Ein 5-mC-Dot-Blot-Assay, der den DNA-Methylierungsgrad der Chondrozyten-Dedifferenzierung quantifiziert In vitro

Zusammenfassung

Wir stellen ein Verfahren zur Quantifizierung der DNA-Methylierung auf der Basis des 5-Methylcytosin (5-mC) -Dot-Blots vor. Wir haben die 5-mC-Werte während der Chondrozyten-Dedifferenzierung bestimmt. Diese einfache Technik könnte verwendet werden, um schnell den Chondrozyten-Phänotyp in der ACI-Behandlung zu bestimmen.

Zusammenfassung

Die Dedifferenzierung von hyalinen Chondrozyten in fibroblastische Chondrozyten begleitet oft die Monolayer-Expansion von Chondrozyten in vitro . Der globale DNA-Methylierungsgrad von Chondrozyten gilt als geeigneter Biomarker für den Verlust des Chondrozyten-Phänotyps. Allerdings können die Ergebnisse auf der Grundlage verschiedener experimenteller Methoden inkonsistent sein. Daher ist es wichtig, eine präzise, ​​einfache und schnelle Methode zu etablieren, um globale DNA-Methylierungswerte während der Chondrozyten-Dedifferenzierung zu quantifizieren.

Die derzeitigen genomweiten Methylierungsanalysetechniken beruhen weitgehend auf der genomischen Sequenzierung von Bisulfit. Aufgrund des DNA-Abbaus während der Bisulfit-Umwandlung erfordern diese Verfahren typischerweise ein großes Probenvolumen. Andere Methoden zur Quantifizierung der globalen DNA-Methylierungsstufen umfassen die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC). Allerdings erfordert HPLC eine vollständige Verdauung der genomischen DNA. Darüber hinaus sind die unerschwinglich hohen Kosten der HPLC inStruments begrenzt die erweiterte Anwendung von HPLC.

In dieser Studie wurde genomische DNA (gDNA) aus menschlichen Chondrozyten extrahiert, die mit variierender Anzahl von Passagen kultiviert wurden. Der gDNA-Methylierungsgrad wurde unter Verwendung eines methylierungsspezifischen Dot-Blot-Assays nachgewiesen. Bei diesem Dot-Blot-Ansatz wurde eine gDNA-Mischung, die die zu detektierende methylierte DNA enthielt, direkt auf eine N ⁺ -Membran als Punkt innerhalb eines zuvor gezeichneten kreisförmigen Templatmusters gesichtet. Im Vergleich zu anderen Gelelektrophorese-basierten Blotting-Ansätzen und anderen komplexen Blotting-Prozeduren spart die Dot-Blot-Methode erhebliche Zeit. Zusätzlich können Punktblots den Gesamt-DNA-Methylierungsgrad unter Verwendung eines im Handel erhältlichen 5-mC-Antikörpers nachweisen. Wir fanden, dass sich der DNA-Methylierungsgrad zwischen den Monolayer-Subkulturen unterscheidet und daher eine Schlüsselrolle bei der Chondrozyten-Dedifferenzierung spielen könnte. Der 5-mC-Dot-Blot ist eine zuverlässige, einfache und schnelle Methode, um die allgemeine DNA-Methylierungsstufe zu ermittelnE-Chondrozyten-Phänotyp

Einleitung

Die autologe Chondrozytenimplantation (ACI) ist ein relativ neues, hochmodernes Verfahren zur Behandlung von Gelenkknorpeldefekten ^{1 , 2} . Einer der entscheidenden Schritte in ACI ist die Verstärkung von Chondrozyten über die Monolayerkultur in vitro . Während der Amplifikation verlieren die hyalinen Chondrozyten leicht ihren Phänotyp und werden dedifferenziert, was für die ACI-Behandlung ^{3 , 4} unerwünscht ^ist . Um das Ergebnis der ACI-Behandlung zu optimieren, sollte das Ausmaß der Chondrozyten-Dedifferenzierung vor der Wiederbepflanzung bestimmt werden. Es ist zwingend notwendig, einen wirtschaftlichen und schnellen Weg zu finden, um den Status der Chondrozyten zu bestimmen. In jüngster Zeit hat die Assoziation zwischen DNA-Methylierung und Chondrozyten-Dedifferenzierung viel Aufmerksamkeit erregt ^{4 , 5 , 6} . DNA-Methylierung ist ein Prozess von whIch werden der DNA zugesetzt, was zur Umwandlung von Cytosinresten zu 5-Methylcytosin (5-mC) führt.

