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Methodenartikel

Ein IL-8 transientes transgenisiertes Mausmodell für die

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DOI:

10.3791/55499

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7. Juli 2017

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1Department of Medicine, General Pathology Division, Cystic Fibrosis Translational Research Laboratory "D. Lissandrini", University of Verona, 2Corporate Preclinical R&D, Chiesi Farmaceutici S.p.A., 3Department of Diagnostic and Public Health, Microbiology Division, University of Verona, 4Dipartimento di Scienze Medico-Veterinarie, University of Parma, 5Department of Biomedical Biotechnological and Translational Sciences, University of Parma, 6Department of Computer Science, University of Verona, 7Department of Neurological, Biomedical and Movement Sciences, University of Verona, 8Cystic Fibrosis Regional Center (CFC), AOUI Verona

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Das hier beschriebene Verfahren ermöglicht die Visualisierung der IL-8-Promotor-abhängigen Entzündungsaktivierung in den Lungen von Mäusen durch nicht-invasive Biolumineszenz-Bildgebung (BLI). Das gleiche Tier kann BLI mehrmals für bis zu zwei Monate ab dem Zeitpunkt der Auslieferung des Luciferase-Reporter-Konstrukts unterworfen werden.

Zusammenfassung

Atemwegsentzündung ist oft mit bakteriellen Infektionen assoziiert und stellt eine wichtige Determinante der Lungenerkrankung dar. Die in vivo- Bestimmung der entzündungshemmenden Fähigkeiten verschiedener Faktoren ist anspruchsvoll und erfordert terminale Verfahren wie die bronchoalveoläre Spülung und die Entfernung von Lungen für die In-situ- Analyse, wobei die Längsvisualisierung in derselben Maus verhindert wird. Hier wird die Lungenentzündung durch die intratracheale Instillation von Pseudomonas aeruginosa Kulturüberstand (SN) bei transient transgenisierten Mäusen induziert, die das Luciferase-Reportergen unter der Kontrolle eines heterologen IL-8-Rinder-Promotors exprimieren. Die Luciferase-Expression in der Lunge wird durch in vivo- Biolumineszenzbild (BLI) -Analyse über einen Zeitabschnitt von 2,5 bis 48 Stunden nach der Instillation überwacht. Die Prozedur kann mehrmals innerhalb von 2 - 3 Monaten wiederholt werden, so dass die Auswertung der Entzündungsreaktion bei denselben Mäusen möglich istDie Notwendigkeit, die Tiere zu beenden. Dieser Ansatz erlaubt die Überwachung von pro- und entzündungshemmenden Faktoren, die in der Lunge in Echtzeit wirken und für funktionelle und pharmakologische Studien geeignet erscheinen.

Einleitung

Chronische Lungenerkrankungen wie Asthma, chronisch obstruktive Lungenkrankheit (COPD), zystische Fibrose (CF) und Bronchiektase sind durch eine Atemwegsentzündung gekennzeichnet. Atemwegsentzündung ist gekennzeichnet durch Ödeme, zelluläre Infiltration, T-Lymphozyten- und Mastzellaktivierung, erhöhte Atemwegssekretionen und übermäßige Kollagenablagerung. CF ist eine Multisystem-Störung, und seine Hauptursache für Mortalität und Morbidität ist die lungenbakterielle Infektion mit zunehmender pulmonaler Exazerbation. Der Rückgang der Lungenfunktion prognostiziert ein deutlich schlechteres Ergebnis 1 , 2 , 3 , 4 .

