Expansion und Adipogenese Induktion von Adipozyten-Progenitoren aus perivaskulärem Fettgewebe, isoliert durch magnetisch aktivierte Zellsortierung

Zusammenfassung

Hier berichten wir über eine Methode zur Isolierung von Adipozyten-Progenitor-Zellen (APC) -Populationen aus perivaskulärem Adipositus (PVAT) mittels magnetisch-aktivierter Zellsortierung (MCS). Diese Methode ermöglicht eine erhöhte Isolierung von APC pro Gramm Fettgewebe im Vergleich zu Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS).

Zusammenfassung

Die Erweiterung des perivaskulären Adipositus (PVAT), ein wichtiger Regulator der Gefäßfunktion durch parakrine Signalisierung, steht in direktem Zusammenhang mit der Entwicklung von Hypertonie bei Adipositas. Das Ausmaß der Hypertrophie und Hyperplasie hängt von der Depotposition, dem Geschlecht und der Art der Adipocyten-Progenitor-Zelle (APC) -Phänotypen ab. Techniken, die für die APC- und Präadipozyten-Isolierung in den letzten 10 Jahren verwendet wurden, haben die Genauigkeit, mit der einzelne Zellen auf der Basis spezifischer Zelloberflächenmarker identifiziert werden können, drastisch verbessert. Allerdings kann die Isolierung von APC und Adipozyten aufgrund der Zerbrechlichkeit der Zelle eine Herausforderung sein, besonders wenn die intakte Zelle für Zellkulturanwendungen erhalten bleiben muss.

Magnetisch aktivierte Zellsortierung ( MCS) stellt eine Methode zur Isolierung einer größeren Anzahl von lebensfähigen APC pro Gewichtseinheit von Fettgewebe zur Verfügung. APC, das von MCS geerntet wird, kann für in vitro Protokolle verwendet werden, um prea zu erweiternDipozyten und differenzieren sie in Adipozyten durch Verwendung von Wachstumsfaktor-Cocktails, die die Analyse des produktiven und adipogenen Potentials ermöglichen, das von den Zellen zurückgehalten wird. Dieses Experiment konzentrierte sich auf die Aorten- und Mesenterial-PVAT-Depots, die bei der Entwicklung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen bei der Expansion eine Schlüsselrolle spielen. Diese Protokolle beschreiben Methoden zur Isolierung, Erweiterung und Differenzierung einer definierten Population von APC. Dieses MCS-Protokoll ermöglicht die Isolierung in jedem Experiment, wo Zellsortierung mit minimaler Ausrüstung oder Training erforderlich ist. Diese Techniken können weitere Experimente unterstützen, um die Funktionalität bestimmter Zellpopulationen basierend auf der Anwesenheit von Zelloberflächenmarkern zu bestimmen.

Einleitung

Perivaskuläres Fettgewebe (PVAT) ist aufgrund seiner Nähe zu den Blutgefäßen eine wichtige Parakrin-Signalisierungskomponente in der Gefäßfunktion ¹ . Die Erweiterung dieses Fettgewebes hängt vom Phänotyp der Adipocyten-Progenitor-Zellen (APC) ^{2 , 3 ab} . Die Isolierung von Zellen aus adipösen Geweben ist schwierig, da primäre Adipozyten zerbrechlich, schwimmfähig und reich an Größe sind. Bestimmte Isolationstechniken können auch den Zellphänotyp und die Morphologie verändern, indem sie die entzündliche Proteinsynthese erhöhen und die adipogene Genexpression ⁴ reduzieren und die Bedeutung eines Protokolls hervorheben, das die Integrität der Zellen beibehält.

Die Kultur der Primärzellen und der spezifischen Präadipozyten-Subpopulationen ergibt einen reduktionistischen Ansatz für das Wachstum von In-vivo und behält das äquivalente zelluläre genetische Make-up ^{5 bei}Mich mit diesen Zellen ist begrenzt wegen der Verschlechterung mit Alterung oder Seneszenz ⁶ . Präadipozyten aus verschiedenen adipösen Depots, einschließlich subkutaner und omentaler Depots, zeigen auch Unterschiede in der Proliferation ⁷ , was die Bedeutung des Sammelns von Zellen aus spezifischen anatomischen Stellen hervorhebt. Vorläuferzellen aus nicht-PVAT-weißen adipösen Depots wurden in früheren Studien ^{7 , 8 , 9} charakterisiert, aber weniger ist bekannt über PVAT APC-Phänotypen.