Zur Aufklärung der Biologie der DNA-Methylierung bei der Chondrozyten-Dedifferenzierung ist der erste Schritt die Auswertung der DNA-Methylierungsstufe von Chondrozyten, die sich bislang als herausfordernd erwiesen hat. Bisulfit-Genomsequenzierung ist die am weitesten verbreitete Technik zur Analyse der DNA-Methylierung ^{7 , 8} . In diesem Assay verursacht die Bisulfitumwandlung einen DNA-Abbau, und daher muß eine beträchtliche Menge an Probe für den Assay bereitgestellt werden. Außerdem wurde eine Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) verwendet, um die globalen DNA-Methylierungsstufen ^{9 , 10 zu} quantifizieren. Allerdings erfordert die HPLC-Analyse eine genomische DNA-Verdauung. Darüber hinaus sind fortgeschrittene und teure experimentelle Instrumente erforderlich. Daher sind neben den hohen Kosten diese experimentellen Verfahren zeitgenauUming Anti-5-mC-Antikörper sind mittlerweile kommerziell verfügbar, was die Möglichkeit zur Immun-Blotting von 5-mC-haltiger genomischer DNA aus komplexen Genomen geschaffen hat.

In diesem Bericht haben wir genomische DNA aus Chondrozyten extrahiert, die in einer Reihe von Monolayer-Kulturen angebaut wurden. Wir verwendeten einen Dot-Blot-Assay, um den 5-mC-Gehalt in menschlichen Chondrozyten mit einer unterschiedlichen Anzahl von Passagen zu bewerten. Wir fanden, dass der 5-mC-Gehalt in hochdifferenzierten Chondrozyten im Vergleich zu Chondrozyten mit geringer Diffifferenzierung erhöht wurde. Darüber hinaus haben wir eine Beziehung zwischen Dedifferenzierungsstatus und 5-mC-Pegeln identifiziert. Schließlich berichteten wir, dass die Veränderungen im 5-mC-Gehalt mit dem Chondrozyten-Phänotyp assoziiert waren. Daher ist der 5-mC-Punkt-Blot-Assay ein zuverlässiges, einfaches und schnelles Verfahren, um das DNA-Methylierungsniveau in Chondrozyten zu detektieren.

Protokoll

Diese Studie wurde von der Human Ethics Committee der Shenzhen Second People's Hospital genehmigt.

1. Menschliche Gelenkknorpel-Gewebe-Sammlung und Chondrozyten-Kultur

1. Vorbereitung von Materialien
   1. Bereiten Sie Dulbecco's modifiziertes Adlermedium (DMEM) Medium, ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum und 1% Penicillin-Streptomycin, vor. 1 mg / ml Kollagenase II, 0,25% Trypsin-EDTA, phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) und ein Zellfilter (40 μm Nylon) zubereiten.
2. Menschliche Knorpelgewebesammlung
   1. Isolieren Sie Knorpelknorpel aus den Kniegelenken von Spenderpatienten nach Trauma. Erhalten Sie eine informierte Zustimmung von allen Teilnehmern.
   2. Den Knorpel in 1-2 mm ³ Stücke unter Verwendung eines sterilen Skalpells würfeln und Chondrozyten aus dem gehackten Knorpel mit 1 mg / ml Kollagenase II in DMEM bei 37 ° C für 12-16 h verdauen.
   3. Filtern Sie die resultierende celL Suspension durch einen Zellfilter (40 μm) und zweimal mit PBS waschen.
   4. Zählzellen mit einem Hämocytometer und Samen mit einer Dichte von 20.000-30.000 Zellen / cm ² in DMEM, ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin-Streptomycin.
   5. Kultur in einem Inkubator bei 37 ° C.
3. Monolayer Chondrozyten Expansion
   1. Ernte unterkonfluierende Zellen unter Verwendung von 0,25% Trypsin-EDTA und Re-Platte mit einer Dichte von 6.600 Zellen / cm ² . Ändern Sie das Medium zweimal pro Woche.
   2. Kultur-Chondrozyten in Monoschichten für bis zu sechs Passagen und beurteilen an den Passagen 1, 2, 3, 4 und 5.

2. Genomische DNA (gDNA) Extraktion

1. Sammeln Sie die Zellen und resuspendieren Sie in 500 & mgr; l Lysepuffer (15 mM Tris pH 8,0, 10 mM EDTA pH 8,0, 0,5% SDS, 200 & mgr; g / ml RNase A) pro 10 Million Zellen. Zellen durch Pipettieren und schnelle Umkehrung resuspendieren und dann 1 h bei 37 ° C inkubieren.
2. EINDd-Proteinase K bei einer Konzentration von 160 μg / ml Zelllysat und invertieren die Mischung kräftig. 6 h bei 55 ° C inkubieren.
3. Füge ein Volumen Tris pH 7,9 gesättigtes Phenol hinzu: Chloroform: Isoamylalkohol (25: 24: 1) zur Probe. Vortex oder schütteln Sie die Probe von Hand gründlich für ca. 20 s.
4. Zentrifugieren der Probe bei Raumtemperatur für 5 min bei 13.000 × g. Die obere wässrige Phase entfernen und die Schicht auf ein frisches Röhrchen übertragen.
5. Mit einem gleichen Volumen Chloroform extrahieren, um Phenol zu entfernen und die obere wässrige Phase in ein frisches Röhrchen zu überführen.
6. Filtriere DNA durch Zugabe von 0,1 Probenvolumen von 3 M Natriumacetat pH 8,0 und 2 Volumina von 100% Ethanol.
7. Das Röhrchen bei -20 ° C über Nacht aufbewahren, um die gDNA auszufällen.
8. Zentrifugieren der Probe bei 4 ° C für 10 min bei 16.000 xg zur Pellet-gDNA.
9. Die Probe dreimal mit 70% igem Ethanol waschen und bei 4 ° C für 2 min bei 13 000 x g zentrifugieren.
10. Den Überstand entfernenT sorgfältig und dann lufttrocknen Resuspendieren der DNA in 10 mM Tris pH 8,0, 0,1 mM EDTA.

