Summary
En helmonteret immunohistokemisk tilgang til at visualisere neurofilamentproteinekspression i det ekstrahepatiske galde i Suncus murinus. Er præsenteret her. Denne protokol kan bruges til at analysere innerveringen af alle viscerale organer i S. murinus eller andre arter.
Abstract
Dette arbejde beskriver detaljeret immunhistokemisk farvningsmetode i detaljer ved anvendelse af neurofilamentproteinantistof til at mærke innervation af galdevejen i Suncus murinus ( S. murinus ). Først blev prøven dissekeret fra S. murinus og fikseret i 4% paraformaldehyd (PFA). For det andet blev en enzymatisk behandling og potentiel endogen peroxidase inaktivering udført. Prøven blev derefter udsat for det primære antistof, anti-neurofilament protein antistof i 3-6 dage. Det blev derefter inkuberet med det sekundære antistof konjugeret med peberrodperoxidase. Farvereaktionen blev afsløret ved at reagere prøven med et 3,3'-diaminobenzidin (DAB) substrat. Denne metode kan anvendes til at analysere innerveringen af alle organer. Desuden kan denne protokol også tilpasses til at teste andre neuronale antistoffer, men optimering af antibodiesDet skal først gøres. Denne metode blev oprindeligt indført af Kuratani og Tanaka 1 , 2 , 3 .
Introduction
Husets muskeskrue , Suncus murinus , tilhører ordren Insectivora og familien Soricidae. Dette lille pattedyr er fordelt i hele Sydøstasien og beboer huse og græsarealer, der ligger tæt på menneskelige boliger eller kvægpinde 4 . Denne art udviser generelle morfologiske egenskaber mere ligner mennesker end andre laboratoriedyr, såsom musen, rotten og kaninen 5 . Tidligere blev helbredsimmunfarvning med en perifer neuronmarkør for S. murinus neurofilamentprotein (NFP) brugt til at mærke perifere nerver i bugspytkirtlen 6 , major duodenal papilla 7 , pylorus 8 , galdeblære 5 og ekstrahepatisk galdeveje 9 .
NFP er et makromolekylært kompleks, som er en del af det modne neuronale cytoskelet. Neurofilament-relateret proteinS formidle interaktioner mellem NFP og zygosomet. Både enzymfunktionen og strukturen af linkerproteiner reguleres af NFP 10 . NFP-komplekset er fremstillet af tre polypeptider: NF-L (70 kDa), NF-M (150-160 kDa) og NF-H (200 kDa). NFP kan findes i neuronale axoner i både det centrale og perifere nervesystem. Anti-humant NFP antistof har vist sig at mærke axoner i det centrale og perifere nervesystem. Anatomiske og elektrofysiologiske undersøgelser har vist, at sphincter, galdeblære og proksimal mave-tarmkanalen er forbundet 11 , 12 , 13 , 14 . Imidlertid er de morfologiske egenskaber ved deres neuronale forbindelser endnu ikke defineret.
Dette arbejde demonstrerer anvendelsen af en helmonteret immunohistokemisk farvningsmetode til at mærke innerveringen af S. murinus bilIarytisk kanal med et NFP antistof.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentelle procedurer blev godkendt af Tokyo Metropolitan University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Dyrene blev indkvarteret og håndteret i overensstemmelse med vejledningen til pleje og brug af laboratoriedyr og vejledningen til pleje og brug af eksperimentelle dyr i det canadiske råd om dyrepleje . Vi brugte dyr opdrættet og vedligeholdt på Functional Morphology Laboratory, Department of Frontier Health Sciences, Tokyo Metropolitan University, Japan.
1. Dyrepleje og boliger
- Hent 7 S. murinus (3 hunner og 4 hanner, der vejer 70-90 g) fra en lukket avlskoloni.
- Bage S. murinus individuelt efter fravænning (20 d efter fødslen) i plastbure udstyret med en trækasse med papirstrimler. Opbevar dem i et konventionelt dyrket dyreværelse: 23-27 ° C, ingen luftfugtighedskontrol og en 12:12 h lys: mørk cyklus. Levering kommercielIalørredpellets og vand ad libitum.
