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Ein Tandem-Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie-basierter Ansatz zur Analyse von Metabolit

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DOI:

10.3791/55558

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28. März 2017

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Georgetown University, 2Division of Infectious Diseases, Weill Cornell Medical College, 3Department of Medicine, Weill Cornell Medical College

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Extraktion von Metaboliten von Staphylococcus aureus und deren anschließenden Analyse mittels Flüssigchromatographie und Massenspektrometrie.

Zusammenfassung

In dem Bemühen, bakterielle Pathogene zu vereiteln, begrenzen Wirte oft die Verfügbarkeit von Nährstoffen an dem Ort der Infektion. Diese Einschränkung kann die Häufigkeit von Schlüsselmetaboliten ändern, auf die regulatorischen Faktoren reagieren, den Zellstoffwechsel einstellen. In den letzten Jahren sind eine Reihe von Proteinen und RNA als wichtige Regulatoren der Genexpression Virulenz entstanden. Beispielsweise reagiert das CodY Protein auf ein Niveau von verzweigtkettigen Aminosäuren und GTP und ist in niedrigen G + C Gram-positiven Bakterien weitgehend konserviert. Als globaler Regulator in Staphylococcus aureus, steuert CodY die Expression von Dutzenden von Virulenz und metabolischen Gene. Wir vermuten , dass S. aureus verwendet CodY, teilweise seinen metabolischen Zustand in dem Bemühen , zu verändern , um Nährstoff einschränkenden Bedingungen möglicherweise begegneten in der Host - Umgebung anzupassen. Diese Handschrift beschreibt ein Verfahren zur Extraktion und Analyse von Metaboliten aus S. aureus unter Verwendung von Flüssigchromatographie gekoppelt mit Massenspektrometry, ein Protokoll, das entwickelt wurde, um diese Hypothese zu testen. Das Verfahren zeigt auch Best Practices, die Strenge und Reproduzierbarkeit gewährleisten, wie biologischen eingeschwungenen Zustand und konstante Belüftung ohne die Verwendung von kontinuierlichen Chemostatkulturen beibehalten wird. Relativ zu dem USA200 Methicillin-empfindlicher S. aureus UAMS-1 parentalen Stamm zu isolieren, zeigte die isogene Mutante codY signifikante Anstiege in Aminosäuren aus Aspartat abgeleitet (zB Threonin und Isoleucin) und nimmt in ihren Vorläufern (zB Aspartat und O - Acetylhomoserin ). Diese Ergebnisse korrelieren gut mit Transkriptions Daten mit RNA-Seq - Analyse erhalten: Gene in diesen Bahnen hochreguliert zwischen 10- und 800-fach in der codY Nullmutante waren. Die Kopplung globale Analysen der Transkriptom und Metabolom kann zeigen, wie Bakterien ihren Stoffwechsel verändern, wenn sie mit Umwelt- oder Ernährungs Stress konfrontiert, potenziellen Einblicks in die phys Bereitstellungiologische Veränderungen im Zusammenhang mit Nährstoffverarmung während der Infektion erfahren. Solche Entdeckungen können den Weg für die Entwicklung neuartiger Antiinfektiva und Therapeutika ebnen.

Einleitung

Bakterielle Krankheitserreger müssen mit vielen Herausforderungen in der Host-Umgebung kämpfen. Neben dem direkten Angriff von Immunzellen, sondert der Wirt auch Nährstoffe wichtig für bakterielle Überleben und die Replikation zu erzeugen Ernährungs Immunität 1, 2. Um diese feindlichen Umgebungen zu überleben, zu implementieren bakteriellen Erregern Virulenzfaktoren. Einige dieser Faktoren lassen sich die Bakterien die Immunantwort zu entziehen; Andere Faktoren sind Verdauungsenzyme, wie Hyaluronidase, Thermonuklease und Lipase sezerniert wird , die die Bakterien ermöglichen, fehlende Nährstoffe nachzufüllen von Gewebe stammenden Bestandteile 3, 4, 5 raubend. Tatsächlich Bakterien Regulierungssysteme entwickelt haben, die den physiologischen Zustand der Zelle zur Produktion von Virulenz - Faktoren binden 6, 7, up class = "xref"> 8, 9, 10.

