Die Verwendung eines β-Lactamase-basierte Conductimetric Biosensor-Assays, biomolekulare Wechselwirkungen zu erkennen

Zusammenfassung

Dabei berichten wir über eine neue Methode, um Protein-Protein-Interaktionen mit Hilfe eines conductimetric Biosensors basierend auf die β-Lactamase-Hybridtechnologie zu studieren. Diese Methode beruht auf der Freisetzung von Protonen bei der Hydrolyse des β--Lactame.

Zusammenfassung

Biosensoren werden immer wichtiger und implementierte in verschiedenen Bereichen wie Erregernachweis, molekulare Diagnostik, Umweltüberwachung und Kontrolle der Lebensmittelsicherheit. In diesem Zusammenhang wird β-Lactamases als effiziente Reporter Enzyme in mehreren Studien der Protein-Protein-Interaktion verwendet. Darüber hinaus fördert ihre Fähigkeit, Einfügungen von Peptiden oder strukturierte Proteine/Domains stark anzunehmen die Nutzung dieser Enzyme um Chimären Proteinen zu erzeugen. In einer aktuellen Studie einer einzelnen Domäne Antikörper-Fragment in der Bacillus Licheniformis BlaP β-Lactamase eingelegt werden. Diese kleinen Domänen, auch genannt Nanobodies, gelten als Antigen-bindenden Domänen einzelne Kette Antikörper von Camelids. Wie üblich Doppelkette Antikörper zeigen sie hohen Affinitäten und Besonderheiten für ihre Ziele. Das daraus resultierende Chimäre Protein ausgestellt eine hohe Affinität gegen sein Ziel unter Beibehaltung der β-Lactamase-Aktivität. Dies deutet darauf hin, dass die gemeinnützige und β-Lactamase Moieties funktionsfähig bleibt. In der vorliegenden Arbeit berichten wir ein detailliertes Protokoll, das unsere Hybrid-β-Lactamase-System der Biosensor-Technologie kombiniert. Die spezifische Bindung der gemeinnützige Ziel kann dank einer conductimetric Messung der Protonen durch die katalytische Aktivität des Enzyms freigegeben erkannt werden.

Einleitung

Biosensoren sind analytische Geräte, die eine Bio-molekulare Interaktion mit physikalischen oder chemischen Signalgeber als Wandler¹kombinieren. Die aufgezeichneten Signale können dann interpretiert und umgewandelt, um die Wechselwirkungen zwischen den freien und immobilisierten Partnern zu überwachen. Die meisten der Biosensoren beinhalten die Verwendung eines Antikörpers Analyten wie Hormone oder andere Erreger Marker²zu erkennen. Anderen Sensor-Formate können verwendet werden und sind Masse-basierte, magnetische, optische oder elektrochemische Biosensoren. Letztere gehören zu den am häufigsten verwendeten Sensoren und....

Protokoll

(1) Protein Probenvorbereitung

1. Produzieren Sie und reinigen Sie das Hybrid-Protein BlaP-Fahrerhaus-Lys3 wie in unserer vorherigen Studie¹⁵berichtet. Speichern Sie das Protein in 50 mM Phosphat-Puffer pH 7.4 mit folgender Zusammensetzung: 0,24 g KH₂PO₄ in 800 mL destilliertem Wasser aufgelöst, 1,44 g Na₂HPO₄ , 8 g NaCl und 0,2 g KCl beheben den pH-Wert der Lösung auf 7,4 vor Anpassung der letzte Band der Lösung 1 sterilisieren L. Filter die Proteinlösung.
2. Bereiten Sie eine Henne Eiweiß Lysozym (HEWL) Stammlösung. Lösen Sie 100 mg (40.000 Einheiten/mg) im Handel erworbenen HEWL in 10....

Ergebnisse

Design und Engineering von Chimären Protein BlaP-Fahrerhaus-Lys3

Abbildung 1 stellt das Einfügen der Fahrerhaus-Lys3 in eine permissive BalP Klasse A β-Lactamase-Schleife aus Bacillus Licheniformis. Die Aufnahme wurde zwischen Rückstände Asp198 und Lys199 durchgeführt. Ein Thrombin-Spaltstelle wurde auf jeder Seite der Kabine-Lys3 eingeführt. Zellen mit einer konstitutiven Expressionsplasmid Codierung der BlaP-Fahrerhaus-L.......

Diskussion

In dieser Arbeit präsentieren wir eine Methode, um eine gemeinnützige Verwendung der BlaP β-Lactamase als ein Trägerprotein funktionalisieren und wir zeigen, dass wir die daraus resultierende Hybrid-Protein in eine potentiometrische Sensor-Assay erfolgreich umsetzen können. Die wichtigste Neuerung Aspekt unserer Arbeit im Vergleich zu anderen Biosensor-Assays ist die kovalente Kupplung Teil der Antikörper, die enzymatische Aktivität, die das elektrische Signal generiert. Dieses so genannte Proteintechnologie Einfügung st.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Reagenzien
KH2PO4	Sigma-Aldricht	V000225
K2HPO4	Sigma-Aldricht	1551128
NaCl	Sigma-Aldricht	S7653
Tris– HCl	Roche	10812846001
EDTA	Sigma-Aldricht	E9884
KCl	Sigma-Aldricht	P9541
Na2HPO4	Sigma-Aldricht	NIST2186II
2-Mercaptoethanol	Sigma-Aldricht	M6250
Alanin	Sigma-Aldricht	A7627
HClO4	Fluka	34288	1M HClO4 Lösung, Vertreiber : Sigma-Aldricht
Kaseinhydrolysat	Sigma-Aldricht	22090
Benzylpenicillin Natrium	Sigma-Aldricht	B0900000
Hühnereiweiß Lysozym	Roche	10837059001
Heptan	Sigma-Aldricht	246654
Methanol	Sigma-Aldricht	322415
Ammoniumhydroxidlösung	Sigma-Aldricht	380539	28% NH3  in H2O, gereinigt durch Doppeldestillation (konzentriert?)
Labor-Verbrauchsmaterialien6-Well-Platte
	Greiner Bio-One	657165	CELLSTAR 6-Well Plate
Equipment
pH meter	WTW	1AA110	Lab pH Meter inoLab pH 7110
Vakuum- und Filtersystem	Nalgene	NALG300-4100	Filterhalter mit Empfänger, Verteiler : VWR
potentiometrische Sensorchips			von Yunus und Kollegen (Ref 16)
PGSTAT30 Autolab	Metrohm Autolab		eingestellt, Nachfolger Autolab PGSTAT302N
Digitalmultimeter, METRAHit 22M	Gossen Metrawatt		abgekündigt, Nachfolger Metrahit Base