Wir stellen ein Verfahren zur Quantifizierung der DNA-Methylierung auf der Basis des 5-Methylcytosin (5-mC) -Dot-Blots vor. Wir haben die 5-mC-Werte während der Chondrozyten-Dedifferenzierung bestimmt. Diese einfache Technik könnte verwendet werden, um schnell den Chondrozyten-Phänotyp in der ACI-Behandlung zu bestimmen.
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Methodenartikel
Ein 5-mC-Dot-Blot-Assay, der den DNA-Methylierungsgrad der Chondrozyten-Dedifferenzierung quantifiziert
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Dedifferenzierung von hyalinen Chondrozyten in fibroblastische Chondrozyten begleitet oft die Monolayer-Expansion von Chondrozyten in vitro . Der globale DNA-Methylierungsgrad von Chondrozyten gilt als geeigneter Biomarker für den Verlust des Chondrozyten-Phänotyps. Allerdings können die Ergebnisse auf der Grundlage verschiedener experimenteller Methoden inkonsistent sein. Daher ist es wichtig, eine präzise, einfache und schnelle Methode zu etablieren, um globale DNA-Methylierungswerte während der Chondrozyten-Dedifferenzierung zu quantifizieren.
Die derzeitigen genomweiten Methylierungsanalysetechniken beruhen weitgehend auf der genomischen Sequenzierung von Bisulfit. Aufgrund des DNA-Abbaus während der Bisulfit-Umwandlung erfordern diese Verfahren typischerweise ein großes Probenvolumen. Andere Methoden zur Quantifizierung der globalen DNA-Methylierungsstufen umfassen die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC). Allerdings erfordert HPLC eine vollständige Verdauung der genomischen DNA. Darüber hinaus sind die unerschwinglich hohen Kosten der HPLC inStruments begrenzt die erweiterte Anwendung von HPLC.
In dieser Studie wurde genomische DNA (gDNA) aus menschlichen Chondrozyten extrahiert, die mit variierender Anzahl von Passagen kultiviert wurden. Der gDNA-Methylierungsgrad wurde unter Verwendung eines methylierungsspezifischen Dot-Blot-Assays nachgewiesen. Bei diesem Dot-Blot-Ansatz wurde eine gDNA-Mischung, die die zu detektierende methylierte DNA enthielt, direkt auf eine N + -Membran als Punkt innerhalb eines zuvor gezeichneten kreisförmigen Templatmusters gesichtet. Im Vergleich zu anderen Gelelektrophorese-basierten Blotting-Ansätzen und anderen komplexen Blotting-Prozeduren spart die Dot-Blot-Methode erhebliche Zeit. Zusätzlich können Punktblots den Gesamt-DNA-Methylierungsgrad unter Verwendung eines im Handel erhältlichen 5-mC-Antikörpers nachweisen. Wir fanden, dass sich der DNA-Methylierungsgrad zwischen den Monolayer-Subkulturen unterscheidet und daher eine Schlüsselrolle bei der Chondrozyten-Dedifferenzierung spielen könnte. Der 5-mC-Dot-Blot ist eine zuverlässige, einfache und schnelle Methode, um die allgemeine DNA-Methylierungsstufe zu ermittelnE-Chondrozyten-Phänotyp
Einleitung
Die autologe Chondrozytenimplantation (ACI) ist ein relativ neues, hochmodernes Verfahren zur Behandlung von Gelenkknorpeldefekten 1 , 2 . Einer der entscheidenden Schritte in ACI ist die Verstärkung von Chondrozyten über die Monolayerkultur in vitro . Während der Amplifikation verlieren die hyalinen Chondrozyten leicht ihren Phänotyp und werden dedifferenziert, was für die ACI-Behandlung 3 , 4 unerwünscht ist . Um das Ergebnis der ACI-Behandlung zu optimieren, sollte das Ausmaß der Chondrozyten-Dedifferenzierung vor der Wiederbepf....
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Protokoll
Diese Studie wurde von der Human Ethics Committee der Shenzhen Second People's Hospital genehmigt.
1. Menschliche Gelenkknorpel-Gewebe-Sammlung und Chondrozyten-Kultur
- Vorbereitung von Materialien
- Bereiten Sie Dulbecco's modifiziertes Adlermedium (DMEM) Medium, ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum und 1% Penicillin-Streptomycin, vor. 1 mg / ml Kollagenase II, 0,25% Trypsin-EDTA, phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) und ein Zellfilter (40 μm Nylon) zubereiten.