Der Entzündungszustand der Atemwege wird gewöhnlich durch die Auswertung von immunologischen Markern beobachtet, die während des entzündlichen Prozesses in dem von den unteren und oberen Atemwegen abgeleiteten Material, wie z. B. Sputum,Ults Bronchoskopien werden auch durchgeführt 5 . Murine Modelle sind wertvolle Werkzeuge für die Untersuchung der Pathogenese und Evolution von Krankheiten, die durch eine Atemwegsentzündung gekennzeichnet sind und für die wirksame Behandlungen oder Kuren noch nicht identifiziert wurden. Tiermodelle der Lungeninfektion und -entzündung wurden verwendet, um Asthma- und Wirts-Pathogen-Wechselwirkungen zu untersuchen, einschließlich der Rolle von Chemikalien, die menschliche Zustände simulieren ( z. B. Zigarettenrauchbelastung, LPS, Elastase, Ovalbumin, Poly I: C usw.) Ebenso wie Kombinationen der oben genannten) 6 . Die Messung von entzündungsbezogenen Parametern erfordert das Opfer der Tiere, da invasive Ansätze erforderlich sind, um Faktoren wie Bakterienbelastung, Zytokine in der Lunge und gesammelte bronchoalveoläre Spülung (BAL) Flüssigkeit zu messen. Auch histologische Untersuchungen sind oft erforderlich. Die Möglichkeit, Informationen über die entzündliche Reaktionskinetik zu erhalten, erfordert die Verwendung von numErous Mäuse. Daher ist eine Technik, die es ermöglicht, solche Informationen ohne die Notwendigkeit zu erhalten, die Tiere zu opfern, auf technischen, ethischen, ökonomischen und operativen Grundlagen wertvoll.

IL-8 ist ein wesentlicher Spieler im Entzündungsprozess und rekrutiert Leukozyten an das entzündete Gewebe. Es stellt eine molekulare Auslesung für die Untersuchung der Entzündungswegaktivierung dar. MIP-2 und KC können funktionelle Homologe von humanem IL-8 bei Mäusen sein. Mäuse exprimieren nur einen potentiellen IL-8-Rezeptor, ein Homolog von humanem CXCR2 7 , 8 , aber sie sind in der Lage, einen heterologen IL-8-Genpromotor zu modulieren, der ein Reportergen antreibt. Ein Lungenentzündungsmurinmodell wurde kürzlich nach der Beobachtung entwickelt, dass ein Rinder-IL-8-Promotor / Luciferase-Reporter-Konstrukt in Mäusen transaktiviert werden kann. Diese Funktion ermöglicht die Verwendung von Biolumineszenz-Bildgebung (BLI) zur Überwachung der entzündlichen Reaktion im Leben aNimals 9

Dieses Modell wurde angepasst, um Entzündungen zu untersuchen, die durch bakterielle Exoprodukte ausgelöst wurden ( z. B. LPS oder Produkte, die durch Bakterienstämme freigesetzt wurden) oder TNFalpha 10 , 11 . Der Wirkstoffforschungsprozess konzentriert sich auf die Entwicklung und Optimierung von alten und neuen entzündungshemmenden Molekülen, die Lungenerkrankungen wie CF, Asthma und COPD behandeln können. Diese neuen chemischen Einheiten müssen schnell und bequem in Tiermodellen getestet werden, die mit spezifischen klinischen Phänotypen verknüpft werden können, um das Design von intelligenten klinischen Studien zu erleichtern.

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Protokoll

Alle beschriebenen Tierversuche wurden von dem intramuralen Tierschutzkomitee für Tierversuche durch das interdepartementale Zentrum für experimentelle Forschungsservice an der Universität von Verona genehmigt und entsprechen der europäischen Richtlinie 2010/63 UE, Italienisch D.Lgs 26/2014 und dem überarbeiteten "Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren", Washington, DC: National Academy Press, 1996. Dieses Protokoll und Experimente wurden von den National Institutes of Health (n 273/15) genehmigt. Die Tiere hatten freien Zugang zu Standard-Nagetier-Chow und weichem Leitungswasser und wurden für mindestens 5 Tage auf die lokalen Vivarium-Bedingungen (Raumtemperatur: 20 - 24 ° C, relative Feuchtigkeit: 40 - 70%, Hell-Dunkel-Zyklus: 12 h akklimatisiert ) Vor jeder Behandlung.

