Summary
En helmontert immunohistokemisk tilnærming, for å visualisere nevrofilamentproteinuttrykk i den ekstrahepatiske galdevegen i Suncus murinus. Presenteres her. Denne protokollen kan brukes til å analysere innerveringen av alle viskoser i S. murinus eller andre arter.
Abstract
Dette arbeidet beskriver den fullstendige immunhistokjemiske fargemetoden i detalj, ved bruk av nevrofilament-antistoff til å merke innerveringen av galdevegen i Suncus murinus ( S. murinus ). Først ble prøven dissekert fra S. murinus og fiksert i 4% paraformaldehyd (PFA). For det andre ble en enzymatisk behandling og potensiell endogen peroksidaseinaktivering utført. Prøven ble deretter utsatt for det primære antistoff, anti-nevrofilamentproteinantistoff i 3-6 dager. Den ble deretter inkubert med det sekundære antistoffet konjugert med pepperrotperoksidase. Fargereaksjonen ble avslørt ved å reagere prøven med et 3,3'-diaminobenzidin (DAB) substrat. Denne metoden kan brukes for å analysere innervaringen av alle organer. Videre kan denne protokollen også tilpasses for å teste andre neuronale antistoffer, men optimalisering av antibodiesDet bør gjøres først. Denne metoden ble opprinnelig innført av Kuratani og Tanaka 1 , 2 , 3 .
Introduction
Huset muskeskrue , Suncus murinus , tilhører ordren Insectivora og familien Soricidae. Dette lille pattedyret er fordelt over hele Sørøst-Asia og beboer hus og grøntområder som ligger i nærheten av menneskelige beboer eller storfepenner 4 . Denne arten viser generelle morfologiske egenskaper mer lik mennesker enn andre laboratoriedyr, som mus, rotte og kanin 5 . Tidligere ble helmontert immunfarging med en perifer neuronmarkør for S. murinus nevrofilamentprotein (NFP) brukt til å merke perifere nerver i bukspyttkjertelen 6 , major duodenal papilla 7 , pylorus 8 , galleblæren 5 og ekstrahepatisk biliary 9 .
NFP er et makromolekylært kompleks som er en del av det modne neuronale cytoskeletet. Neurofilament-relatert proteinS formidler interaksjoner mellom NFP og zygosomet. Både enzymfunksjonen og strukturen av linkerproteiner reguleres av NFP 10 . NFP-komplekset er laget av tre polypeptider: NF-L (70 kDa), NF-M (150-160 kDa) og NF-H (200 kDa). NFP kan bli funnet i neuronal axon i både sentrale og perifere nervesystemet. Anti-humant NFP antistoff har vist seg å markere aksoner i sentral- og perifert nervesystem. Anatomiske og elektrofysiologiske undersøkelser har vist at sphincter, galleblæren og proksimal gastrointestinalt kanal er forbundet 11 , 12 , 13 , 14 . Imidlertid er de morfologiske egenskapene til deres nevronforbindelser ennå ikke definert.
Dette arbeidet demonstrerer bruk av en helmontert immunhistokemisk fargemetode for å merke innerveringen av S. murinus bilIary-kanalen med et NFP-antistoff.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentelle prosedyrer ble godkjent av Tokyo Metropolitan University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Dyrene ble innkapslet og håndtert i samsvar med veiledningen for pleie og bruk av laboratoriedyr og veiledningen for pleie og bruk av eksperimentelle dyr i det kanadiske råd om dyrepleie . Vi brukte dyr oppdrettet og vedlikeholdt på Funksjons Morfologi Laboratory, Department of Frontier Health Sciences, Tokyo Metropolitan University, Japan.
1. Dyrepleie og boliger
- Skaff 7 S. murinus (3 kvinner og 4 hanner som veier 70-90 g) fra en lukket avlskoloni.
- Cage S. murinus individuelt etter avspenning (20 d etter fødselen) i plastburer utstyrt med en treskeboks som inneholder papirstrimler. Oppbevar dem i et konvensjonelt kondisjonert dyrerom: 23-27 ° C, ingen fuktighetskontroll og en 12:12 t lys: mørk syklus. Levering kommersiellIalørretpellets og vann ad libitum.