2. Vævsforberedelse
- Til opløsning af 4% (vægt / volumen) paraformaldehyd (PFA) opløses 40 g PFA i 1.000 ml 0,01 M phosphatbufferet saltvand (PBS, pH 7,4). I et røgskab skal du blande med en hvirvel indtil opløsningen er klar. Opbevar 4% PFA O / N ved 4 ° C.
Forsigtig: Brug passende personlige værnemidler (PPE) ved håndtering af PFA. - For at perfuse og reparere dyret bedøv det med ether og giv det derefter en intraperitoneal injektion af somnopentyl (pentobarbitalnatrium, 0,6 ml / kg legemsvægt).
- Når dyret er fuldstændig narkotiseret, skal du åbne bukhulen med en skalpel, hvilket skaber en midtergående abdominal snit 3 cm lang. Mens du lægger den inferior vena cava til ekssanguineringen, indsætter du et kateter retrogradely i abdominal aorta på niveauet umiddelbart over bifurcationen af denne arterie i de fælles iliac arterier.
- Injicer somnopentyl (pentobarbital såDium, 1,0 ml / kg legemsvægt). Efter fuldstændig eutanasi, perfuse med 0,01 M PBS (pH 7,4) og derefter med 4% PFA i et røgskab.
- Efter perfusion injiceres 2-3 ml hvid neopren latex (fortyndet hvid neopren latex 3: 2 med destilleret vand (DW)) for at mærke blodkarrene.
- Udtrække abdominale organer, herunder leveren, galdeblæren, almindelig galdekanal, tolvfingertarm og bukspyttkjertel og blok med de relaterede nerver og kar.
- Injicer ca. 0,1 ml blå neopren latex (tilsæt en dråbe blå blæk til 10 ml af den fortyndede hvide neopren latex) til galdeblæren for at mærke galdesystemet.
- Efterfixering natten over med 4% PFA ved 4 ° C til helmonteret immunfarvning.
Forsigtig: PFA er toksisk. Undgå at håndtere PFA direkte. PFA skal bruges i et røgskab.
3. Whole-Mount Immunohistochemistry
Bemærk: I hele protokollen, herunder under vask, antistofinkubation og farvning, thE-prøven skal forblive på nutatoren, forsigtigt gynger ved stuetemperatur eller ved 4 ° C.
- Dag 1: Enzymatisk behandling og inaktivering af potentiel endogen peroxidase
- Vask den tilberedte prøve med DW 4x i 1 time hver ved stuetemperatur i et glasflaske med passende størrelse. Rock prøven forsigtigt på nutatoren for at fjerne PFA. Undgå at beskadige prøven ved udveksling af løsninger.
- Til fremstilling af 1% (w / v) orthoperiodinsyre opløses 1 g orthoperiodinsyre i 100 ml DW.
- Inkuber prøven i 1% orthoperiodinsyre i 20 minutter ved stuetemperatur for at forhindre enhver iboende peroxidase-reaktion.
- Tilbered 0,004% (vægt / volumen) papain ved at opløse 0,004 g papain i 100 ml 0,025 mol / L Tris-HCI buffer (pH 7,6).
- Vask prøven med DW i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Inkuber prøven i frisklavet 0,004% papain i 2 timer ved 37 ° C i et bad med konstant temperatur under forsigtig gnibning.
- Vask prøven med DW i 50-60 minutter ved stuetemperatur.
- Opbevar prøven i 4% PFA ved 4 ° C / N.
- Dag 2: Enzymatisk behandling
- Vask den lagrede prøve med DW 4 gange i 1 time hver ved RT.
- Inkuber prøven i frisklavet 0,004% papain i 2 timer ved 37 ° C i et bad med konstant temperatur under forsigtig gnibning.
- Vask prøven med DW i 50-60 minutter ved stuetemperatur. Opbevar prøven i 4% PFA ved 4 ° C / N.
- Dag 3: Frysebehandling
- Vask den gemte prøve med DW 4x i 1 time hver ved RT som ovenfor.
- Tilbered 2,5% (vægt / volumen), 5% (vægt / volumen) og 10% (vægt / volumen) saccharose ved opløsning af 2,5 g, 5 g og 10 g saccharose i 100 ml 0,01 M PBS PH 7,4).
- Dyp prøven i 2,5% (vægt / volumen), 5% (vægt / volumen) og 10% (vægt / volumen) saccharose i 30 minutter hver.