1. In vivo Gen Lieferung

  1. Verwenden Sie eine laminare Strömungshaube, um die in vivo- Zufuhrreagenz / Nukleinsäurekomplexe herzustellen.
  2. Definiere das experimentelle Protokoll aNd-Parameter nach den Anweisungen des Herstellers in vivo .
    1. Verwenden Sie ein Gesamtinjektionsvolumen von 200 μl Komplexen pro Maus.
    2. Beginne mit 40 μg DNA, suspendiert in endotoxinfreiem Wasser; Der Optimierungsbereich kann 60 μg erreichen.
      HINWEIS: Die Endkonzentration der Nukleinsäure im Injektionsvolumen darf nach den Anweisungen des Herstellers 0,5 μg / μL nicht überschreiten.
    3. Verwenden Sie ein N / P-Verhältnis von 6 - 8 (0,12 - 0,16 μl Lieferreagenz pro μg Nukleinsäure). Berechnen Sie das entsprechende Reagenzvolumen.
      HINWEIS: Die Komplexe sollten für eine effektive Zelleingabe kationisch sein. Das N / P-Verhältnis ist definiert als die Anzahl der Stickstoffreste (N) auf dem in vivo- Zustellreagenz pro Nukleinsäurephosphat (P) und stellt das Maß für die Ionenbilanz innerhalb der Komplexe dar.
  3. Verdünnen Sie die berechnete Menge (siehe Schritt 1.2.1) der Nukleinsäure in 5% Glukose (endgültig konzentriertRation) unter Verwendung von 10% Glucose-Stammlösung (mitgeliefert) und sterilem Wasser. Stellen Sie sicher, dass das Verdünnungsvolumen die Hälfte des Endeinspritzvolumens ist. Vortex sanft oder mischen durch Pipettieren auf und ab.
  4. Verdünnen Sie die berechnete Menge (siehe Schritt 1.2.3) des Lieferreagenzes in die Hälfte des Injektionsvolumens von 5% Glukose (Endkonzentration) mit der 10% igen Glucose-Stammlösung (mitgeliefert) und sterilem Wasser. Vortex sanft und drehen bei 13.000 xg für 15 s.
  5. Füge die obigen verdünnten Abgabereagenzien auf die verdünnte Nukleinsäure auf einmal hinzu. Mischen Sie sie durch sanftes Vortexen und drehen Sie sich bei 13.000 xg für 15 s.
  6. Inkubieren Sie die Mischung aus Schritt 1.5 für 15 min bei Raumtemperatur.
    HINWEIS: Ab diesem Zeitpunkt sind die Komplexe für 4 h bei Raumtemperatur und für bis zu 7 Tage bei Lagerung bei 4 ° C stabil.
  7. Führen Sie Schwanz-Vene-Injektionen unter Verwendung von Komplexen, die bei Raumtemperatur äquilibriert wurden. Legen Sie den Maus-Schwanz in warmes Wasser (50 - 53 ° C) für 30 s, um Vene-Dilatation zu ermöglichen.
    1. Legen Sie die Maus in das Rückhaltegerät. Setzen Sie eine 27- bis 30-Gauge-Nadel in die Schwanzvene in einem Winkel von 20 - 30 ° ein und ziehen Sie langsam 200 μl ein. Nach Beendigung die Nadel entfernen und Druck auf die Injektionsstelle ausüben.
      HINWEIS: Eine leichte Ausbuchtung im Schwanz während der Injektion zeigt eine falsche Positionierung an. Wenn dies der Fall ist, entfernen Sie die Nadel und wiederholen Sie den Prozess proximal zur vorherigen Seite.
  8. Visualisierung der Genexpression durch Durchführung von in vivo BLI (siehe Schritt 2) bei 24 und 48 h nach der intravenösen Injektion.

2. In vivo BLI

HINWEIS: Im Vorfeld eine frische Stammlösung von 15 mg / ml D-Luciferin in DPBS vorbereiten, mit einer 0,22 μm Filtereinheit filtrieren und bei -20 ° C aufbewahren.