- Menschliche Knorpelgewebesammlung
- Isolieren Sie Knorpelknorpel aus den Kniegelenken von S....
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Ergebnisse
Chondrozyten wurden in einer Monoschicht bis zur Passage 6 (P6) kultiviert. Chondrozyten zeigten progressive phänotypische Veränderungen mit aufeinanderfolgenden Passagen der Monolayer-Kultur. Die P0-Chondrozyten-Morphologie war rund, während die Zellen stark eingeklemmt und mit aufeinanderfolgenden Passagen bis zu P6 abgeflacht wurden (Abbildung 1 ). Dieser Morphologie-Wandel ist typisch für den Chondrozyten-Dedifferenzierungsprozess. Mittlerweile zeigten die Ergebnisse.......
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Diskussion
Chondrozyten-Dedifferenzierung in vitro beeinträchtigt das Ergebnis von ACI bei der Behandlung der Knorpeldefektreparatur 11 , 12 . Um das ACI-Ergebnis zu optimieren, ist es entscheidend, die Verwendung von dedifferenzierten Chondrozyten zu vermeiden 13 . Studien haben vorgeschlagen, dass das allgemeine DNA-Methylierungsniveau mit dem Ausmaß der Chondrozyten-Dedifferenzierung 4 ,
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde durch folgende Stipendien unterstützt: Naturwissenschaftliche Stiftung von China (Nr. 81572198, Nr. 81260161, Nr. 81000460); Naturwissenschaftliche Stiftung der Provinz Guangdong, China (Nr. 2015A030313772); China Postdoktoranden-Stiftung gefördertes Projekt (Nr. 2013M530385); Die medizinische Forschungsstiftung der Provinz Guangdong, China (Nr. A2016314); Shenzhen-Wissenschafts- und Technologieprojekte (Nr. JCYJ20160301111338144, Nr. JSGG20151030140325149, Nr. JSGG20140519105550503; Nr. GJHZ20130412153906739; Nr. JCYJ20140414170821160; No.JCYJ20140414170821200).
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Reagenzien | |||
| DMEM | Gibco Inc. | 11965– 092 | Warm bei 37 Grad; C Wasserbad vor dem Gebrauch |
| : Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) | HyClone Inc. | SH30256.01B | D-PBS, frei von Ca2+/Mg2+ |
| FBS | Gibco Inc. | 10099-141 | |
| 0,25 % Trypsin/EDTA | Gibco Inc. | 25200-056 | |
| 1% Penicillin-Streptomycin | Gibco Inc. | 15140-122 | |
| Chloroform | Mallinckrodt | 4440 | |
| Isoamylalkohol | Sigma | I-3643 | |
| Phenol | Gibco BRL | 15513-039 | |
| Proteinase K | Gibco BRL | 24568-2 | |
| TAE Puffer | Bio Whittaker | 16-011V | |
| Destilliertes Wasser | Gibco BRL | 15230-170 | |
| 1 M Tris-HCl | Biosharp Inc. | BL514A | |
| Tween20 | Biotopped Inc. | ||
| BSA | Proliant Inc. | 68700 | |
| Kollagenase, Typ II | Sigma-Aldrich | C6885< | |
| Equipment | |||
| Hämozytometer | ISOLAB Inc. | 075.03.001 | |
| Falcon 100 mm Schüssel | Corning | 353003 | |
| Zentrifugenröhrchen | TPP AG | 91050 | Gamma-sterilisierte |
| Hochgeschwindigkeitszentrifuge | Eppendorf | 5804R | |
| ThermoMixer | MIULAB | MTH-100 | |
| Kohlendioxid-Zellen-Inkubator | Thermo scientific | 3111 | |
| Chemi-Imaging Analysesystem | UVITEC Cambridge | ALLIANCE |
Referenzen
- Brittberg, M., et al. Treatment of deep cartilage defects in the knee with autologous chondrocyte transplantation. N Engl J Med. 331, 889-895 (1994).
- Pareek, A., et al. Long-Term Outcomes After Au....
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Nachdrucke und Genehmigungen