3. DNA-Methylierungs-Profilierung

1. Verwenden Sie ein DNA-Methylierungskit, um die Bisulfit-Umwandlungsreaktion unter Verwendung von insgesamt 500 ng der genomischen DNA nach dem Protokoll des Herstellers durchzuführen. Eluieren in 10 & mgr; l Elutionspuffer (50 ng / & mgr; l).
2. Führen Sie die DNA-Methylierungsprofile mit einem kommerziellen Kit nach dem Protokoll des Herstellers durch.

4. Dot-Blot-Analyse

1. Den isolierten DNA (1 mg pro Probe) in 0,1 M NaOH für 10 min bei 95 ° C denaturieren. Neutralisieren Sie die DNA mit 1 M NH ₄ OAc auf Eis und verdünnen Sie dann zweimal. Spot 2 μl der seriell verdünnten genomischen DNA auf einer N ⁺ Membran.
2. Die Membran bei 80 ° C für 30 min auftragen.
3. Blockieren von unspezifischen Antikörperbindungsstellen durch Einweichen der N ⁺ -Membran in 5% BSA in TBS-T für 1 h. Verwenden Sie eine 10 cm Petrischale als ReaktionIonenkammer bei Raumtemperatur.
4. Nach dem Waschen 5 min dreimal in TBST inkubieren die Membran mit einem Maus-anti-5-Methylcytosin (5-mC) monoklonalen Antikörper (1: 1000) in TBS-T bei 4 ° C über Nacht.
5. Die Membran für 5 min dreimal in TBS-T waschen und dann mit einem sekundären Antikörper, HRP-konjugiertes Schaf-anti-Maus-Immunglobulin-G (IgG) (1: 5000) in TBS-T für 1 h bei Raumtemperatur inkubieren.
6. Die Membran für 5 min dreimal in TBS-T waschen.
7. Füge das Enzymsubstrat der Membran hinzu und inkubiere für 5-10 min. Visualisieren Sie das sekundäre Antikörpersignal mit einem Chemilumineszenz-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers.

Ergebnisse

Chondrozyten wurden in einer Monoschicht bis zur Passage 6 (P6) kultiviert. Chondrozyten zeigten progressive phänotypische Veränderungen mit aufeinanderfolgenden Passagen der Monolayer-Kultur. Die P0-Chondrozyten-Morphologie war rund, während die Zellen stark eingeklemmt und mit aufeinanderfolgenden Passagen bis zu P6 abgeflacht wurden (Abbildung 1 ). Dieser Morphologie-Wandel ist typisch für den Chondrozyten-Dedifferenzierungsprozess. Mittlerweile zeigten die Ergebnisse...

Diskussion

Chondrozyten-Dedifferenzierung in vitro beeinträchtigt das Ergebnis von ACI bei der Behandlung der Knorpeldefektreparatur ^{11 , 12} . Um das ACI-Ergebnis zu optimieren, ist es entscheidend, die Verwendung von dedifferenzierten Chondrozyten zu vermeiden ¹³ . Studien haben vorgeschlagen, dass das allgemeine DNA-Methylierungsniveau mit dem Ausmaß der Chondrozyten-Dedifferenzierung ^{4 ,}

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Reagenzien
DMEM	Gibco Inc.	11965– 092	Warm bei 37 Grad; C Wasserbad vor dem Gebrauch
: Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)	HyClone Inc.	SH30256.01B	D-PBS, frei von Ca2+/Mg2+
FBS	Gibco Inc.	10099-141
0,25 % Trypsin/EDTA	Gibco Inc.	25200-056
1% Penicillin-Streptomycin	Gibco Inc.	15140-122
Chloroform	Mallinckrodt	4440
Isoamylalkohol	Sigma	I-3643
Phenol	Gibco BRL	15513-039
Proteinase K	Gibco BRL	24568-2
TAE Puffer	Bio Whittaker	16-011V
Destilliertes Wasser	Gibco BRL	15230-170
1 M Tris-HCl	Biosharp Inc.	BL514A
Tween20	Biotopped Inc.
BSA	Proliant Inc.	68700
Kollagenase, Typ II	Sigma-Aldrich	C6885<
Equipment
Hämozytometer	ISOLAB Inc.	075.03.001
Falcon 100 mm Schüssel	Corning	353003
Zentrifugenröhrchen	TPP AG	91050	Gamma-sterilisierte
Hochgeschwindigkeitszentrifuge	Eppendorf	5804R
ThermoMixer	MIULAB	MTH-100
Kohlendioxid-Zellen-Inkubator	Thermo scientific	3111
Chemi-Imaging Analysesystem	UVITEC Cambridge	ALLIANCE