  1. Legen Sie die Mäuse in eine klare Plexiglas-Anästhesiekammer. Stellen Sie sicher, dass die Isoflurakammer voll ist. Wenn sie bereit sind, die Tiere zu betäuben, stellen Sie sicher, dass die Pumpe (lEft) und Kammer (rechts) sind eingeschaltet. Drehen Sie das Isofluran-Zifferblatt auf 2,5% für die Induktion und 2% für die Wartung. Tiere innerhalb der IVIS-Kammer werden während der Bildaufnahme unter 2,5% Isofluoran-Anästhesie gehalten.
  2. Nachdem die Mäuse vollständig betäubt wurden, injizieren Sie 10 ml / kg Körpergewicht der D-Luciferin-Lösung 15 min vor der Bildgebung in einer intraperitonealen Route.
    ANMERKUNG: Eine kinetische Studie über D-Luciferin sollte durchgeführt werden, um die Zeit des Signalpeaks nach der Verabreichung von D-Luciferin zu bestimmen.
  3. Öffnen Sie das In-vivo- Bildgebungssystem und bereiten Sie die Bilderzeugungskammer vor, indem Sie es mit einem Stück schwarzem Karton verkleiden (nach Fertigstellung entsorgen). Legen Sie die Nasenkonus nach Bedarf für eine korrekte Anästhesie (verwenden Sie einen Kegel pro Maus).
    ANMERKUNG: Die Röhre, die die Anästhesie an das Instrument liefert, ist aufgeteilt, so dass die gleiche Anästhesiekonzentration an die im Anbausystem befindlichen Anästhesieverteiler angetrieben wird.
  4. Übertragen Sie die Mäuse (bis zu 5) aus dem bOchse an die Nasenkegel, die an der Mannigfaltigkeit im Abbildungssystem angebracht sind und die Tür schließen. Bildaufnahme dauert 5 min.
  5. Erwerben Sie ein BLI mit der Software des Herstellers wie folgt.
    1. Initialisieren der Software. In der In-vivo- Bildgebung System Akquisition Control Panel, setzen Sie ein Häkchen neben Luminescent . Vergewissern Sie sich, dass die Einstellung des Erregungsfilters blockiert ist und die Einstellung des Emissionsfilters geöffnet ist.
    2. Klicken Sie auf die Pfeile: Für den Lumineszenz-Imaging-Modus wählen Sie eine 5-Minuten-Belichtungszeit, Binning 8 und F / Stop 1; Wählen Sie für den Photograph Imaging-Modus Binning 4 und F / Stop 8 aus.
    3. Wählen Sie aus der Dropdown-Liste "Gesichtsfeld" D, 19 cm und eine Betreffhöhe von 1,5 cm aus. Klicken Sie auf Erwerben, wenn Sie bereit sind, das Bild zu erwerben.
  6. Wenn die Bilderfassung abgeschlossen ist, legen Sie die Mäuse wieder in ihre Käfige.
  7. Quantifizierung der aus bestimmten Regionen ausgesendeten Photonen mit der Software des Herstellers.
    1. Klicken ROI Tools in der Werkzeugpalette. Wählen Sie im ROI Tools die Option ROI aus der Dropdown-Liste Typ aus.
    2. Klicken Sie auf das Quadrat-Symbol und zeichnen Sie einen quadratischen ROI mit den richtigen Dimensionen, um den Thorax eines Tieres zu decken. Kopiere und füge den ROI für jedes Tier ein, um ROIs mit den gleichen Dimensionen zu erhalten. Klicken Sie im ROI Tools-Panel auf ROM messen , um die Messungen der Gesamtintensität in den ROIs zu erhalten.
    3. Beachten Sie die ROI-Messdaten für alle ROIs, die in den Bildern oder Sequenzen während einer Sitzung erstellt wurden (ein ROI pro Zeile). Klicken Sie auf Exportieren und wählen Sie den Ordner aus, in dem die Datei gespeichert wird.

3. Mäuse-Herausforderung mit pro-entzündlichen Stimuli

ANMERKUNG: Vor der Maus-Herausforderung mit pro-inflammatorischen Reizen, überprüfen Sie die Baseline-Aktivierung durch i n vivo BLI (siehe Schritt 2). Mindestens 7 Tage müssen zwischen In-vivo- Gen-Lieferung und Mous passierenHerausforderung, um die milde und vorübergehende Entzündung zu verschwinden.

