die Qualität des Antikörpers und (Ii) die Eigenschaften des Systems verwendet, um das Signal2zu generieren.

Antikörper sind hochmolekulare Masse dimeres Proteine (150 – 160 kDa), die aus zwei schweren Ketten und zwei leichten Ketten bestehen. Die Interaktion zwischen den leichten und schweren Ketten wird meist durch hydrophobe Wechselwirkungen sowie eine konservierte Disulfid Bindung stabilisiert. Jede Kette enthält eine Variable Domäne, die mit dem Antigen im Wesentlichen über drei hypervariablen Regionen benannt ergänzende Bestimmung Regionen (CDR1-2-3) interagiert. Trotz der zahlreichen Fortschritte auf dem Gebiet der großen Ausdruck in voller Länge Antikörper mit kostengünstigen Expressionssysteme (z. B. E. Coli) führt oft zu der Produktion von instabilen und aggregierte Proteine. Deshalb verschiedene Antikörperfragmente entwickelt haben, wie z. B. Single-Chain Variable3 (ScFvs ≈ 25 kDa) Fragmente. Sie bestehen aus den Variablen Domänen von bzw. einem schweren und einem leichten Ketten, die durch eine synthetische Aminosäure-Sequenz kovalent verknüpft sind. Aber diese Fragmente häufig zeigen eine schlechte Stabilität und haben die Tendenz zu aggregieren, da sie einen Großteil ihrer hydrophoben Region zu Lösungsmittel4aussetzen. In diesem Zusammenhang scheinen einzelne Kette Kameliden Antikörperfragmente, genannt Nanobodies oder FHKW, hervorragende Alternativen zu ScFvs. Diese Domains entsprechen den Variablen Domänen der Kameliden Single-Kette Antikörper. Im Gegensatz zu herkömmlichen Antikörper Kameliden Antikörper sind frei von Lichterketten und enthalten nur zwei schwere Ketten5. Nanobodies sind daher die kleinste Monomeren Antikörperfragmente (12 kDa) Antigen ähnlich dem des herkömmlichen Antikörper6Affinität binden. Darüber hinaus präsentieren sie verbesserte Stabilität und Löslichkeit im Vergleich zu anderen Full-length Antikörper oder Antikörperfragmente. Zu guter Letzt lassen ihre kleine Größe und erweiterte CDR3 Schlaufen kryptische Epitope erkennen und binden Sie an Enzym aktiven Zentren7,8. Heute, diese Domains erhalten große Aufmerksamkeit und wurden auf die Biosensor-Technologie kombiniert. Z. B. Huang Et Al. entwickelten eine gemeinnützige-basierten Biosensor für die Erkennung und Quantifizierung von menschlichen Prostata-spezifischen Antigens (PSA)9.

Wie bereits erwähnt-oben ist ein wichtiger Parameter in Biosensor-Assays die Effizienz des Systems verwendet, um das elektrische Signal zu erzeugen. Aus diesem Grunde Enzymbasis elektrochemische Biosensoren immer größer werdende Aufmerksamkeit erregt haben und für verschiedene Anwendungen wie Gesundheit, Lebensmittelsicherheit und Umweltüberwachung verbreitet. Diese Biosensoren verlassen sich auf die katalytische Hydrolyse eines Substrats durch ein Enzym, das elektrische Signal zu generieren. In diesem Zusammenhang β-Lactamases erwiesen sich bestimmten, sensiblen und einfacher umzusetzen experimentell als viele andere Enzyme z. B. alkalische Phosphatase oder Meerrettich Peroxidase10. Β-Lactamases sind Enzyme, die für bakterielle Resistenz gegen β-Lactam-Antibiotika sind durch sie hydrolysieren. Sie sind Monomere, sehr stabil, effizient, und klein. Darüber hinaus generieren Domäne/Peptid Einfügungen in β-Lactamases bifunktionale Chimäre Proteinen, die gezeigt wurden, und effiziente Werkzeuge, um Protein-Ligand-Interaktionen zu untersuchen. In der Tat, haben jüngste Studien gezeigt, dass Einfügen von Variablen Antikörperfragmente in TEM1 β-Lactamase Ergebnisse in ein