2. Vevspreparasjon
- For å fremstille 4% (w / v) paraformaldehyd (PFA), oppløs 40 g PFA i 1000 ml 0,01 M fosfatbuffert salin (PBS, pH 7,4). I et avtrekksskap, bland med en hvirvel til løsningen er klar. Oppbevar 4% PFA O / N ved 4 ° C.
Forsiktig: Bruk egnet personlig verneutstyr (PPE) ved håndtering av PFA. - For å perfeksjonere og fikse dyret, bedøv det med eter og gi det en intraperitoneal injeksjon av somnopentyl (pentobarbitalnatrium, 0,6 ml / kg kroppsvekt).
- Etter at dyret er fullstendig narkotisert, åpner du bukhulen med en skalpell, noe som gir en midtre abdominal snitt 3 cm lang. Mens du inser den dårligere vena cava for exsanguinating, sett inn et kateter retrogradely i abdominal aorta på nivået umiddelbart over bifurcation av denne arterien i de felles iliac arterier.
- Injiser somnopentyl (pentobarbital såDium, 1,0 ml / kg kroppsvekt). Etter fullstendig eutanasi, perfusjon med 0,01 M PBS (pH 7,4) og deretter med 4% PFA i et avtrekksskap.
- Etter perfusjon injiserer du 2-3 ml hvit neopren latex (fortynnet hvit neopren latex 3: 2 med destillert vann (DW)) for å merke blodkarene.
- Trekk ut mageorganene, inkludert leveren, galleblæren, vanlig gallekanal, tolvfingertarm og bukspyttkjertel, med tilhørende nerver og kar.
- Injiser ca. 0,1 ml blå neopren latex (legg en dråpe blå blekk til 10 mL av den fortynnede hvite neopren latexen) til galleblæren for å merke gallesystemet.
- Post-fix over natten med 4% PFA ved 4 ° C for helmontert immunfarging.
Forsiktig: PFA er giftig. Unngå å håndtere PFA direkte. PFA skal brukes i et skap.
3. Whole-Mount Immunohistochemistry
Merk: Gjennom protokollen, inkludert under vasking, antistoff inkubasjon og farging, thE-prøven må forbli på nøtteren, forsiktig gli ved RT eller ved 4 ° C.
- Dag 1: Enzymatisk behandling og inaktivering av potensiell endogen peroksidase
- Vask preparatet med DW 4x i 1 time hver ved RT i et glassflaske med passende størrelse. Vri prøven forsiktig på nøtteren for å fjerne PFA. Unngå å skade prøven når du bytter løsninger.
- For å klargjøre 1% (w / v) ortoperiodinsyre, oppløs 1 g orthoperiodinsyre i 100 ml DW.
- Inkuber prøven i 1% ortopereiodsyre i 20 min ved RT for å hindre en egen peroksidasereaksjon.
- Tilbered 0,004% (w / v) papain ved å oppløse 0,004 g papain i 100 ml 0,025 mol / L Tris-HCI buffer (pH 7,6).
- Vask prøven med DW i 10 minutter ved RT.
- Inkuber prøven i ferskt tilberedt 0,004% papain i 2 timer ved 37 ° C i et konstant temperaturbad med mild gynging.
- Vask prøven med DW i 50-60 min ved RT.
- Oppbevar prøven i 4% PFA ved 4 ° C / N.
- Dag 2: Enzymatisk behandling
- Vask det lagrede prøven med DW 4 ganger i 1 time hver ved RT.
- Inkuber prøven i ferskt tilberedt 0,004% papain i 2 timer ved 37 ° C i et konstant temperaturbad med mild gynging.
- Vask prøven med DW i 50-60 min ved RT. Oppbevar prøven i 4% PFA ved 4 ° C / N.
- Dag 3: Frysebehandling
- Vask det lagrede prøven med DW 4x i 1 time hver ved RT, som ovenfor.
- Forbered 2,5% (vekt / volum), 5% (vekt / volum) og 10% (vekt / volum) sukrose ved å oppløse 2,5 g, 5 g og henholdsvis 10 g sukrose i 100 ml 0,01 M PBS PH 7,4).
- Dyp prøven i 2,5% (w / v), 5% (w / v) og 10% (w / v) sukrose i 30 minutter hver.
- Frys prøven ved -20 ° C i 30 - 60 minutter og deretter helt tine den ved RT; Gjenta syklusen 3x.