Die hier beschriebenen Techniken erlauben die Analyse spezifischer und definierter APC-Populationen mit minimaler Auswirkung auf ihre Morphologie, ihre Lebensfähigkeit und ihr Potenzial zur Proliferation und Differenzierung. Magnetisch aktivierte Zellsortierung (MCS) ist nachgeschalteten Anwendungen wie Kultur möglich, da sich die Kügelchen auflösen, ohne die Zelle zu verändern. MCS ist auch ökonomisch, und sobald der Antikörper conKonzentrationen wurden standardisiert, die Notwendigkeit für Durchflusszytometrie-Assays ist minimal. In-vitro- Studien mit PVAT-Vorläufern können auch einen Einblick in das Potenzial geben, das diese Primärzellen haben können.

Protokoll

Alle in diesem Papier beschriebenen Verfahren folgen den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Michigan State University. Alle Puffer und Medien sollten vor Licht geschützt werden.

1. Vorbereitung von Puffern, Medien und Instrumenten

1. Kocher Ringer Bicarbonat-gepufferte Lösung (KRBB): 135 mM Natriumchlorid, 5 mM Kaliumchlorid, 1 mM Magnesiumsulfat, 0,4 mM Kaliumphosphat dibasisch, 5,5 mM Glucose, 1% Antibiotikum / Antimykotikum (10.000 Einheiten / ml Penicillin, 10.000 μg / Ml Streptomycin, 25 & mgr; g / ml Amphotericin B) und 10 mM HEPES (pH = 7,4). Diese Lösung ist für 3 Wochen stabil, wenn sie steril gehalten wird und bei 4 ° C.
2. Vorbereitung der Kollagenase Typ 1 Lösung: 1 mg / ml in KRBB mit 4% Rinderserumalbumin (BSA). Diese Lösung sollte bei 37 ° C gehalten werden und ist für 4 h stabil.
3. Vorbereitung der Erythrozyten-Lyse-Pufferlösung: 154 mM Ammoniumchlorid, 10 mM Kaliumbicarbonat, Und 0,1 mM EDTA. Bei 4 ° C bis zu einem Monat aufbewahren.
4. MCS-Blocking-Puffer vorbereiten: DMEM / F12-Medienbasis, 10% fetales Rinderserum (FBS), 5% normales Eselserum, 40 μl / mL F (ab) Fragment-Esel Anti-Ratten-IgG. Bei 4 ° C bis zu einem Monat aufbewahren.
5. MCS-Pufferlösung vorbereiten: Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS, pH = 7,5), 0,5% BSA und 2 mM EDTA. Bei 4 ° C bis zu einem Monat aufbewahren. Entgasungslösung durch Erwärmen auf 37 ° C in einem Glasbehälter und anschließendes Anlegen eines Vakuums für 15 s. Unbenutzte gepufferte versiegelt lassen.
6. Vorbereiten der Strom-Gefäß-Fraktion (SVF) Basalmedien: Dulbecco's-modifiziertes Eagles Medium (DMEM): F12, 15% Fetales Kalbs Serum (FCS), 1% Antibiotikum / Antimykotikum (10.000 Einheiten / ml Penicillin, 10.000 μg / ml Streptomycin, 25 μg / Ml Amphotericin B), 44,05 mM Natriumbicarbonat, 100 μM Ascorbinsäure, 33 μM Biotin, 17 μM Pantothenat, 2 mM L-Glutamin und 20 mM HEPES. Halten Sie steril und bei 4 ° C für bis zu 2 Wochen.
7. Vorbereitung APC &# 160, Medien: Basal Media mit zusätzlichen Wachstumsfaktoren einschließlich epidermalem Wachstumsfaktor 10 ng / ml), Leukämie-Inhibitorfaktor (10 ng / ml), Plättchen-abgeleiteter Wachstumsfaktor BB (10 ng / ml) und basischer Fibroblastenwachstumsfaktor ( 5 ng / ml). Halten Sie steril und bei 4 ° C für bis zu 2 Wochen.
8. Vorbereiten von APC-Induktionsmedien: APC-Medien mit 10% FBS, 2,5 μg / ml Insulin, 0,5 mM 2-Isobutyl-1-methylaxanthin (IBMX), 1 μM Dexamethason und 200 pM T3 (Trijodthyronin-Schilddrüsenhormon). Halten Sie steril und bei 4 ° C für bis zu 2 Wochen.