- Frys prøven ved -20 ° C i 30 - 60 minutter og derefter helt optø det ved stuetemperatur Gentag cyklus 3x.
- Til sRepare 2% Triton X-100 (v / v), tilsættes 2 ml Triton X-100 til 100 ml 0,01 M PBS (pH 7,4).
- Opbevar prøven i 2% Triton X-100 ved 4 ° C / N.
- Dag 4: inkubation af primær antistof
- Forbered fortyndingsopløsningen af det primære antistof ved at opløse 0,2 g bovint serumalbumin (BSA), 0,3 ml Triton X-100 og 0,1 g natriumazid i 100 ml 0,01 M PBS (pH 7,4).
Forsigtig: Natriumazid er akut toksisk. Indånding og berøring skal undgås. Brug passende PPE. - Fortynd det primære antistof (NFP) 1: 600 i ovennævnte fortyndingsbuffer (trin 3.4.1). Inkuber prøven med NFP antistof ved 4 ° C i 3-6 dage, idet prøven forsigtigt gynger på nutatoren. Større enheder vil kræve øgede inkubationstider.
- Forbered fortyndingsopløsningen af det primære antistof ved at opløse 0,2 g bovint serumalbumin (BSA), 0,3 ml Triton X-100 og 0,1 g natriumazid i 100 ml 0,01 M PBS (pH 7,4).
- Sekundær antistofinkubation
- Vask prøven i PBS 4x i 1 time ved RT for at fjerne ubundet primært antistof. Forbered fortyndingsopløsningen for det sekundære antistof ved at opløse 0,2 g BSA og 0,3 ml Triton X-100 i 100 ml 0,01 M PBS (pH 7,4).
- Fortynd det sekundære antistof (peroxidase-konjugeret, affinitetsrenset får-anti-mus-IgG-HRP) 1: 600 i fortyndingsbufferen (trin 3.5.2). Inkuber prøven med det sekundære antistof ved 4 ° C i 3 d, og hold prøven gyngende forsigtigt på nutatatoren.
- farve
- Klargør DAB-farvningsopløsning ved at tilsætte 0,002 g 3,3'-diaminobenzidin-tetrahydrochlorid (DAB) til 100 ml 0,05 mol / L Tris-HCI-buffer (pH 7,6) under et røgskab, idet opløsningen holdes i mørke.
- Vask prøverne ved stuetemperatur i PBS 4x i 1 time hver.
- Tilsæt 10 μl 30% H 2 O 2 i frisklavet DAB-farveopløsning og inkuber med opløsningen ved 4 ° C / N eller 3 d, mens du forsigtigt rocker på nutatatoren.
- Stop reaktionen med plaCing prøven i PBS med 0,04% natriumazid når den optimale farvningsintensitet er nået.
BEMÆRK: Undgå brug af natriumazid indtil dette trin, da det hæmmer peberrodsperoxidase.
- Billeddannelse af det farvede væv
- Overfør forsigtigt prøven til en petri-glasskål (5 cm høj, 10 cm i diameter), der indeholder PBS. Optag helmonterede billeder ved hjælp af et kamera monteret på et stereomikroskop.
BEMÆRK: Fuldvævet væv skal hele tiden afbildes, mens det nedsænkes fuldstændigt i PBS på en transparent glasskål.
- Overfør forsigtigt prøven til en petri-glasskål (5 cm høj, 10 cm i diameter), der indeholder PBS. Optag helmonterede billeder ved hjælp af et kamera monteret på et stereomikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 - 4 viser typiske resultater for NFP-positive nervefibre i den ekstrahepatiske galde i S. murinus . Antistoffet mod NFP reproducerbart mærket innervationen i hele billedet af den ekstrahepatiske galde ( figur 1 ), galdeblæren ( figur 2 ), den øvre galdekanal ( figur 3 ) og duodenal papillaområdet ( figur 4 ) med høj specificitet og minimal baggrund.
For alle væv i prøven, uanset form og størrelse, kan tegmentale nerver farves på samme tid. Ud over indervation af den ekstrahepatiske galde, blev løbens og fordelingsdensiteten af spiserøret i spiserøret og maven utvetydigt udvist ( figur 1 ).
figur 2 ).
I den øvre galdekanal blev to typer af nervebundne mærket. De fine nervebundter dannede et uregelmæssigt og tæt netværk af nerver, løb klæbende og opholdt sig på / i galdevejen; De tykkere neurale bundter blev fordelt parallelt med overfladen af galdevejen ( figur 3 ).
