Wir stellen ein Protokoll Fettgewebe stamm mikrovaskulärer Fragmente zu isolieren, die viel versprechende Vaskularisierung Einheiten darstellen. Sie können schnell isoliert werden, erfordern nicht in vitro - Prozessierung und somit für Prävaskularisation Ein-Schritt verwendet werden kann , in verschiedenen Bereichen des Tissue Engineering.
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Methodenartikel
Die Isolierung von murinen Fettgewebe stammenden mikrovaskuläre Fragmente als Vaskularisation Einheiten für Tissue Engineering
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Ein funktionelles mikrovaskulären Netzwerk ist von entscheidenden Bedeutung für das Überleben und die Integration von Engineered Gewebekonstrukten. Zu diesem Zweck wurden mehrere angiogene und Prävaskularisation Strategien etabliert. Allerdings sind die meisten zellbasierte Ansätze sind zeitraubend in vitro Schritte zur Bildung eines mikrovaskulären Netzwerk. Daher sind sie für die intraoperative Ein-Schritt-Verfahren nicht geeignet. Fettgewebe abgeleiteten mikrovaskulärer Fragmente (ad-MVF) stellen vielversprechende Vaskularisierung Einheiten. Sie lassen sich leicht aus Fettgewebe und weisen eine funktionelle microvessel Morphologie isoliert werden. Darüber hinaus wieder zusammenbauen sie schnell in neue mikrovaskuläre Netzwerke nach Implantation in vivo. Darüber hinaus Ad-MVF wurde Lymphangiogenese induziert. Schließlich sind sie eine reiche Quelle von mesenchymalen Stammzellen, die weiterhin ihre hohen Potential Vaskularisierung beitragen können. In früheren Studien haben wir die bemerkenswerte vascularizati demonstriertauf der Kapazität des Ad-MVF in engineered Knochen und Hautersatz. In der vorliegenden Studie berichten wir über ein standardisiertes Protokoll für die enzymatische Trennung von Ad-MVF aus murinen Fettgewebe.
Einleitung
Tissue Engineering konzentriert sich auf der Herstellung von Gewebe- und Organersatz , die erhalten, wiederzuherzustellen oder die Funktion des inoperablen in vivo Pendants 1, 2 zu erhöhen. Das Schicksal von Engineered Gewebekonstrukten hängt entscheidend von einer adäquaten Vaskularisation 3. Die mikrovaskuläre Netzwerke innerhalb dieser Konstrukte hierarchisch mit Arteriolen, Kapillaren organisiert werden sollte, und Venolen nach inosculation der dem Empfänger Gefäß 4 effiziente Durchblutung zu ermöglichen. Die Erzeugung solcher Netzwerke gehört zu de....
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Protokoll
Alle Verfahren wurden für die Verwendung von Versuchstieren nach dem National Institute of Health Richtlinien durchgeführt und anschließend institutionelle Richtlinien (Landesamt für Soziales, Gesundheit und Verbraucherschutz, Abt. Lebensmittel- und Veterinärwesen, Zentralstelle, Saarbrücken, Deutschland).
1. Herstellung von chirurgischen Instrumenten
- Halte bereit, die Dissektion Schere, chirurgische Pinzette, kleine Vorbereitung Schere, feine Pinzette und eine sterile Petrischale mit 15 ml Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM, 10% fötalen Kälberserum (FCS), 100 U / ml Penicillin, 0,1 mg / ml Streptomycin ) epididymal Fet....
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Ergebnisse
In der vorliegenden Studie führten wir sechs Ad-MVF Isolierungsverfahren mit Fettgewebe von 7- bis 12-Monate alten männlichen Wildtyp-C57BL / 6-Mäuse (mittleres Körpergewicht: 35 ± 1 g). Abbildung 1 zeigt die Ernte von murinen epididymal Fettpolstern mit anschließender mechanischer und enzymatischen Ad-MVF Isolation. Die Zeit für die Ernte von Fett erforderlich war 30 Minuten und für die Isolierung von Ad-MVF betrug 120 min. Insgesamt dauerte die Prozedur 150 min.
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Diskussion
In dieser Studie stellen wir ein etabliertes Protokoll für die Isolierung von Ad-MVF. Ad-MVF Gewinnung von Maus-Fettgewebe ist ein einfaches Verfahren mit einigen kritischen Schritten. Mäuse zeigen verschiedene subkutane und intraabdominalem Fettdepots. Wie zuvor für Ratten beschrieben, 11 die am besten geeignete Fettquelle für die Isolierung von Ad-MVF sind die epididymal Fettpolster aufgrund ihrer Größe, homogener Struktur und minimaler Kontamination mit größeren Blutgefäßen,
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.