- Til sRepare 2% Triton X-100 (v / v), tilsett 2 ml Triton X-100 til 100 ml 0,01 M PBS (pH 7,4).
- Oppbevar prøven i 2% Triton X-100 ved 4 ° C / N.
- Dag 4: Primær antistoff inkubasjon
- Forbered fortynningsoppløsningen av det primære antistoffet ved å oppløse 0,2 g bovint serumalbumin (BSA), 0,3 ml Triton X-100 og 0,1 g natriumazid i 100 ml 0,01 M PBS (pH 7,4).
Forsiktig: Natriumazid er akutt giftig. Innånding og berøring må unngås. Bruk egnet PPE. - Fortynn det primære antistoffet (NFP) 1: 600 i ovennevnte fortynningsbuffer (trinn 3.4.1). Inkuber prøven med NFP-antistoff ved 4 ° C i 3-6 dager, og hold prøven forsiktig på gnisten. Større prøver vil kreve økte inkubasjonstider.
- Forbered fortynningsoppløsningen av det primære antistoffet ved å oppløse 0,2 g bovint serumalbumin (BSA), 0,3 ml Triton X-100 og 0,1 g natriumazid i 100 ml 0,01 M PBS (pH 7,4).
- Sekundær antistoff inkubasjon
- Vask prøven i PBS 4x i 1 time hver ved RT for å fjerne ubundet primær antistoff. Forbered fortynningsoppløsningen for det sekundære antistoffet ved å oppløse 0,2 g BSA og 0,3 ml Triton X-100 i 100 ml 0,01 M PBS (pH 7,4).
- Fortynn det sekundære antistoffet (peroksidasekonjugert, affinitetsrenset får-antimus-IgG-HRP) 1: 600 i fortynningsbufferen (trinn 3.5.2). Inkuber prøven med sekundær antistoff ved 4 ° C i 3 d, og hold prøven gyngende forsiktig på mutteren.
- farge
- Klargjør DAB-fargeløsning ved å tilsette 0,002 g 3,3'-diaminobenzidin-tetrahydroklorid (DAB) til 100 ml 0,05 mol / l Tris-HCl-buffer (pH 7,6) under et avtrekksskap, og hold oppløsningen i mørket.
- Vask prøvene ved RT i PBS 4x i 1 time hver.
- Tilsett 10 μL 30% H 2 O 2 i fersk tilberedt DAB-fargeløsning og inkuber med løsningen ved 4 ° C / N eller 3 d mens du forsiktig glir på nutatatoren.
- Stopp reaksjonen med plaKonsentrere prøven i PBS med 0,04% natriumazid når den optimale fargestyrken er nådd.
MERK: Unngå bruk av natriumazid til dette trinnet, da det hemmer pepperrotperoksidase.
- Imaging det fargede vevet
- Forsiktig overfør prøven til et petri glassfat (5 cm høy, 10 cm i diameter) som inneholder PBS. Ta tak i helmonterte bilder ved hjelp av et kamera montert på et stereomikroskop.
MERK: Fullfarget, farget vev skal avbildes mens det nedsenkes helt i PBS på en gjennomsiktig glassfat.
- Forsiktig overfør prøven til et petri glassfat (5 cm høy, 10 cm i diameter) som inneholder PBS. Ta tak i helmonterte bilder ved hjelp av et kamera montert på et stereomikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figurene 1 - 4 viser typiske resultater for NFP-positive nervefibre i den ekstrahepatiske galdeveien i S. murinus . Antistoffet mot NFP reproduserbart merket innerveringen i hele bildet av den ekstrahepatiske gallveien ( figur 1 ), galleblæren ( figur 2 ), den øvre gallekanalen ( figur 3 ) og duodenal papillatområdet ( figur 4 ) med høy spesifisitet og minimal bakgrunn.
For alle vev av prøven, uansett form og størrelse, kan tegmentale nerver bli farget samtidig. I tillegg til innervering av den ekstrahepatiske galdeveien ble løpende og distribusjonsdensiteten til spiserøret i spiserøret og magen utvetydig vist ( figur 1 ).
figur 2 ).
I den øvre gallekanalen ble to typer nervebunter merket. De fine nervebuntene dannet et uregelmessig og tett nervernett, løpte seg fast og bodde på / i galdeområdet; De tykkere nevrale bunter ble fordelt parallelt med overflaten av galdeveien ( figur 3 ).