chimäres Protein, die in der Lage, mit hoher Affinität zu ihren Ziel-Antigen gebunden bleibt. Interessanterweise zeigte die Antigen-Bindung allosterische Verordnung TEM1 katalytische Aktivität11,12zu induzieren. Darüber hinaus zeigten wir in mehreren Studien, dass Protein Domäne einführen in eine permissive Schleife des Bacillus Licheniformis BlaP β-Lactamase Funktionsproteine Chimären erzeugt, die gut geeignet zur Überwachung von Protein-Ligand-Interaktionen13 ,14. Wir eingefügt vor kurzem eine gemeinnützige, Fahrerhaus-Lys3, in diesem freizügigen Insertionsstelle BlaP15benannt. Diese gemeinnützige zeigte an Henne-Ei-weiß Lysozym (HEWL) binden und seine enzymatische Aktivität16zu hemmen. Wir haben gezeigt, dass das erzeugte Hybrid-Protein, benannt BlaP-Fahrerhaus-Lys3, eine hohe Spezifität erhalten / Affinität gegen HEWL, während die β-Lactamase-Aktivität blieb unverändert. Dann haben wir erfolgreich kombiniert die β-Lactamase-Hybridtechnologie, eine elektrochemische Biosensor und zeigte, dass die Höhe der erzeugte elektrische Signal abhängig von der Interaktion zwischen BlaP-Fahrerhaus-Lys3 und HEWL auf einer Elektrode immobilisiert. Hydrolyse von β-Lactam-Antibiotika durch BlaP induziert in der Tat eine Proton-Release, die in einem quantitativen elektrisches Signal umgewandelt werden kann. Diese Kombination von β-Lactamase Hybridtechnik mit eine elektrochemische Biosensor ist schnell, empfindlich, quantitative und ermöglicht Echtzeit-Messung von das erzeugte Signal. Diese Methode wird hier beschrieben.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

(1) Protein Probenvorbereitung

  1. Produzieren Sie und reinigen Sie das Hybrid-Protein BlaP-Fahrerhaus-Lys3 wie in unserer vorherigen Studie15berichtet. Speichern Sie das Protein in 50 mM Phosphat-Puffer pH 7.4 mit folgender Zusammensetzung: 0,24 g KH2PO4 in 800 mL destilliertem Wasser aufgelöst, 1,44 g Na2HPO4 , 8 g NaCl und 0,2 g KCl beheben den pH-Wert der Lösung auf 7,4 vor Anpassung der letzte Band der Lösung 1 sterilisieren L. Filter die Proteinlösung.
  2. Bereiten Sie eine Henne Eiweiß Lysozym (HEWL) Stammlösung. Lösen Sie 100 mg (40.000 Einheiten/mg) im Handel erworbenen HEWL in 10 mL von Phosphat Puffer Kochsalzlösung (PBS siehe Schritt 2.1.1 auf). Sterilisieren Sie die Proteinlösung durch Filtration, die Verwendung von Filtern mit einem Cutoff von 0,22 μm.

2. Biosensor-Assays

  1. Lösung und Puffer Vorbereitung
    1. Bereiten Sie 50 mM PBS durch 8 g NaCl, 0,2 g KCl und 1,44 g Na2HPO40,24 g KH2PO4 in 800 mL destilliertem Wasser auflösen. Passen Sie auf pH 7.4 mit 1 N HCl oder 1 N NaOH vor dem Einstellen der Lautstärke der Lösung 1 L. Filter sterilisieren und bei 4 ° c lagern
    2. Bereiten Sie eine Sättigung/blockieren Lösung durch Auflösen von 3 g Casein Hydrolysat in 100 mL PBS zubereitet wie oben beschrieben (siehe Schritt 2.1.1). Filter zu sterilisieren und Lagerung bei 4 ° C.
    3. Bereiten Sie eine verbindliche Lösung durch Auflösen von 1 g Casein Hydrolysat in 100 mL PBS zubereitet wie oben beschrieben (siehe Schritt 2.1.1). Filter zu sterilisieren und Lagerung bei 4 ° C.
    4. Vorbereiten eine Waschlösung (0,1 % Tween - PBS) durch Zugabe von 100 μl der Tween 20 (100 %) in 100 mL PBS zubereitet wie oben beschrieben (siehe Schritt 2.1.1). Shop bei 4 ° C.
    5. Bereiten Sie eine Elektrode Vorbereitung Lösung (1 % Triton x-100-PBS) durch Zugabe von 1 mL der Triton x-100 (100 %) in 100 mL PBS zubereitet wie oben beschrieben (siehe Schritt 2.1.1). Shop bei 4 ° C.