  1. Bereiten Sie die Ausrüstung für die intratracheale Instillation vor (siehe Abbildung 1 und Abbildung 2 ).
    1. Verbinden Sie die 5-ml-Einwegspritzen mit der Feder (C, E), einer 100 μl Spritze (B) und einem Einweg-Messgerät (D) mit dem 3-Wege-Hahn (A). Stellen Sie das System auf den Träger (H). Stellen Sie das System auf den Träger (H).
    2. Verbinden Sie den PE190 Mikro-Schlauch (F) mit dem Einweg-Messgerät (D) und dem Stift-Jahrhundert (G).
    3. Füllen Sie die 5-ml-Spritze mit 800 μl Luft und drehen Sie den 3-Wege-Hahn.
      HINWEIS: Füllen Sie das Röhrchen mit Pseudomonas aeruginosa Kulturüberstand durch Absaugen von 50 μl in die 100 μl Spritze.

figure-protocol-1
Abbildung 1: Schematische RepreseEine einzelne Komponente des intratrachealen Gerätes.
(A) 3-Wege-Hahn, (B) 100-μL Hamilton-Spritze, (C) Einweg-5-ml-Spritze, (D) Einweg-Messgerät, (E) Einweg-5-ml-Spritze mit Feder, (F) PE190 Mikro-medizinischen Schlauch , (G) pen Jahrhundert und (H) Unterstützung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

figure-protocol-2
Abbildung 2: Darstellung des zusammengesetzten intratrachealen Gerätes.
Die Identifikationen sind die gleichen wie in Abbildung 1 . bitte klickenHier eine größere Version dieser Figur zu sehen.

  1. Anästhesieren der Mäuse unter Verwendung einer Isofluran-Verdampferkammer, die auf 2,5% Isofluran mit Sauerstoff gemischt ist.
  2. Überwachen Sie das Tier, um die Auswirkungen des Anästhetikums nach 3 - 5 min zu bewerten.
    HINWEIS: Um zu bestätigen, dass die Maus vollständig betäubt ist, überwachen Sie die folgenden Zeichen sorgfältig: Die verlangsamte Atemfrequenz sollte sich verlangsamen, mangelnde Armdehnung beim Aufheben am Hals und ein Mangel an Reaktion, wenn die Hinterbeine angeregt werden. Warten Sie noch einige Minuten und überprüfen Sie noch einmal, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren, wenn diese Kriterien nicht erfüllt sind.
  3. Legen Sie die anästhesierte Maus auf die Plexiglas-Intubationsplattform und hängen sie mit ihren Schneidezähnen, die auf den Draht gelegt werden.
  4. Schalte das Laryngoskop mit der linken Hand ein (für rechtshändige Forscher) und packe ein paar stumpfen Pinzetten. Verwenden Sie die Spitze des Laryngoskops und die Pinzette, um vorsichtig den Mund zu öffnen.
  5. Zieh die Zunge heraus und hAlt mit der Pinzette zur Seite. Führen Sie die Laryngoskop Klinge in Richtung der Rückseite des Mundes. Halten Sie das Laryngoskop sehr sanft in einem 90 ° Winkel, bis die Öffnung der Trachea sichtbar ist. Halten Sie das Laryngoskop an Ort und Stelle.
  6. Benutzen Sie die andere Hand, nehmen Sie das Abgaberohr mit dem Ende des PE-Schlauches und stecken Sie es in die Trachea ein. Drehen Sie das Dreiwegeventil, um das Inokulum zu liefern. Ziehen Sie den Schlauch so schnell wie möglich aus der Trachea. Halten Sie die Maus für ein paar Sekunden aufrecht, um das Inokulum in die Lunge einatmen zu lassen.
    HINWEIS: Mäuse werden ersticken und sterben, wenn die Trachea zu lange blockiert ist.
  7. Entfernen Sie die Maus von der Plattform. Die Erholungszeit kann je nach Belastung variieren. Überwachen Sie die Maus sorgfältig, um sicherzustellen, dass das Tier innerhalb von 30 Minuten nach dem Eingriff vollständig wach ist.
  8. Intraperitoneal injizieren 150 mg / kg D-Luciferin und Bild der Lunge mit einem in vivo Bildgebung System 4, 24 und 48 h nach der intratrachealInstillation der Reize. Quantifizierung der aus bestimmten Regionen ausgesendeten Photonen mit der Software des Herstellers.

