Bewertung der sarkoplasmatischen Retikulum Calcium Reserve und intrazellulären diastolische Calcium Entfernung in isolierten ventrikulären Kardiomyozyten

Summary

Recycling von intrazellulären Calcium spielt eine entscheidende Rolle bei Regulierung der systolischen und diastolischen Funktion in Herzmuskelzellen. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur sarkoplasmatischen Retikulum Ca^{2 +} Reserve und diastolische Kalzium-Removal-Funktion in Herzmuskelzellen durch ein Calcium imaging-System zu bewerten.

Abstract

Recycling von intrazellulären Calcium spielt eine entscheidende Rolle bei Regulierung der systolischen und diastolischen Funktion in Herzmuskelzellen. Kardiale sarkoplasmatischen Retikulum (SR) dient als Ca^{2 +} Reservoir für Kontraktion, welche Reuptakes intrazellulären Ca^{2 +} während der Entspannung. Die SR Ca^{2 +} Reserve für Beats ist determinate für kardiale Kontraktilität, und die Entfernung von intrazellulären Ca^{2 +} ist entscheidend für die diastolische Herzfunktion. Unter bestimmten pathophysiologischen Bedingungen wie Diabetes und Herzinsuffizienz können den Fortschritt der kardialen Dysfunktion beeinträchtigt Kalzium Clearance und SR Ca^{2 +} Shop in Kardiomyozyten beteiligt werden. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur SRCa^{2 +} Reserve und diastolische Ca^{2 +} Entfernung zu bewerten. Kurz, eine einzelne Cardiomyocyte wurde enzymatisch isoliert, und die intrazelluläre Ca^{2 +} Fluoreszenz von Fura-2 angegeben wurde von einem Kalzium-imaging-System aufgezeichnet. Um Koffein zur Induktion SR Ca^{2 +} Gesamtfreigabe beschäftigen, preset wir eine automatische Perfusion Schalter Programm durch Vernetzung der Stimulation und die Perfusion System. Dann wurde die Mono-exponentielle Kurvenanpassung für die Analyse von Verfall Zeitkonstanten von Kalzium Transienten und Koffein-induzierte Kalzium Impulse verwendet. Entsprechend der Beitrag des SR Ca^{2 +}-ATPase (SERCA) und Na⁺-Ca^{2 +} Wärmetauscher (NCX) diastolischen Kalzium Entfernung wurde ausgewertet.

Introduction

Intrazellulären Calcium recycling ([Ca^{2 +}]_ich) spielt eine entscheidende Rolle bei Regulierung der systolischen und diastolischen Funktion in Kardiomyozyten¹. Wie wir wissen, initiiert die Kalzium-induzierte Ca^{2 +} Freigabe der Erregung-Kontraktion Kupplung, die übersetzen des elektrischen Signals zur Kontraktion. Membran-Depolarisation aktiviert die sarcolemmal L-Typ Ca^{2 +} -Kanäle, die Ca^{2 +} induzieren von SR in das Zytoplasma über Ryanodin-Rezeptoren 2 (RyR2) zu befreien. Die vorübergehende erhöhte zytoplasmatischen Ca^{2 +} initiiert Kontraktion der Myofibrillen. Während der Diast....

Protocol

alle Tierversuche durchgeführt gemäß Protokollen durch die institutionelle Animal Care and Use Committee an Experimental Research Center, China Academy of Chinese Medical Sciences und Zhejiang University genehmigt.

1. Vorbereitung der Lösung

1. bereiten Sie alle Lösungen, wie in Tabelle 1 beschrieben.

2. Isolation des linken Ventricular (LV) Kardiomyozyten

Hinweis: LV Kardiomyozyten sind isoliert enzymatisch mit einem Langendroff Perfusion System wie oben beschrieben ^{7 , 8 ,}

Results

Wir zeigen hier, Streptozocin (STZ) - induzierte diabetische Ratten (DM) und Alter abgestimmten Sprague - Dawley (SD) Ratten zum Beispiel. 8 Wochen alten männliche SD-Ratten (200 ± 20 g) erhielt eine einmalige intraperitoneale Injektion von STZ (70 mg/kg, Ip) für den DM-Gruppe oder Citrat-Puffer für die Kontrollgruppe. Eine Woche nach STZ Verwaltung, Ratten mit Blutzucker > 16,7 Mmol/L wurden als Diabetiker. Nach 8 Wochen wurden die LV Myozyten enzymatisch isoliert. Nach Kalzium Wieder.......

Discussion

Kalzium-Flussmittel befreit die SR ist Ca^{2 +} Hauptquelle für Systole im Herzen. Teilweise, die Amplitude der SR Ca^{2 +} Content und die gebrochene Ca reflektieren^{2 +} SR befreit die SR Ca^{2 +} Reserve für kardiale Kontraktion zur Verfügung. Auf der anderen Seite hängt die Ca^{2 +} Reserve von SR von der Fähigkeit der SR Ca^{2 +} Reuptake, Ca^{2 +} Leck von SR und ihr Gleichgewicht über die SR während der Diastole^12,

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
NaCl	Alfa Aesar	012314
MgCl2	Alfa Aesar	012315
KCl	Alfa Aesar	11595
HEPEs	Sigma	H3375
D-Glucose	Alfa Aesar	A16828
NaOH	Alfa Aesar	A18395
KOH	Alfa Aesar	A18854
KH2PO4	Alfa Aesar	011594
MgSO4	Alfa Aesar	3337
L-Glutaminsäure	Alfa Aesar A15031
Taurin	Alfa Aesar	A12403
EGTA	Sigma	E3889
Kollagenase A	Roche	10103586001
Kollagenase Typ II	Worthington	LS004177
BSA Roche		735094
Koffein	Sigma	C0750
Fura-2 AM	Invitrogen	F1201
Mikroskop	Olympus	Olympus IX 71
Langendorff System	Beijing Syutime Technology Co	PlexiThermo-S-LANGC
Mikromanipulator	Marchauser	MM33 Links
Perfusionskammer	IonOptix	FHD
Valve Controlled Gravity Perfusion System	ALA	VC 3-8
Valve Commander Software	ALA	VC 3 1.0.1.2
Präzisions-Durchflussregler	Delta Med	3204315
Multi-Barrel Manifold Perfusion Pencil	AutoMate Scientific	04-08-[360]
Mikron abnehmbare Spitze	AutoMate Scientific	360um i.d.
Fluoreszenzmess- und Zelldimensionierungssysteme	IonOptix	Hyperswitch
Aufzeichnungssoftware	IonOptix	IonWizard 6.2.59
Stimulator	IonOptix	MyoPacer EP
Sprague-Dawley Ratten	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co.	SCXK 2016-01-01-007436