    6. Bereiten Sie eine Elektrode Regenerationslösung (3,5 M KCl) durch Auflösen von 26 g KCl in destilliertem Wasser zu einem Endvolumen 100 mL. Filtern Sie sterilisiert und Lagerung bei 4 ° C.
    7. Bereiten Sie eine 5 mM NaCl-Lösung durch Auflösen von 0,29 g NaCl in destilliertem Wasser zu einem Endvolumen von 1 L. Filter sterilisieren und Lagerung bei 4 ° C. Dann bereiten Sie eine Erkennung-Lösung (4 mM Penicillium) durch Auflösen von 26,7 mg Penicillium in 20 mL 5 mM NaCl-Lösung. Filter zu sterilisieren und Lagerung bei-20 ° C.
  2. Sensor-Vorbereitung und regeneration
    Hinweis: Die Polyaniline beschichtete Sensor-Chips wurden entwickelt und freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. P. Bogaerts, Dr. S. Yunus und Prof. Y. Glupczynski (Katholische Universität von Louvain-la-Neuve - CHU Mont-Godinne). Die Beschreibung des Sensors sowie die Polyaniline Elektro-Polymerisation-Protokolle verwendet, um diese Sensoren zu synthetisieren sind detailliert in ihrer vorherigen Arbeit17. Kurz, nutzt dieses System wiederverwendbare Sensoren von acht einzelnen Chips, die von klassischen Printed Circuit Board (PCB) Techniken hergestellt wurden. Einzelnen Chips bestehen aus drei Elektrode runden Flecken. Die oberste ist die Arbeitselektrode auf welche Polyaniline Electro synthetisiert wurde. Die Mitte ist die Bezugselektrode und die unteren Elektrode bildet die Gegenelektrode. Sowohl die Referenz und die Zähler-Elektroden sind funktionalisiert mit soliden Ag/AgCl Amalgam auf die CO2-Schicht.
    1. Führen Sie 3 Wäschen der Elektroden durch Eintauchen der Tipps in Vertiefungen einer 96-Well-Platte mit 300 µL/Well Elektrode Vorbereitung Lösung (1 % Triton x-100-PBS, siehe Schritt 2.1.5.). Führen Sie jedem Waschgang für 2 min bei Raumtemperatur schonendes Mischen.
    2. Spülen Sie die Elektroden durch Eintauchen der Tipps in Vertiefungen einer 96-Well-Platte mit 300 µL/Well von destilliertem Wasser für 2 min bei Raumtemperatur schonendes Mischen.
    3. Regenerieren Sie die Elektroden durch Eintauchen der Tipps in Vertiefungen einer 96-Well-Platte mit 300 µL/Well der Regenerationslösung (3,5 M KCl, siehe Schritt 2.1.6) über Nacht bei 4 ° C oder 1 h bei Raumtemperatur.
    4. 3 Wäschen der Elektroden durch Eintauchen der Tipps in Vertiefungen einer 96-Well-Platte mit 300 µL/Well des Phosphat-Puffer Kochsalzlösung durchzuführen (siehe Schritt 2.1.1.). Durchführen Sie jedem Waschgang für 2 Minuten mit schonendes Mischen bei Raumtemperatur.
  3. Verbindliche Assay durchgeführt auf dem sensor
    1. HEWL Mantel auf die PANI (Polyaniline) Oberfläche der Elektrode durch die Hinterlegung einer 15 µL Drop von 40 µg/mL HEWL mit PBS-Puffer auf der Elektrodenoberfläche vorbereitet. Über Nacht bei 4 ° C oder 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubieren.
    2. Führen Sie drei wäscht von Elektroden mit Phosphat Puffer Kochsalzlösung (siehe Schritt 2.1.1) durch die Elektrode Teile des Sensor-Chips in Vertiefungen einer 96-Well-Platte mit 300 µL/Well des Phosphat-Puffer Kochsalzlösung eintauchen. Führen Sie jedem Waschgang für 2 min bei Raumtemperatur schonendes Mischen.
    3. Die Elektroden durch Zugabe von 50 µL Tropfen die blockierende Lösung zu sättigen (siehe Punkt 2.1.2) auf der Elektrodenoberfläche. 1 h bei Raumtemperatur inkubieren. Dann waschen dreimal wie beschrieben in der vorherigen Schritt (siehe Punkt 2.3.2).
