Zusammenbau und Verfolgung der mikrobiellen Gemeinschaftsentwicklung innerhalb einer Microwell Array Plattform

Summary

Die Entwicklung der mikrobiellen Gemeinschaften hängt von einer Kombination von Faktoren ab, einschließlich Umweltarchitektur, Mitgliedshäufigkeit, Züge und Wechselwirkungen. Dieses Protokoll beschreibt eine synthetische, mikrogefertigte Umgebung für die gleichzeitige Verfolgung von Tausenden von Gemeinschaften, die in Femtoliter-Vertiefungen enthalten sind, wo Schlüsselfaktoren wie Nischengröße und Einschluss angenähert werden können.

Abstract

Die Entwicklung der mikrobiellen Gemeinschaften hängt von einer Kombination von komplexen deterministischen und stochastischen Faktoren ab, die die räumliche Verteilung und die Aktivitäten der Gemeinschaftsmitglieder drastisch verändern können. Wir haben eine microwell-Array-Plattform entwickelt, mit der Tausende von Bakteriengemeinschaften parallel versammelt und verfolgt werden können. Dieses Protokoll unterstreicht den Nutzen der Plattform und beschreibt seine Verwendung zur optischen Überwachung der Entwicklung einfacher, zweiköpfiger Gemeinschaften innerhalb eines Ensembles von Arrays innerhalb der Plattform. Diese Demonstration verwendet zwei Mutanten von Pseudomonas aeruginosa , Teil einer Reihe von Mutanten entwickelt, um Typ VI Sekretion Pathogenität zu studieren. Chromosomale Insertionen von entweder mCherry- oder GFP-Genen erleichtern die konstitutive Expression von fluoreszierenden Proteinen mit unterschiedlichen Emissionswellenlängen, die verwendet werden können, um die Häufigkeit und die Lage des Gemeinschaftsmitglieds innerhalb jeder Mikrovertiefung zu überwachen. Dieses Protokoll beschreibt ein detailliertes methoD zum Zusammenbau von Bakteriengemischen in die Vertiefungen des Arrays und unter Verwendung von zeitraffer Fluoreszenzbildgebung und quantitativer Bildanalyse, um das relative Wachstum jeder Mitgliedspopulation über die Zeit zu messen. Die Aussaat und Montage der Mikrotiterplattform, die bildgebenden Verfahren, die für die quantitative Analyse von mikrobiellen Gemeinschaften innerhalb des Arrays notwendig sind, und die Methoden, die verwendet werden können, um Wechselwirkungen zwischen mikrobiellen Speziesbereichen zu diskutieren, die alle diskutiert werden.

Introduction

Die mikrobiellen Gemeinschaften sind sowohl durch deterministische Faktoren wie die Struktur der Umwelt und stochastische Prozesse geprägt, die mit dem Zelltod, der Teilung, der Proteinkonzentration, der Anzahl der Organellen und der Mutation verbunden sind. Innerhalb der natürlichen Umgebung kann es fast unmöglich sein, die individuellen Auswirkungen dieser Einflüsse auf die Zusammensetzung und die Aktivität der Gemeinschaft zu analysieren. Von natürlichen Strukturen verdeckt und in einem chemischen und biologischen Milieu begraben, die Mitglieder der Gemeinschaft zu identifizieren und ihre räumlich-zeitliche Verteilung in der natürlichen Umgebung zu lösen, ist äuße....

Protocol

1. Silizium-Microwell-Array-Fertigung

1. Parylenbeschichtung
   1. Ablagerung zwischen 1-1,5 μm Parylen N auf Silicium-Wafern unter Verwendung eines handelsüblichen Parylenbeschichtungssystems nach den Spezifikationen und Anweisungen des Herstellers (Einstellungen: Verdampfer-Sollwert = 160 ° C, Ofen-Sollwert = 650 ° C).
      HINWEIS: Ungefähr 6 g Parylen N, das in eine Kammer geladen wird, ergeben Beschichtungen von 1-1,5 μm Dicke.
2. Photolithographie
   1. Die Parylen-N-beschichteten Wafer mit Haftvermittler, 20% Hexamethyldisilazan (HMDS) und 80% Propylenglykolmonomethyletheracetat (PGMEA) (siehe

Results

Die hier vorgestellte experimentelle Plattform ist für Hochdurchsatz- und Hochinhaltensstudien von Bakteriengemeinschaften ausgelegt. Das Design ermöglicht es Tausende von Gemeinden, die in Brunnen verschiedener Größen wachsen, gleichzeitig analysiert werden. Mit diesem Microwell-Array-Design kann die Abhängigkeit der endgültigen Gemeinschaftszusammensetzung auf den anfänglichen Seeding-Dichten, der Well-Größe und der chemischen Umgebung bestimmt werden. Diese Arbeit zeigt das Wachstum e.......

Discussion

Dieser Artikel präsentierte ein microwell-Array-Gerät und experimentelle Protokolle entwickelt, um High-Throughput-und High-Content-Live-Zelle Imaging-basierte Analyse der bakteriellen Community-Entwicklung zu ermöglichen. Während der Schwerpunkt der Demonstration hier war, um die Effekte der kontaktvermittelten Typ-VI-Sekretion auf die Entwicklung der Gemeinschaft zu untersuchen, wurden die Arrays so konzipiert, dass sie flexibel sind und die Untersuchung einer breiten Palette von mikrobiellen Gemeinschaften und Mikrob.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Parylene N	Spezialbeschichtungssysteme	CAS-Nr.: 1633-22-3
Parylene-Beschichter	Spezialbeschichtungssysteme	Labcoter 2 Parylene-Abscheidungseinheit PDS2010
Siliziumwafer	WRS-Materialien	100 mm Durchmesser, 500-550 μm; m Dicke, Prime, 10-20 spezifischer Widerstand, N/Phos< 100>,
Adhäsionsvermittler	Shin-Etsu Microsci	MicroPrime P20 Adhäsionsvermittler
positiver Ton Fotolack	Rohm and Haas Electronics Materials LLC (im Besitz von Dow)	Microposit S1818 Positiver Fotolack (Code 10018357)
Quintel Contact Aligner	Neutronix Quintel Corp	NXQ 7500 Mask Aligner
Reaktives Ionenätzwerkzeug	Oxford Instrumente	Plasmalab System 100 Reaktiver Ionenätzer
R2A Bouillon	TEKnova	R0005
Rinderserum Albumin	Sigma	A9647
Multimode Plate Reader	Perkin Elmer	Enspire, 2300-0000
Fluoreszenzmikroskop	Nikon	Eclipse Ti-U
Automatisierter Tisch	Prior	ProScan III
CCD-Kamera	Nikon	DS-QiMc
Tisch-Klimakontrollkammer	In Vivo Scientific	STEV ECU-HOC
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung	ThermoFisher Scientific	14190144
UltraPure Agarose	ThermoFisher Scientific	16500500
25 x 75 mm No. 1.5 Deckglas	Nexterion	Hohe Leistung #1.5H Deckgläser
Fluoreszenz-Referenzfolien	Ted Pella	2273
Physical Stylus Profilometer	KLA Tencor	P-6
Labortücher	Kimberly Clark	Kimipe KIMTECH SCIENCE Marke, 34155
kommerzielle Software	Nikon	NIS Elements
Zeiss 710 Konfokalmikroskop	Zeiss
Filterwürfel	Nikon	Nikon FITC (96311), Nikon Texas Red (96313)