Eine wachsende Zahl von Hinweisen deutet auf CodY als entscheidender Regulator verbindet Stoffwechsel und Virulenz. Obwohl ersten 11 in Bacillus subtilis als Repressor des Dipeptids Permease (dpp) Gen entdeckt, wird CodY jetzt bekannt , um fast alle niedrigen G + C Gram-positive Bakterien , 12, 13 hergestellt werden und reguliert Dutzende von Genen in Kohlenstoff beteiligt und Stickstoffmetabolismus 14, 15, 16, 17, 18, 19. In pathogene Spezies, die Expression einiger der wichtigsten Virulenzgene 20, 21 CodY auch steuert,. ef "> 22, 23, 24, 25, 26, 27 CodY wird als ein DNA-bindendes Protein , das durch zwei Klassen von Liganden aktiviert: verzweigtkettigen Aminosäuren (BCAA, Isoleucin, Leucin und Valin [ILV]) und GTP . Wenn diese Nährstoffe reichlich vorhanden sind, reprimiert CodY (oder in einigen Fällen stimuliert) Transkription. Da diese Nährstoffe begrenzt werden, so wird CodY Aktivität progressiv verringert wird, in einer abgestuften Transkriptionsreaktion führt, daß erneut Routen durch verschiedene Stoffwechselwege Vorläufern zentralen Stoffwechsel verbunden 28, 29, 30.
Tandem - Flüssigkeitschromatographie gekoppelt mit Massenspektrometrie (LC-MS) ist ein leistungsfähiges Verfahren , das genau identifizieren und quantifizieren , kann kleinmolekulare intrazelluläre Stoffwechselprodukte 31. Wenn mit umschrift gepaartriptome Analyse (zB RNA-Seq), dieser analytische Workflow kann Einblick in die physiologischen Veränderungen liefern , die in Reaktion auf Umwelt- oder Ernährungs Stress auftreten. Hier stellen wir ein Verfahren zur Extraktion von Metaboliten Staphylococcus aureus - Zellen und die anschließende Analyse mittels LC-MS. Dieser Ansatz wird verwendet, um die pleiotropen Wirkungen von CodY auf S. aureus Physiologie zu demonstrieren.

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Protokoll

1. Herstellung von Pufferlösungen

  1. Bereiten phosphatgepufferter Salzlösung (PBS; pH 7,4) durch eine Stammlösung von 10 × PBS auf eine Endkonzentration von 1x mit Reinstwasser verdünnt wird (destilliertem und entionisiertem) Wasser.
  2. Bereiten Abschrecken Lösung durch Kombination von 2 ml Acetonitril, 2 ml Methanol, 1 ml ultrareinem H 2 O und 19 ul (0,1 mM Endkonzentration) Ameisensäure.
  3. Bereiten LC-MS Lösungsmittel A durch Zugabe von Ameisensäure (0,2% [v / v] Endkonzentration) zu Reinstwasser.
  4. Bereiten LC-MS Lösungsmittel B durch Zugabe von Ameisensäure (0,2% [v / v] Endkonzentration) zu Acetonitril.
    HINWEIS: Alle Lösungen sollten mit den höchsten reinen Reagenzien zur Verfügung (in der Regel HOCHLEISTUNGSFLÜSSIGKEITSCHROMATOGRAPHIE grade) hergestellt werden. Die Lösungen sollten vor jedem Experiment frisch hergestellt werden und auf Eis gelagert vor der Verwendung.

2. Etablierung von Steady-state S. aureus Wachstum

  1. Streak S. aureus Stämme von Interesse für die Isolierung auf tryptischen Soja - Agar (TSA) aus einem gefrorenen Glycerolstammlösung. Inkubieren bei 37 ° C für 16-24 h.
  2. Beimpfen von 4 ml tryptischer Sojabrühe (TSB) oder ein anderes geeignetes Medium in sterilen Glas Inkubationsröhrchen mit einzelnen Kolonien jedes Stammes. Inkubieren geneigt (~ 70 ° Winkel) mit einer Drehung bei 60 Umdrehungen pro Minute (rpm) bei 37 ° C für 16-20 h.
    HINWEIS: Über Nacht Kulturen sind anfällig für Sauerstoff-Gradienten, wenn Standardverfahren, einschließlich der in Schritt 2.2 beschrieben, die zelluläre Physiologie beeinflussen. So beschäftigen wir eine Mehrfachstrategie zurück-Verdünnung biologischen eingeschwungenen Zustand (siehe Schritte 2,4-3,2, unten) zu gewährleisten.
  3. Verwenden eines Spektrophotometers die optische Dichte der Kulturen aus dem Schritt 2.2 bei 600 nm (OD 600) zu messen. Verwenden steriles Medium als optische Referenz (leer). Man verdünnt diese Zellen zu einer OD 600 von 0,05 in 50 ml sterilen TSB - Medium (vorgewärmt auf 37 ° C) in separaten, 250 mL DeLong Flaschen.
  4. IncuBeize der Kulturen bei 37 ° C in einem Wasserbad bei 280 Umdrehungen pro Minute unter Schütteln.
  5. Alle 30 min, nehmen OD 600 Messungen; wie die optischen Dichten zu erhöhen, kann es notwendig werden, die Kulturen mit TSB zu verdünnen, so dass sie innerhalb des linearen Absorptionsbereich des Spektrometers bleiben.
  6. Wenn Kulturen aus Schritt 2.5 eine OD 600 von ~ 0,8-1,0 erreichen, Subkultur sie in 50 ml 37 ° C auf TSB einen OD600 von 0,01-0,05 und wiederholen Sie die Schritte 2.4 und 2.5.