    4. Die BlaP-Kabine-Lys3-Lösung für 20 µg/mL in verbindlichen Lösung verdünnen (siehe Punkt 2.1.3) und einen 15 µL Tropfen verdünnte Lösung auf die Elektroden. 10 min bei Raumtemperatur inkubieren. Nach Antigen-gemeinnützige Reaktion zu waschen dreimal wie beschrieben im vorherigen Schritt die Waschlösung verwenden (siehe Schritt 2.1.4). Spülen Sie die Elektrode einmal mit PBS (siehe Schritt 2.1.1).
    5. Schließen Sie für die Erkennung den Sensor-Chip über den Kupfer-Schaltung Teil, ein digital-Multimeter. Dann, die Sensor-Antwort durch die Anwendung eines Tropfen 50 µL Erkennung Lösung zu initiieren (siehe Schritt 2.1.7) auf den positiven Elektroden und Anwendung einen Tropfen 50 µL NaCl 5 mM Lösung auf den negativen Elektroden (siehe Schritt 2.1.7). 30 min bei Raumtemperatur inkubieren. Überwachen Sie den Leitwert mit einem digitalen Multimeter.
      Hinweis: Das Multimeter wurde durch Dr. P. Bogaerts, Dr. S. Yunus und Prof. Y. Glupczynski (Katholische Universität von Louvain-la-Neuve - CHU Mont-Godinne. bereitgestellt. Diese Potentiostaten ist computergesteuert über einen USB-Port und die acht verschiedenen Chips des Sensors gleichzeitig analysiert. Die Software erstellt von Yunus und Kollegen17 erzeugt einen Echtzeit-Plot, der die Messungen der Leitfähigkeit unterscheiden sich die Referenz und Sample Elektroden gegen die Zeit darstellt.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Design und Engineering von Chimären Protein BlaP-Fahrerhaus-Lys3

Abbildung 1 stellt das Einfügen der Fahrerhaus-Lys3 in eine permissive BalP Klasse A β-Lactamase-Schleife aus Bacillus Licheniformis. Die Aufnahme wurde zwischen Rückstände Asp198 und Lys199 durchgeführt. Ein Thrombin-Spaltstelle wurde auf jeder Seite der Kabine-Lys3 eingeführt. Zellen mit einer konstitutiven Expressionsplasmid Codierung der BlaP-Fahrerhaus-L...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dieser Arbeit präsentieren wir eine Methode, um eine gemeinnützige Verwendung der BlaP β-Lactamase als ein Trägerprotein funktionalisieren und wir zeigen, dass wir die daraus resultierende Hybrid-Protein in eine potentiometrische Sensor-Assay erfolgreich umsetzen können. Die wichtigste Neuerung Aspekt unserer Arbeit im Vergleich zu anderen Biosensor-Assays ist die kovalente Kupplung Teil der Antikörper, die enzymatische Aktivität, die das elektrische Signal generiert. Dieses so genannte Proteintechnologie Einfügung st...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren erkennen der wallonischen Region Belgiens im Rahmen der SENSOTEM und NANOTIC Forschungsprojekte sowie die nationalen Fonds für die wissenschaftliche Forschung (F.R.S.-F.N.R.S) für ihre finanzielle Unterstützung.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Reagenzien
KH2PO4Sigma-AldrichtV000225 
K2HPO4Sigma-Aldricht1551128
NaClSigma-AldrichtS7653
Tris– HClRoche10812846001
EDTA Sigma-AldrichtE9884
KClSigma-AldrichtP9541
Na2HPO4 Sigma-AldrichtNIST2186II
2-MercaptoethanolSigma-AldrichtM6250
AlaninSigma-AldrichtA7627
HClO4Fluka342881M HClO4 Lösung, Vertreiber : Sigma-Aldricht
KaseinhydrolysatSigma-Aldricht22090
Benzylpenicillin NatriumSigma-AldrichtB0900000
Hühnereiweiß LysozymRoche10837059001
HeptanSigma-Aldricht246654
MethanolSigma-Aldricht322415
AmmoniumhydroxidlösungSigma-Aldricht38053928% NH3  in H2O, gereinigt durch Doppeldestillation (konzentriert?)