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Ergebnisse

Für die in vivo- Überwachung der Lungenentzündung bei Mäusen, die mit konzentriertem Bakterienüberstand (30x) mit abgesonderten Virulenzfaktoren herausgefordert wurden, wurde das trans-transgene Mausmodell von bIL-8-Luc verwendet. Die induzierte Entzündungsreaktion wurde durch in vivo- Bildgebung als eine Erhöhung des BLI-Signals nachweisbar. Pro-inflammatorische Aktivität war deutlich nachweisbar 2,5 h nach der Instillation, obwohl das BLI-Signal erreichte den höchsten...

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Diskussion

In einer früheren Arbeit 11 wurde ein Kontrast zwischen bIL-8-Luc-abhängigen BLI- und BAL-Markern gezeigt. Es beruhte auf dem differenzierten Grad der Empfindlichkeit innerhalb der Mäusestämme 12 . Aus diesem Grund erfordert die erste Anwendung des bIL-8-Luc-Modells auf einen anderen Mausstamm eine anfängliche Untersuchung der entzündlichen Reaktion sowohl in Bezug auf BLI als auch auf standardisierte entzündliche Marker.

Die Mäusentransfektion...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von der italienischen zystischen Fibrose-Stiftung Projekt FFC # 18/2013, FFC # 29/2015 und von der italienischen zystischen Fibrose Liga durch die Veneto Branch-Associazione Veneta Lotta contro la Fibrosi Cistica Onlus unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
FMT 2500 Fluoreszenztomographie-SystemPerkin Elmer Inc.Experimenteller Builder
IVIS Lumina Serie II Präklinisches In Vivo; BildgebungssystemPerkin Elmer Inc.Experimenteller Builder
MMPsense 750 FASTPerkin Elmer Inc.NEV10001EXSchützen Sie die Sonde vor Licht, lagern Sie sie bei 4 Grad; C
Weibliche Inzucht BalbCHarlan Laboratories ItalienVor der Anwendung wurden die Tiere mindestens 5 Tage lang an die lokalen Vivariumbedingungen akklimatisiert
bIL-8-Luc PlasmidAbteilung für Medizinische Veterinärwissenschaften, Universität Parma, ItalienLagern Sie das Plasmid bei -20 μg; C
pGL3basic vectorPromegaE1751Speichern Sie den Vektor bei -20 ° C
JetPEI Reagenz für DNA-TransfektionPolyplus Transfektion201B-001GDie DNA- und JetPEI-Mischung wurde mit einem endgültigen N/P-Verhältnis von 7
D-Luciferin, Kaliumsalz, 1 gPerkin Elmer, Inc. formuliert.122796Vor Licht schützen, bei -20 ° C lagern; C
Living Image SoftwareCaliper Life Sciences,ExperimentalBuilder
IsofluranESTEVE spa571329.8einatmen
Bio-Plex Cytokine Assay KitBio-Rad LaboratoriesM60-009RDPDLagern Sie das ungeöffnete Kit bei 4 & Grad; C
Automatisierter ZellzählerDasit XT 1800JExperimenteller Builder
Penn-Jahrhundert Modell DP-4M Trockener InsufflatorPenn-JahrhundertDPM-EXT
Gasanästhesiesystem XGI-8Perkin Elmer Inc.Experimental Builder
PE190 mikromedizinischer Schlauch2biologische Instrumente sncBB31695-PE/8
Spritze ohne Nadel 5 mLTerumoSS*05SE1Schneiden Sie die Bretter des Kolbens mit einer Schere
Hamilton 0,10 mL (Modell 1710)Gasdicht81022
Discofix 3-Wege HahnBraun4095111
Spritze mit Nadel 1 mLPic Lösung3,071,260,300,320Ohne Nadel verwenden
Kunststoff-Ernährungsschläuche 18ga x 50 mm2biologische Instrumente sncFTP-18-50Schräg die Spitze schneiden 
, Nicht

Referenzen

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Nachdrucke und Genehmigungen

Schlagwörter

IL 8 transgene Mausbiolumineszente Bildgebungberwachung von Lungenentz ndungenPseudomonas aeruginosa berstandIn vivo Gen bertragungD Luciferin Injektionintratracheale InstillationRegion of Interest Analysewiederholte Tier berwachungWirt Pathogen Interaktionen
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