3. Probenentnahme-Setup

  1. Bereiten Sie die ein Bett aus zerkleinerten Trockeneis in einem geeigneten Gefäß (zB Glasschale, Eisbehälter oder Kühler).
  2. Da die optischen Dichten der Kulturen die gewünschte Erntepunkt nähern, 1 ml der für ≥5 min Lösung auf eine 35 mm Petrischale und unbehandeltem Vorkühl- auf Trockeneis abgeschreckt.
    HINWEIS: Der „gewünschte Erntepunkt“ wird in Abhängigkeit von experimentellen Zielen variiert. Zum Beispiel war, wenn man m untersuchenetabolites während der aeroben Wachstums Kennzahlen dieses Zustands umfassen Acetat Ausscheidung und Wieder Assimilation des Acetats in der post-exponentiellen Wachstumsphase 32, 33. Im allgemeinen sollte dieser Punkt in einem bestimmten Wachstumsstadium (zB exponentielle Phase). Die spezifischen OD 600 Werte mit dieser Stufe verbunden ist, kann zwischen verschiedenen Bakterienstämme und Wachstumsmedien variieren.
  3. Legen Sie eine Edelstahlfilter Fritte (vorgekühlte bis -20 ° C) in einem Gummi-Stopper und legt es auf einem Vakuumkolben mit einem Hausvakuum oder eine Vakuumpumpe befestigt.
  4. Anwenden des Vakuums und legen eine gemischte Celluloseester-Membran (0,22 um Porengrße) oben.
    HINWEIS: Es ist wichtig, einen Filter mit einem Durchmesser gleich demjenigen der Fritte zu verwenden und richtig, diese Filter zu zentrieren, um sicherzustellen, dass die Probe durch die Filter gezogen wird und nicht über den Rand. Benetzen der Membran mit eiskaltem, sterilen H 2 O kann helfenmit der Membran zu positionieren.

4. Probenernte

  1. Bei einer OD 600 von ~ 0,4-0,5, verwenden eine serologische Pipette 13 ml der Kultur aus dem Kolben zu entfernen und die Probe auf die Filter anzuwenden.
  2. Nachdem die gesamte Probe gefiltert wurde sofort abwaschen den Filter mit ≥5 mL eiskaltem PBS-Medium-assoziierte Metaboliten abzuwaschen.
  3. Trennen des Vakuums und mit einem Paar von sterilen Pinzette den Filter von der Fritte zu entfernen. Invertieren des Filters (Zellseite nach unten) in den vorgekühlten Quenchlösung.
    HINWEIS: Es ist wichtig , die obigen Schritte schnell (dh innerhalb von Sekunden) und so schnell auszuführen , wie die Flüssigkeit der schnelle Abschreckung der Zellen zu gewährleisten , wurde entfernt, verhaften metabolische Aktivität.
  4. Inkubieren Sie die Filter in dem Quench-Lösung auf Trockeneis für ≥20 min.
  5. Unter Verwendung einer sterilen Pinzette, invertieren die Filter (Zellseite nach oben) in die Petrischale und einer Mikropipette verwenden, um die Zellen zum Abspülen von ter Membran in die Quench-Lösung.
  6. die Zellen in Quenchlösung erneut suspendiert und dann überträgt die Zellsuspension auf ein sterilen 2 ml schlagfesten Röhrchen mit ~ 100 & mgr; L von 0,1 mm Siliciumdioxidperlen. Speicher dieses auf Trockeneis oder bei -80 ° C.