Labor-Verbrauchsmaterialien6-Well-Platte
 Greiner Bio-One657165CELLSTAR 6-Well Plate
Equipment
pH meterWTW1AA110Lab pH Meter inoLab pH 7110
Vakuum- und FiltersystemNalgeneNALG300-4100Filterhalter mit Empfänger, Verteiler : VWR
potentiometrische Sensorchipsvon Yunus und Kollegen (Ref 16)
PGSTAT30 AutolabMetrohm Autolabeingestellt, Nachfolger Autolab PGSTAT302N
Digitalmultimeter, METRAHit 22MGossen Metrawattabgekündigt, Nachfolger Metrahit Base

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Higgins, I. J., Lowe, C. R. Introduction to the principles and applications of biosensors. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 316, 3-11 (1987).
  2. Byrne, B., Stack, E., Gilmartin, N., O'Kennedy, R. Antibody-based sensors: principles, problems and potential for detection of pathogens and associated toxins. Sensors (Basel). 9, 4407-4445 (2009).
  3. Huston, J. S., et al. Protein engineering of antibody binding sites: recovery of specific activity in an anti-digoxin single-chain Fv analogue produced in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 85, 5879-5883 (1988).
  4. Mechaly, A., Zahavy, E., Fisher, M. Development and implementation of a single-chain Fv antibody for specific detection of Bacillus anthracis spores. Appl Environ Microbiol. 74, 818-822 (2008).
  5. Hamers-Casterman, C., et al. Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature. 363, 446-448 (1993).
  6. Sheriff, S., Constantine, K. L. Redefining the minimal antigen-binding fragment. Nat Struct Biol. 3, 733-736 (1996).
  7. Stijlemans, B., et al. Efficient targeting of conserved cryptic epitopes of infectious agents by single domain antibodies. African trypanosomes as paradigm. J Biol Chem. 279, 1256-1261 (2004).
  8. Thanongsaksrikul, J., et al. A V H H that neutralizes the zinc metalloproteinase activity of botulinum neurotoxin type A. J Biol Chem. 285, 9657-9666 (2010).
  9. Huang, L., et al. Prostate-specific antigen immunosensing based on mixed self-assembled monolayers, camel antibodies and colloidal gold enhanced sandwich assays. Biosens. Bioelectron. 21, 483-490 (2005).
  10. Yolken, R. H., Wee, S. B., Van Regenmortel, M. The use of beta-lactamase in enzyme immunoassays for detection of microbial antigens. J Immunol Methods. 73, 109-123 (1984).
  11. Kojima, M., et al. Activation of circularly permutated beta-lactamase tethered to antibody domains by specific small molecules. Bioconjug Chem. 22, 633-641 (2011).
  12. Iwai, H., Kojima-Misaizu, M., Dong, J., Ueda, H. Creation of a Ligand-Dependent Enzyme by Fusing Circularly Permuted Antibody Variable Region Domains. Bioconjug Chem. 27, 868-873 (2016).
  13. Vandevenne, M., et al. The Bacillus licheniformis BlaP beta-lactamase as a model protein scaffold to study the insertion of protein fragments. Protein Sci. 16, 2260-2271 (2007).
  14. Vandevenne, M., et al. Rapid and easy development of versatile tools to study protein/ligand interactions. Protein Eng Des Sel. 21, 443-451 (2008).
  15. Crasson, O., et al. Enzymatic functionalization of a nanobody using protein insertion technology. Protein Eng Des Sel. 28, 451-460 (2015).
  16. Yunus, S., Attout, A., Vanlancker, G., Bertrand, P., Ruth, N., Galleni, G. A method to probe electrochemically active material state in portable sensor applications. Sensors and Actuators B: Chemical. 156, 35-42 (2011).
  17. Bogaerts, P., Yunus, S., Massart, M., Huang, T. D., Glupczynski, Y. Evaluation of the BYG Carba Test, a New Electrochemical Assay for Rapid Laboratory Detection of Carbapenemase-Producing Enterobacteriaceae. J Clin Microbiol. 54, 349-358 (2016).
  18. Wang, L. P., Wang, W., Di, L., Lu, Y. N., Wang, J. Y. Protein adsorption under electrical stimulation of neural probe coated with polyaniline. Colloids Surf B Biointerfaces. 80, 72-78 (2010).
  19. Piletsky, S., Piletska, E., Bossi, A., Turner, N., Turner, A. Surface functionalization of porous polypropylene membranes with polyaniline for protein immobilization. Biotechnol. Bioeng. 82, 86-92 (2003).