Den fælles galdekanal blev mærket med blå neopren latex og karrene med hvid neopren latex. De tynde nervefibre i slutningen af den fælles galdekanal og det duodenale papillaområde blev tydeligt demonstreret med høj c Ontrast ( figur 4 ).
Figur 1: NFP-positive nervefibre i galdevejen, spiserøret og maven. Pile viser vagus kører langs spiserøret til maven. CBD, Common Bile Duct; Es, spiserøret; St, mave. Skalestang = 1.300 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: NFP-positive nervefibre i gallbladderen. Gærblærens blodkar blev mærket med hvid latex. Rigelig indervation opstod i galdeblærens hals (pilene). Målestang = 1.000 μm.Ref = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55483/55483fig2large.jpg" target = "_ blank"> Venligst klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: NFP-positive nervefibre i den øvre galdekanal. To typer af nervebundt blev observeret. En type var de fine nervebundter, der løb klæbende og bød på / i den ekstrahepatiske galde (pilene); Den anden type var tykkere neurale bundter, der blev fordelt parallelt med overfladen af den ekstrahepatiske galdeveje og løb mellem galdeblæren og tolvfingertarmen (trekanter). PV, Portal Vein. Målestang = 650 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: NFP-positive nervefibre i det duodenale papillaområde. Den fælles galdekanal blev mærket med blå latex og karrene med hvid latex (*). Pile viser inderveringen af enden af den fælles galdekanal, og trekanter viser inderveringen af det duodenale papillaområde (P), der kommer fra den fælles galdekanal og kar. Målestang = 1.000 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette værk beskriver den eksperimentelle procedure til visualisering af det ekstrahepatiske galdevejs indervering ved anvendelse af et antistof mod neurofilamentprotein. Denne protokol blev tilpasset fra protokollen beskrevet af Kuratani og Tanaka 1 , 2 , 3 .
For dette eksperiment skal du planlægge tidslinjen for hver af eksperimenterne, da hele monteringsfarvningen går videre i 2-3 uger. Skibet, som indeholder vævet, skal altid roteres på en nutator, undtagen under fryseprocessen. Specielt under inkubation med de primære og sekundære antistoffer blev prøven anbragt i et kølelagerkammer under rotering på en nutator for at sikre ensartet eksponering af prøven til reaktionsopløsningerne. Flere opløsninger - 1% (w / v) orthoperiodinsyre, 0,004% (w / v) papain og fortyndingsbufferen for den primære / sekundære antiboDør - skal gøres frisk til hvert forsøg. I hele protokollen skal opløsningerne udhældes i stedet for at blive fjernet med tang 15 for at undgå at røre og beskadige prøven ved udskiftning af opløsninger.
Efter fastsættelse med PFA skal prøverne vaskes tilstrækkeligt med DW eller PBS. Derudover er den enzymatiske behandling med papaininkubationen vigtig. Varmen og enzymet anvendt til antigenudvinding hjælper med at fremstille vævet til antistofpenetration. For at øge opløsningernes indtrængning skal vævets ydre membran blive forstyrret ved en frysebehandling ved -20 ° C i 30 minutter eller -80 ° C / N15.
Det er vigtigt at nedsænke eksperimentprøven fuldstændigt i tilstrækkelige mængder bufferopløsning for at sikre, at opløsningen kan inkubere hele prøven. Inkubationstiden for det primære antistof skal bestemmes empiriskD for forskellige væv og prøvestørrelser. Normalt skal det være 3 dage for en 2-3 cm prøve. Den optimale fortynding skal bestemmes empirisk for hvert antistof. En fortynding på 1: 600 anbefales til både primære og sekundære antistoffer ved anvendelse af den passende antistofbuffer.
Dette værk beskriver i detaljer protokollen for en alsidig helmonteret immunohistokemisk tilgang til afsløring af neurofilamentproteinekspression i galdevejen fra S. murinus . Denne metode kan bruges til at analysere innerveringen af alle viskoser i mange arter. Desuden kan denne protokol også tilpasses til at teste andre neuronale antistoffer, men optimering af antistofferne bør udføres.