5. Metabolit Extraction

  1. Auftau-Proben auf nasses Eis und die Zellen in einem Homogenisator mit vier Bursts 30 s bei 6.000 Umdrehungen pro Minute, wobei 2 min Kühlperioden auf Trockeneis zwischen den Zyklen stören.
  2. Klärung die Lysate 15 Minuten in einer vorgekühlten, gekühlten Mikrozentrifuge bei maximaler Geschwindigkeit (dh 18.213 xg bei ≤4 ° C).
  3. Übertragen Sie den Überstand in ein sauberes Reaktionsgefäß.
  4. Unter Verwendung einer Mikropipette, übertragen einen kleinen Teil der Probe auf ein Mikrozentrifugenröhrchen für die Quantifizierung von Restpeptidgehalt in Schritt 6; Speichern der Rest bei -80 ° C.
    HINWEIS: Das Volumen der reservierten Probe variiert, abhängig von dem BCA-Assay in Schritt 6.1. DiesProbe sollte auf nassem Eis für die sofortige Analyse oder gefroren bei -80 ° C gelagert werden.

6. Bicinchoninsäure (BCA) Assay

  1. Durchführen eine BCA-Assay, wie durch den Hersteller empfohlen Kit, unter Verwendung von Proben aus dem Schritt 5.4 die Restpeptidkonzentration für jede Probe zu bestimmen.

7. LC-MS

  1. Mischen Sie 75 & mgr; l von S. aureus - Extrakt mit 75 & mgr; L LC-MS Lösungsmittel B, hergestellt in Schritt 1.4.
  2. Vortex zu mischen und Spin bei 13.000 × g für 5 min.
  3. Man gibt 100 & mgr; l Überstand in eine Flüssigchromatographie (LC) und die Kappe Phiole es. Stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen in der Probe eingefangen werden.
  4. Legen Sie die LC - Fläschchen auf die LC-MS - Autosampler und bearbeiten Sie die laufende Liste in der Software „Offline - Worklist - Editor.“
    1. Füllen Sie den "Sample Namen" (zB Wildtyp-1), "Sample Position" (zB P1-A1), "Method" (zB Formic Acid-negativ Methode) und "Data File" (zB Wildtyp-1) Spalten. Klicken Sie auf die Schaltfläche „Speichern Vorrat“ -Taste. Öffnen Sie die „Mass Spectrometry Data Acquisition Workstation“ Software und geben Sie den zuvor gespeicherten Arbeitsliste. Klicken Sie auf den „Start Vorrat Run“, um die kontinuierliche LC-MS-Messung zu starten.
  5. Trennen Sie die Proben auf einer Säule, verknüpfen Sie die Spalte mit einer Flugzeit (TOF) Spektrometer und koppelt den TOF-Spektrometer mit dem LC-System. Verwenden einer mobilen Phase Gradient wie folgt: 0-2 min, 85% Lösungsmittel B; 3-5 min, 80% Lösungsmittel B; 6-7 min, 75% Lösungsmittel B; 8-9 min, 70% Lösungsmittel B; 10-11.1 min, 50% Lösungsmittel B; 11,1-14 min, 20% Lösungsmittel B; und 14,1 bis 24 min, 5% Lösungsmittel B; am Ende mit einem 10 min Wieder Äquilibrierungsperiode mit 85% Lösungsmittel B und einer Fließgeschwindigkeit von 0,4 ml min -1.
  6. Unter Verwendung einer isokratischen Pumpe infundieren eine Referenzmasse Lösung mit dem Durchlauf für den gleichzeitigen Massenachse Kalibrierung zu ermöglichen.
    HINWEIS: Dieser Schrittbasiert auf dem Standard-Handbuch TOF-Spektrometer.
    1. Verwenden, um die Mischung aus Essigsäure D4 und Hexakis (1H, 1H, 3H-Tetrafluorpropoxy) Phosphazin als Referenzmasse Lösung auszuführen, um die Echtzeit-Kalibrierung. Verwenden Sie die isokratische Pumpe mit einer Fließgeschwindigkeit von 2,5 ml min -1 für die Infusion.

8. Batch-Korrektur von Ion Counts

  1. Bezeichnen jede Probe als Referenzprobe für die Chargenkorrektur zu dienen (zB Wildtyp, replizieren 1).
  2. Berechnen Sie die Summe der Ionenzählungen für alle Metaboliten innerhalb der Referenzprobe. Wiederholen Sie diese Berechnung für alle Proben.
  3. Unterteilen der Gesamtionenzahl jeder Probe durch die Gesamtionenzahl der Referenzprobe ein Verhältnis zu erzeugen.
  4. Unterteile die Ionenzahl für jeden Metaboliten in einer Probe durch das Proben- / Bezugsverhältnis eine chargen korrigierten Ionenzahl für jeden Metaboliten zu erhalten.