  20. Khatkhatay, M. I., Desai, M. A comparison of performances of four enzymes used in ELISA with special reference to beta-lactamase. J Immunoassay. 20, 151-183 (1999).
  21. Worn, A., et al. Correlation between in vitro stability and in vivo performance of anti-GCN4 intrabodies as cytoplasmic inhibitors. J Biol Chem. 275, 2795-2803 (2000).
  22. Ostermeier, M. Engineering allosteric protein switches by domain insertion. Protein Eng Des Sel. 18, 359-364 (2005).
  23. Choi, J. H., Laurent, A. H., Hilser, V. J., Ostermeier, M. Design of protein switches based on an ensemble model of allostery. Nat Commun. 6, 6968(2015).
  24. Collinet, B., et al. Functionally accepted insertions of proteins within protein domains. J Biol Chem. 275, 17428-17433 (2000).
  25. Betton, J. M., Jacob, J. P., Hofnung, M., Broome-Smith, J. K. Creating a bifunctional protein by insertion of beta-lactamase into the maltodextrin-binding protein. Nat Biotechnol. 15, 1276-1279 (1997).
  26. Ay, J., Gotz, F., Borriss, R., Heinemann, U. Structure and function of the Bacillus hybrid enzyme GluXyn-1: native-like jellyroll fold preserved after insertion of autonomous globular domain. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 6613-6618 (1998).
  27. Ruth, N., et al. DNA vaccination for the priming of neutralizing antibodies against non-immunogenic STa enterotoxin from enterotoxigenic Escherichia coli. Vaccine. 23, 3618-3627 (2005).
  28. Zervosen, A., et al. Characterization of the cattle serum antibody responses against TEM beta-lactamase and the nonimmunogenic Escherichia coli heat-stable enterotoxin (STaI). FEMS Immunol Med Microbiol. 54, 319-329 (2008).
  29. Chevigne, A., et al. Use of bifunctional hybrid beta-lactamases for epitope mapping and immunoassay development. J Immunol Methods. 320, 81-93 (2007).
  30. Ke, W., et al. Structure of an engineered beta-lactamase maltose binding protein fusion protein: insights into heterotropic allosteric regulation. PloS One. 7, 39168(2012).
  31. Saeedfar, K., Heng, L. Y., Ling, T. L., Rezayi, M. Potentiometric urea biosensor based on an immobilised fullerene-urease bio-conjugate. Sensors (Basel). 13, 16851-16866 (2013).
  32. D'Orazio, P. Biosensors in clinical chemistry. Clin Chim Acta. 334, 41-69 (2003).
  33. Szucs, J., Pretsch, E., Gyurcsanyi, R. E. Potentiometric enzyme immunoassay using miniaturized anion-selective electrodes for detection. Analyst. 134, 1601-1607 (2009).
  34. Ding, J., Wang, X., Qin, W. Pulsed galvanostatic control of a polymeric membrane ion-selective electrode for potentiometric immunoassays. ACS Appl Mater Interfaces. 5, 9488-9493 (2013).
  35. Wang, X., et al. A polymeric liquid membrane electrode responsive to 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine oxidation for sensitive peroxidase/peroxidase mimetic-based potentiometric biosensing. Anal Chem. 86, 4416-4422 (2014).
  36. Grieshaber, D., MacKenzie, R., Voros, J., Reimhult, E. Electrochemical Biosensors - Sensor Principles and Architectures. Sensors (Basel). 8, 1400-1458 (2008).
  37. Bakker, E., Pretsch, E. Nanoscale potentiometry. Trends Analyt Chem. 27, 612-618 (2008).
  38. Zhang, D., Liu, Q. Biosensors and bioelectronics on smartphone for portable biochemical detection. Biosens Bioelectron. 75, 273-284 (2016).
  39. Nemiroski, A., et al. Universal mobile electrochemical detector designed for use in resource-limited applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 11984-11989 (2014).
  40. Socio-economic impact of mHealth- An assessment report for the European Union. , Price Waterhouse Coopers. Commission, T.E (2013).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

Beta Lactamase Biosensorkonduktometrischer AssayNachweis biomolekularer Interaktionenchim re ProteintechnologieAntik rper Antigen BindungMessung der ProtonenfreisetzungProtokoll zur ElektrodenvorbereitungBenzylpenicillin HydrolysePolyanilin beschichtete Elektrodenberwachung mittels Digitalmultimeter

Verwandte Artikel