Teknikken var imidlertid begrænset til mærkning af lavt nervevæv og ved konstruktion af en tredimensionel model af innervering. Det kunne heller ikke identificere egenskaberne af nervefibre ( dvs. sympatisk eller parAsympatisk, motorisk eller sensorisk osv. ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Forfatterne har ingen anerkendelser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| orthoperiodic acid | Wako | 162-00732 | |
| papain | Wako | 164-00172 | |
| bovine serum albumin (BSA) | Wako | 010-15131 | |
| sodium azide | Nacalai Tesque | 312-33 | |
| neurofilament protein (NFP) antibody | Dako | M0762, lot 089, clone: 2F11 | |
| peroxidase-conjugated affinity-purified sheep anti-mouse IgG-HRP | MBL | Code 330 | |
| 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) | Wako | 349-00903 | |
| imidazole | Sigma | I-0125 |
References
- Kuratani, S., Tanaka, S., Ishikawa, Y., Zukeran, C. Early development of the hypoglossal nerve in the chick embryo as observed by the whole-mount nerve staining method. Am. J. Anat. 182 (2), 155-168 (1988).
- Kuratani, S., Tanaka, S. Peripheral development of the avian vagus nerve with special reference to the morphological innervation of heart and lung. Anat. Embryol. (Berl). 182 (5), 435-445 (1990).
- Kuratani, S., Tanaka, S. Peripheral development of avian trigeminal nerves. Am. J. Anat. 187 (1), 65-80 (1990).
- Yi, S. Q., et al. House musk shrew, Suncus murinus: a novel and natural obesity-resistant animal model. Obes. Metab. 6, 22-28 (2010).
- Yi, S. Q., et al. Surgical anatomy of innervation of the gallbladder in humans and Suncus murinus with special reference to morphological understanding of gallstone formation after gastrectomy. World J. Gastroenterol. 13 (14), 2066-2071 (2007).
- Yi, S. Q., et al. Anatomical study of the pancreas in the house musk shrew, Suncus murinus, with special reference to the blood supply and innervation. Anat. Rec. A Discov. Mol. Cell Evol. Biol. 273 (1), 630-635 (2003).
- Yi, S. Q., et al. Surgical anatomy of the innervation of the major duodenal papilla in humans and Suncus murinus, from the perspective of preserving innervation in organ-saving procedures. Pancreas. 30 (3), 211-217 (2005).
- Yi, S. Q., et al. Surgical anatomy of the innervation of the pylorus in humans and Suncus murinus, in relation to the surgical technique for pylorus-preserving pancreatoduodenectomy. World J. Gastroenterol. 12 (14), 2209-2216 (2006).
- Yi, S. Q., Ren, K., Kinoshita, M., Takano, N., Itoh, M., Ozaki, N. Innervation of Extrahepatic Biliary Tract, With Special Reference to the Direct Bidirectional Neural Connections of the Gall Bladder, Sphincter of Oddi and Duodenum in Suncus murinus, in Whole-Mount Immunohistochemical Study. Anat. Histol. Embryol. 45 (3), 184-188 (2016).
- Wang, H., et al. Neurofilament proteins in axonal regeneration and neurodegenerative diseases. Neural Regen. Res. 7 (8), 620-626 (2012).
- Wyatt, A. P. The relationship of the sphincter of Oddi to the stomach, duodenum and gall-bladder. J. Physiol. 193 (2), 225-243 (1967).
- Mawe, G. M., Kennedy, A. L. Duodenal neurons provide nicotinic fast synaptic input to sphincter of Oddi neurons in guinea pig. Am. J. Physiol. 277, G226-G234 (1999).
- Seo, J. H., Cho, S. S., Lee, I. S., Lee, H. S. Anatomical and neuropeptidergic properties of the duodenal neurons projecting to the gallbladder in the golden hamster. Arch. Histol. Cytol. 65 (4), 317-321 (2002).
- Padbury, R. T., Furness, J. B., Baker, R. A., Toouli, J., Messenger, J. P. Projections of nerve cells from the duodenum to the sphincter of Oddi and gallbladder of the Australian possum. Gastroenterology. 104 (1), 130-136 (1993).
- White, J. J., Reeber, S. L., Hawkes, R., Sillitoe, R. V. Wholemount immunohistochemistry for revealing complex brain topography. J. Vis. Exp. (62), e4042 (2012).