Danksagungen
Wir sind dankbar für die hervorragende technische Unterstützung von Janine Becker, Caroline Bickelmann und Ruth Nickels. (- Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG) - LA 2682 / 7-1 Diese Studie wurde unterstützt durch einen Zuschuss von der Deutschen Forschungsgemeinschaft gefördert.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Konisches Mikrozentrifugenröhrchen / 1,5 mL | VWR, Kelsterbach, Deutschland | 700-5239 | |
| 100-& micro; L Präzisionspipette | Eppendorf, Hamburg, Deutschland | 4920000059 | |
| 10-mL Messpipette | Costar, Corning Inc., New York, USA | 4488 | |
| 14 mL PP Röhrchen | Greiner bio-one, Frickenhausen, Deutschland | 187261 | |
| 1 mL Präzisionspipette | Eppendorf, Hamburg, Deutschland | 4920000083 | |
| 500-µ m Filter (pluriStrainer 500 µ m) | HISS Diagnostics, Freiburg, Deutschland | 43-50500-03 | |
| 50-ml-Zentrifugenröhrchen | Greiner bio-one, Frickenhausen, Deutschland | 227261 | |
| 50-ml-Erlenmeyerkolben | VWR, Kelsterbach, Deutschland | 214-0211 | |
| 96-Well-Platte | Greiner bio-one, Frickenhausen, Deutschland | 65518 | |
| Zellablösungslösung (Accutase) | eBioscience, San Diego, CA USA | 00-4555-56 | |
| C57BL/6 Mäuse | Charles River, Köln, Deutschland | 027 | |
| C57BL/6-TG(CAG-EGFP)1Osb/J Mäuse | The Jackson Laboratory, Bar Harbor, USA | 003291 | |
| CD117-FITC | BD Biosciences, Heidelberg, Deutschland | 553373 | |
| CD31-PE | BD Biosciences, Heidelberg, Deutschland | 553354 | |
| Kollagenase NB4G | Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Deutschland | 17465.02 | Los vom Hersteller auf enzymatische Aktivität geprüft |
| Präparierschere | Braun Aesculap AG & CoKG, Melsungen, Deutschland | BC 601 | |
| DNA-bindender Farbstoff (Bisbenzimid H33342) | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland | B2261 | |
| Dulbecco's modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) | PAN Biotech, Rickenbach, Deutschland | P04-03600 | |
| Fötales Kälberserum (FCS) | Biochrom GmbH, Berlin, Deutschland | S0615 | |
| Feine Pinzette | S& T AG, Neuhausen, Schweiz | FRS-15 RM-8 | |
| Feine Schere | World Precision Instrumets, Sarasota, FL, USA | 503261 | |
| Hautersatz (Integra) | Integra Life Sciences, Sain Priest, Frankreich | 62021 | |
| Ketamin | Serumwerk Bernburg AG, Bernburg, Deutschland | 7005294 | |
| M-IgG2akAL488 | eBioscience, San Diego, CA USA | 53-4724-80 | |
| Octeniderm (Desinfektionslösung) | Schü LKE & Mayer, Norderstedt, Deutschland | 118211 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom, Berlin, Deutschland | A2213 | |
| Petrischale | Greiner bio-one, Frickenhausen, Deutschland | 664160 | |
| Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) | Lonza Group, Basel, Schweiz | 17-516F | |
| pluriStrainer 20-& micro; m (20 µ m filter) | HISS Diagnostics, Freiburg, Deutschland | 43-50020-03 | |
| Rat-IgG2akFITC | BD Biosciences, Heidelberg, Deutschland | 553988 | |
| Rat-IgG2akPE | BD Biosciences, Heidelberg, Deutschland | 553930 | |
| Kleine Präparationsschere | S& T AG, Neuhausen, Schweiz | SDC-15 R-8S | |
| Chirurgische Zange | Braun Aesculap AG & CoKG, Melsungen, Deutschland | BD510R | |
| Tape (Heftpflaster Seide) 1,25 cm | Fink & Walter GmbH, Mechweiler, Deutschland | 1671801 | |
| Xylazin | Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Deutschland | 1320422 | |
| α-SMA-AL488 | eBioscience, San Diego, CA USA | 53-9760-82 | Intrazelluläre Markierung erfordert zusätzlich Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences, Heidelberg, Deutschland; #554722) |
Referenzen
- Langer, R., Vacanti, J. P. Tissue engineering. Science. 260 (5110), 920-926 (1993).
- Khademhosseini, A., Langer, R. A decade of progress in tissue engineering. Nat Protoc. 11 (10), 1775-1781 (2016).
- Novosel, E. C., Kleinhans, C., Kluger, P. J.
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Nachdrucke und Genehmigungen
