Methodenartikel

Schaffung von Herzgewebe, die mechanische Integration von Sphäroiden mit 3D-Bioprinting ermöglicht

DOI:

10.3791/55438

⸱

2. Juli 2017

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1Division of Cardiac Surgery, Johns Hopkins Hospital, 2Division of Cardiology, Johns Hopkins Hospital, 3Department of Biomedical Engineering, Johns Hopkins University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Protokoll beschreibt das 3D-Bioprinting von Herzgewebe ohne den Einsatz von Biomaterialien. 3D-Bioprints-Herz-Patches zeigen mechanische Integration von Komponenten-Sphäroiden und sind vielversprechend bei der Herz-Gewebe-Regeneration und als 3D-Modelle von Herzerkrankungen.

Zusammenfassung

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Dieses Protokoll beschreibt das 3D-Bioprinting von Herzgewebe ohne den Einsatz von Biomaterialien, wobei nur Zellen verwendet werden. Kardiomyozyten, Endothelzellen und Fibroblasten werden zuerst isoliert, gezählt und bei gewünschten Zellverhältnissen gemischt. Sie werden in einzelnen Brunnen in ultra-niedrigen Befestigung 96-Well-Platten co-kultiviert. Innerhalb von 3 Tagen, schlagen Sphärenoiden bilden. Diese Sphäroide werden dann durch eine Düse mit Vakuumsaugung aufgenommen und auf einer Nadelanordnung unter Verwendung eines 3D-Bioprinter aufgebaut. Die Sphäroide dürfen dann auf dem Nadel-Array verschmelzen. Drei Tage nach dem 3D-Bioprinting werden die Sphäroide als intaktes Patch entfernt, das schon spontan schlägt. 3D-Bioprints-Herz-Patches zeigen mechanische Integration von Komponenten-Sphäroiden und sind vielversprechend bei der Herz-Gewebe-Regeneration und als 3D-Modelle von Herzerkrankungen.

Einleitung

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Es gibt viele verschiedene Methoden der 3D-Bioprinting 1 , 2 , 3 . Das 3D-Bioprinting wird häufig durch die Drucktechnologie 1 klassifiziert, mit Beispielen wie Inkjet-Bioprinting, Microextrusion Bioprinting, laserunterstütztes Bioprinting, einer Kombination von Methoden oder neueren Ansätzen. 3D-Bioprinting kann auch in Gerüst- oder Gerüst-abhängige Methoden eingeteilt werden 4 . Die meisten Methoden des 3D-Bioprintings sind gerüstabhängig, wo Biomaterialien erforderlich sind, zB Bioinks 5 oder....

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Protokoll

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1. Vorbereitung der Kardiomyozyten

  1. Generieren und kultivieren menschlich induzierte pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) auf 6-Well-Platten, die mit der Basalmembranmatrix beschichtet sind, wie beschrieben 10 .
  2. Unterscheiden Sie hiPSCs in hiPSC-abgeleitete Kardiomyozyten (hiPSC-CMs) unter Verwendung der zuvor beschriebenen Methoden 11 , 12 .
  3. Am Tag 19 nach der Differenzierung, isolieren Sie die Kardiomyozyten mit 2 ml Trypsin / EDTA 0,05% in jeder Vertiefung für 5 min bei Raumtemperatur.
  4. Überwachen Sie die Kardiomyozyten unter einem optischen Mikr....

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Ergebnisse

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Am Ende von Schritt 4.4 (Co-Kultur) sollten die Zellen in jeder Vertiefung am Boden der Ultra-Low-Attachment-96-Well-U-Bodenplatten aggregieren, um Sphäroide durch Schwerkraft zu bilden. Diese Sphäroide enthalten hiPSC-CM, HCFs und HUVECs und können unter Lichtmikroskopie visuell untersucht werden, wo sie durch zweidimensionale Projektion kreisförmig erscheinen sollen ( Abbildung 1 ). Am Ende von Schritt 6.3 sollte das 3D-Bioprints-Herz-Patch Gewebe-Hohlräum.......

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Diskussion

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Es ist wichtig, schlagende, funktionelle Sphäroide für das 3D-Bioprinting zu verwenden. Wenn die Sphäroide nicht schlagen, führt ihre weitere Verwendung unweigerlich zu einem nicht funktionierenden 3D-Bioprint-Pflaster.

Ein Vorteil dieses Ansatzes ist die Möglichkeit, den Zellinhalt des Pflasters zu manipulieren, indem die Gesamtzahl der Zellen und der Prozentsatz der Kardiomyozyten, Endothelzellen und Fibroblasten in den Sphäroiden variiert werden. Auf diese Weise können viele verschiedene Ar.......

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

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Die Autoren erkennen die folgenden Finanzierungsquellen an: Magic That Matters Fund for Cardiovascular Research und der Maryland Stem Cell Research Fund (2016-MSCRFI-2735).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
GeltrexInvitrogen 
Trypsin/EDTA 0,05 %Thermo Fisher15400054
definierter Trypsin-Inhibitor 0,0125 %ThermoFisher R007100
RPMI ZellmedienInvitrogen11875-093RPMI, ergänzt mit B27, stellt HIPSC-CM-Kulturmedien
dar B-27 NahrungsergänzungsmittelThermo Fisher17504044RPMI, ergänzt mit B27, stellt HIPSC-CM dar Nährmedien
Countess Automated Cell CounterInvitrogenC10227
Humane kardiale Fibroblasten (adulter ventrikulärer Typ)Sciencell6310
Endothelzellen der menschlichen Nabelschnurvenen-EndothelzellenLonzaCC-2935
PrimeSurface 96-Well-U-Bodenplatten mit extrem geringer Bindung Akita Sumitomo Bakelit Co.MS-9096UZ
Regenova Bio 3D-DruckerCyfuse Biomedical K.K.N/Awww.cyfusebio.com/en/
Trypanblau-Lösung, 0,4Thermo Fisher15250061
Troponin T AntikörperThermo Fisher701620
Connexin 43 (Cx43) AntikörperChemiconMAB3068
ProLong Gold Antifade Eindeckmittel mit DAPIThermo FisherP36935
A1413202%

Referenzen

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  1. Murphy, S. V., Atala, A. 3D bioprinting of tissues and organs. Nat Biotech. 32, 773-785 (2014).
  2. Bajaj, P., Schweller, R. M., Khademhosseini, A., West, J. L., Bashir, R. 3D biofabrication strategies for tissue engineering and regenerative medicine. Ann Rev Biomed Eng. 16

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Schlagwörter

3D BioprintingZellsph roideUltra Low AttachmentNadelarraykonfokale Mikroskopiespontanes SchlagenGeweberegenerationHerzkrankheitsmodelle

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