9. Peptid Normalisierungs

  1. Divide chargen korrigierte Ionen Zählwerte für jede in Schritt 8 durch die Peptidkonzentration mit dem BCA-Assay in Schritt 6 erhaltenen Probe bestimmt einen normalisierten Wert für jeden Metaboliten zu ergeben.
    HINWEIS: Die normalisiert, batch-batch korrigierten Ionenzählungen für jeden Metaboliten in Schritt 9.1 kann direkt zwischen Stämmen und einem statistischen Analyse (zB einem Mann-Whitney U - Test) verglichen werden. Alternativ bekannt, dass ein Metabolit unverändert entweder durch die Behandlung oder genetischen Hintergrund sein kann als Normalisierungseinrichtung verwendet werden, um Veränderungen zu erkennen, durch Zersetzung Metaboliten. Die Aufnahme einer bekannte Menge an L-Norvalin oder gluraric Säure in dem Extraktionspuffer kann verwendet werden für den Verlust während der Probenverarbeitung 34 zu korrigieren.

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Ergebnisse

Wir haben während der in - vitro - Wachstum in einem reichen komplexen Medium intrazellulären Stoffwechselprodukt- Pools in S. aureus analysiert. Als Beweis für das Prinzip, verglichen wir Metabolitprofilen zwischen dem Methicillin-empfindlicher S. aureus Osteomyelitis isoliert UAMS-1 (Wildtyp [WT]) und einen isogenen Stamm , der den global Transkriptionsregulator CodY (Δ codY) 26 fehlt. Steady-state, exponentielle Kult...

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Diskussion

Alle kleinen Molekül-Metaboliten werden in zentralen Stoffwechselwege miteinander über ihren gemeinsamen Ursprung verbunden. Während des exponentiellen Wachstums sind Bakterienzellen in biologischen und metabolischen eingeschwungenen Zustand eine Momentaufnahme des physiologischen Zustands unter spezifischen Bedingungen bereitzustellen. CodY überwacht Nährstoff Hinlänglichkeit durch zu ILV und GTP reagieren. Als ILV und GTP - Pools Tropfen, wahrscheinlich CodY Aktivität progressiv verringert, um die Expression von Zielg...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde teilweise durch einen NIH Pathway to Independence Award (gewähren GM 099.893) und Fakultät Startfonds SRB, sowie ein Forschungsprojekt Grant (gewähren GM 042219) gefördert. Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Interpretation, oder die Entscheidung, die Arbeit zur Publikation einzureichen.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Material/Ausrüstunga
DeLong Kulturkolben (250 mL)Belco2510-00250
Seitenarmkolben, 500 mLPyrex5340
3-Loch Gummistopfen, #7Fisher14-131E
Edelstahl Filterhalter/FritteVWR89428-936
Petrischale, 35 mmCorning430588Nicht mit Gewebekulturen behandelt
Membran aus gemischtem Celluloseester, 0,22 μ m PorengrößeMilliporeGSWP02500
Schlagfeste Röhrchen, 2 mLUSA Scientific1420-9600
Silica Beads, 0,1 mmBiospec Products Inc11079101Z
Precellys 24 HomogenisatorBertin InstrumentsEQ03119-200-RD000.0
Micro BCA Protein Assay KitPierce (Thermo Scientific)23235
Überzeugende Diamanthydrid-Säule Typ CAgilent70000-15P-2
Massengenaue Flugzeit (TOF) LC-MS, Serie 6200AgilentG6230B
Quat Pumpe, Serie 1290AgilentG4204A 
Behälterpumpe, Serie 1290AgilentG4220A 
Ventilantrieb, Serie 1290AgilentG1107A 
Isokratische Pumpe, Serie 1290AgilentG1310B 
TCC, Serie 1290AgilentG1316C 
Probenehmer, Serie 1290AgilentG4226A 
Thermostat, Serie 1290AgilentG1330B 
chemische
tryptische SojabrüheBecton Dickinson211825
Difco Agar, granuliertBecton Dickinson214530Feste Medien enthalten 1,5 % [w/v] Agar
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (pH 7,4) 10xAmbionAM9624Frisch auf 1x mit Reinstwasser verdünnen
AcetonitrilFisher ScientificA955-500Optima LC-MS
MethanolFisher ScientificA456-500Optima LC-MS; toxische
AmeisensäureSigma Aldrich94318Für die Massenspektrometrie, 98
%Software
MassHunterAgilentG3337AA
BakterienstammSpezies<strong>StammGenotyp
>SRB 337Staphylococcus aureusUSA200 MSSA UAMS-1Wildtyp
SRB 372Staphylococcus aureusUSA200 MSSA UAMS-1Δ codY::erm
aDie aufgeführten Chemikalien und Materialien sind spezifisch für die beschriebene Methode und umfassen keine Standard-Laborchemikalien oder -materialien.

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