Oligopeptid-Konkurrenz-Assay zur Phosphorylierungsbestimmung

Min Sung Joo; Ja Hyun Koo; Sol-Bi Shin; Hyungshin Yim; Sang Geon Kim

doi:10.3791/55708

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Methodenartikel

Oligopeptid-Konkurrenz-Assay zur Phosphorylierungsbestimmung

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DOI:

10.3791/55708

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18. Mai 2017

Min Sung Joo¹ , Ja Hyun Koo¹ , Sol-Bi Shin² , Hyungshin Yim² , Sang Geon Kim¹

¹College of Pharmacy and Research Institute of Pharmaceutical Sciences, Seoul National University, ²College of Pharmacy and Institute of Pharmaceutical Science and Technology, Hanyang University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Peptid-Konkurrenz-Assays sind weit verbreitet in einer Vielzahl von molekularen und immunologischen Experimenten verwendet. Dieses Papier beschreibt eine detaillierte Methode für einen in vitro- Oligopeptid-konkurrierenden Kinase-Assay und die damit verbundenen Validierungsverfahren, die nützlich sein können, um spezifische Phosphorylierungsstellen zu finden.

Zusammenfassung

Die Proteinphosphorylierung an bestimmten Stellen bestimmt ihre Konformation und Interaktion mit anderen Molekülen. So beeinflusst die Proteinphosphorylierung biologische Funktionen und Eigenschaften der Zelle. Derzeit ist die häufigste Methode zur Entdeckung von Phosphorylierungsstellen durch Flüssigchromatographie / Massenspektrometrie (LC / MS) -Analyse, ein schnelles und empfindliches Verfahren. Allerdings werden relativ labilile Phosphatreste oft aus Phosphopeptiden während des Fragmentierungsschrittes freigesetzt, was oft falsch-negative Signale ergibt. In solchen Fällen wäre ein herkömmlicher in vitro -Kinase-Assay unter Verwendung von ortsgerichteten Mutanten genauer, aber diese Methode ist mühsam und zeitaufwändig. Daher kann ein alternatives Verfahren unter Verwendung von Peptidwettbewerb vorteilhaft sein. Das Konsensuserkennungsmotiv der 5'-Adenosinmonophosphat-aktivierten Proteinkinase (AMPK) wurde ¹ etabliert und wurde unter Verwendung eines Positions-Scanning-Peptid-Bibliotheks-Asss validiertAy ² Somit könnten AMPK-Phosphorylierungsstellen für ein neuartiges Substrat vorhergesagt und durch die Peptidwettbewerbsassays bestätigt werden. In diesem Bericht beschreiben wir die detaillierten Schritte und Verfahren für den in vitro- Oligopeptid-konkurrierenden Kinase-Assay durch die Veranschaulichung der AMPK-vermittelten Kernfaktor-Erythroid-2-verwandten Faktor 2 (Nrf2) -Phosphorylierung. Um die Phosphorylierungsstelle zu authentifizieren, führten wir einen sequentiellen In-vitro -Kinase-Assay unter Verwendung einer ortsspezifischen Mutante durch. Insgesamt liefert der Peptid-Konkurrenz-Assay ein Verfahren zum Screening mehrerer potentieller Phosphorylierungsstellen und zur Identifizierung von Stellen für die Validierung durch die Phosphorylierungsstellen-Mutanten.

Einleitung

Die Proteinphosphorylierung an einem spezifischen Rückstand spielt eine wichtige Rolle in einem breiten Spektrum zellulärer Prozesse. Somit erfordert ein Verständnis von Signalisierungsnetzwerken die Identifizierung spezifischer Phosphorylierungsstellen. Darüber hinaus bestimmt die Phosphorylierungsstelle die Wirkung auf die Proteinfunktion, da einzelne Domänen innerhalb eines Proteins unterschiedliche Strukturen und Funktionen besitzen. Die Aktivität des Kernfaktor-Erythroid-2-Faktors 2 (Nrf2), ein wichtiger Antioxidans-Transkriptionsfaktor, wird durch Phosphorylierung an verschiedenen Stellen bidirektional reguliert. Unsere Studien konzentrierten sich auf die Kinas....