Den vanlige gallekanalen ble merket med blå neopren latex og karene med hvit neopren latex. De tynne nervefibrene på slutten av den vanlige gallekanalen og duodenal papillaområdet ble tydelig demonstrert med høy c Overrasket ( figur 4 ).
Figur 1: NFP-positive nervefibre i biliary, esophagus og mage. Pilene viser vagusen som går langs esophagus til magen. CBD, Common Bile Duct; Es, spiserør; St, mage. Skalestang = 1300 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: NFP-positive nervefibre i gallbladderen. Gjerdeblærens blodkar ble merket med hvit latex. Rikelig innervering skjedde i nakke av galleblæren (piler). Skalbjelke = 1000 μm.Ref = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55483/55483fig2large.jpg" target = "_ blank"> Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: NFP-positive nervefibrer i den øvre gallekanalen. To typer nerver ble observert. En type var de fine nervebuntene som løpte seg fast og bodde på / i den ekstrahepatiske galdevegen (pilene); Den andre typen var tykkere nevrale bunter som ble fordelt parallelt med overflaten av den ekstrahepatiske galdeveien og løp mellom galleblæren og tolvfingertarmen (trekanter). PV, Portal Vein. Skalbjelke = 650 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: NFP-positive nervefibre i Duodenal Papilla-området. Den vanlige gallekanalen ble merket med blå latex og karene med hvit latex (*). Pilene viser innerveringen av enden av den vanlige gallekanalen, og trekanter viser innerveringen av duodenal papillatområdet (P), som kommer fra den vanlige gallekanalen og karene. Skalbjelke = 1000 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette arbeidet beskriver den eksperimentelle prosedyren for visualisering av innerveringen av den ekstrahepatiske gallveien ved bruk av et antistoff mot nevrofilamentprotein. Denne protokollen ble tilpasset fra protokollen beskrevet av Kuratani og Tanaka 1 , 2 , 3 .
For dette eksperimentet planlegger du tidslinjen for hvert av forsøkene, ettersom den fullstendige fargingsmetoden fortsetter i 2-3 uker. Beholderen som inneholder vevet må til enhver tid roteres på en nøtter, unntatt under fryseprosessen. Spesielt under inkubering med primære og sekundære antistoffer ble prøven satt i et kjølelagringsrom under rotering på en nøtter for å sikre ensartet eksponering av prøven til reaksjonsløsninger. Flere løsninger - 1% (w / v) ortoperiodinsyre, 0,004% (w / v) papain og fortynningsbufferen for primær / sekundær antiboDør - må gjøres frisk for hvert eksperiment. Gjennom protokollen, for å unngå å berøre og skade prøven når du bytter løsninger, bør løsningene helles ut i stedet for å bli fjernet med tang 15 .
Etter montering med PFA skal prøvene vaskes tilstrekkelig med DW eller PBS. I tillegg er den enzymatiske behandlingen med papaininkubasjonen viktig. Varmen og enzymet som brukes til antigeninnhenting bidrar til å forberede vevet til antistoffpenetrasjon. For å øke penetrasjonen av løsningene, bør vevens utvendige membran bli forstyrret ved en frysebehandling ved -20 ° C i 30 minutter eller -80 ° C / N 15 .
Det er viktig å helt nedsenke forsøksprøven i tilstrekkelige volumer av bufferløsning for å sikre at løsningen kan inkubere hele prøven. Inkubasjonstiden for det primære antistoffet må bestemmes empiriskD for forskjellige vev og prøvestørrelser. Vanligvis må det være 3 dager for en 2-3 cm prøve. Den optimale fortynningen må bestemmes empirisk for hvert antistoff. En fortynning på 1: 600 anbefales for både primære og sekundære antistoffer ved bruk av riktig antistoffbuffer.
Dette arbeidet beskriver i detalj protokollen til en allsidig helmontert immunhistokemisk tilnærming for å avdekke nevrofilamentproteinuttrykk i galdeveiene i S. murinus . Denne metoden kan brukes til å analysere innerveringen av alle viskoser i mange arter. Videre kan denne protokollen også tilpasses for å teste andre neuronale antistoffer, men optimalisering av antistoffene bør utføres.
Teknikken var imidlertid begrenset i merking av grunt nervøs vev og i konstruksjon av en tredimensjonal innerveringsmodell. Dessuten kunne det ikke identifisere egenskapene til nervefibrene ( dvs. sympatisk eller parAsympatisk, motorisk eller sensorisk, etc. ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Forfatterne har ingen bekreftelser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| orthoperiodic acid | Wako | 162-00732 | |
| papain | Wako | 164-00172 | |
| bovine serum albumin (BSA) | Wako | 010-15131 | |
| sodium azide | Nacalai Tesque | 312-33 | |
| neurofilament protein (NFP) antibody | Dako | M0762, lot 089, clone: 2F11 | |
| peroxidase-conjugated affinity-purified sheep anti-mouse IgG-HRP | MBL | Code 330 | |
| 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) | Wako | 349-00903 | |
| imidazole | Sigma | I-0125 |
References
- Kuratani, S., Tanaka, S., Ishikawa, Y., Zukeran, C. Early development of the hypoglossal nerve in the chick embryo as observed by the whole-mount nerve staining method. Am. J. Anat. 182 (2), 155-168 (1988).
- Kuratani, S., Tanaka, S. Peripheral development of the avian vagus nerve with special reference to the morphological innervation of heart and lung. Anat. Embryol. (Berl). 182 (5), 435-445 (1990).
- Kuratani, S., Tanaka, S. Peripheral development of avian trigeminal nerves. Am. J. Anat. 187 (1), 65-80 (1990).
- Yi, S. Q., et al. House musk shrew, Suncus murinus: a novel and natural obesity-resistant animal model. Obes. Metab. 6, 22-28 (2010).
- Yi, S. Q., et al. Surgical anatomy of innervation of the gallbladder in humans and Suncus murinus with special reference to morphological understanding of gallstone formation after gastrectomy. World J. Gastroenterol. 13 (14), 2066-2071 (2007).
- Yi, S. Q., et al. Anatomical study of the pancreas in the house musk shrew, Suncus murinus, with special reference to the blood supply and innervation. Anat. Rec. A Discov. Mol. Cell Evol. Biol. 273 (1), 630-635 (2003).
- Yi, S. Q., et al. Surgical anatomy of the innervation of the major duodenal papilla in humans and Suncus murinus, from the perspective of preserving innervation in organ-saving procedures. Pancreas. 30 (3), 211-217 (2005).
- Yi, S. Q., et al. Surgical anatomy of the innervation of the pylorus in humans and Suncus murinus, in relation to the surgical technique for pylorus-preserving pancreatoduodenectomy. World J. Gastroenterol. 12 (14), 2209-2216 (2006).
- Yi, S. Q., Ren, K., Kinoshita, M., Takano, N., Itoh, M., Ozaki, N. Innervation of Extrahepatic Biliary Tract, With Special Reference to the Direct Bidirectional Neural Connections of the Gall Bladder, Sphincter of Oddi and Duodenum in Suncus murinus, in Whole-Mount Immunohistochemical Study. Anat. Histol. Embryol. 45 (3), 184-188 (2016).
- Wang, H., et al. Neurofilament proteins in axonal regeneration and neurodegenerative diseases. Neural Regen. Res. 7 (8), 620-626 (2012).
- Wyatt, A. P. The relationship of the sphincter of Oddi to the stomach, duodenum and gall-bladder. J. Physiol. 193 (2), 225-243 (1967).
- Mawe, G. M., Kennedy, A. L. Duodenal neurons provide nicotinic fast synaptic input to sphincter of Oddi neurons in guinea pig. Am. J. Physiol. 277, G226-G234 (1999).
- Seo, J. H., Cho, S. S., Lee, I. S., Lee, H. S. Anatomical and neuropeptidergic properties of the duodenal neurons projecting to the gallbladder in the golden hamster. Arch. Histol. Cytol. 65 (4), 317-321 (2002).
- Padbury, R. T., Furness, J. B., Baker, R. A., Toouli, J., Messenger, J. P. Projections of nerve cells from the duodenum to the sphincter of Oddi and gallbladder of the Australian possum. Gastroenterology. 104 (1), 130-136 (1993).
- White, J. J., Reeber, S. L., Hawkes, R., Sillitoe, R. V. Wholemount immunohistochemistry for revealing complex brain topography. J. Vis. Exp. (62), e4042 (2012).