2. Adipozyten-Progenitoren Isolierung

1. Anästhesieren Sie die Ratte nach den institutionellen Richtlinien. Lege die Ratte in dorsale Wiederholung. Bestätigen Sie die Tiefe der Anästhesie über eine Zehensperre und den Verlust der Reflexantwort auf diesen schmerzhaften Reiz.
   HINWEIS: Dieses Protokoll verwendet 10-wöchige Sprague-Dawley-Ratten und 70 mg / kg Pentobarbital, die über eine intraperitoneale Injektion abgegeben werden.
2. Machen Sie eine vertikale Mittellinie Inzision wIth Schere entlang des Sternums im Thoraxbereich und zum Dammbereich. Greifen Sie auf die Bauchhöhle zu und setzen Sie die überlegene mesenteriale Arterie, die kleinen mesenterischen Resistenzgefäße (mPVAT) und die Thoraxaorta (aPVAT) aus.
   1. Trennen Sie alle Verbindungen zum Mesenterium und zur Aorta und entfernen Sie Gefäße aus dem Tier. Isoliere PVAT unter Verwendung eines Sektionsmikroskops und Petrischale, die mit KRBB gefüllt ist, um Gefäße zu sehen und PVAT zu isolieren.
   2. In diesem Experiment sammeln Sie Gonaden (GON) adipos, um ein Nicht-PVAT-Adipose-Depot zu repräsentieren. Legen Sie isolierte Fettpolster auf Eis in KRBB mit 10 mM HEPES (pH = 7,4).
   3. In einer Biosicherheitshaube über 50 mg Gewebe in ein 1,7 mL Röhrchen mit 1 mL Kollagenase Typ I-Lösung übergeben und mit Tissue Schere (1 - 3 mm Stück) zerkleinern.
3. Digest-Proben durch Inkubieren bei 37 ° C in einem Rotisserie-Inkubator (oder Inkubator mit einem Orbital-Shaker) für 1 h. In einer Biosicherheitshaube nacheinander Filter verdautes Material durch 100 und 40 Μm-Zell-Siebe in ein 50-ml-Röhrchen. Zentrifugen-resultierendes Filtrat bei 4 ° C für 10 min bei 300 × g
   ANMERKUNG: Alle Schritte im Protokoll von hier vorwärts sind in einer Biosicherheit Haube durchgeführt, um Zellen steril zu halten.
4. Den Überstand ausgießen und Pellets, die die SVF-Zellen enthalten, in 1 ml 1X Erythrozyten-Lyse-Pufferlösung resuspendieren und in ein 1,7-ml-Mikrofugenröhrchen überführen. Inkubieren Sie die Zellen für 5 min bei RT vor Licht geschützt und zentrifugieren bei 4 ° C für 5 min bei 300 x g.
5. Den Überstand abgießen und das restliche Zellpellet in SVF Basal Media resuspendieren. Sammeln Sie eine 20 μl Unterprobe, um lebende Zellen mit Trypan Blue Solution zu zählen.
   HINWEIS: Die Anzahl der zu isolierenden SVF-Zellen variiert je nach Standort. Die durchschnittliche Anzahl der geernteten SVF pro mg Gewebe beträgt: aPVAT = 5,0 ± 2,0 x 10 ³ , mPVAT = 1,04 ± 0,62 x 10 ⁴ , GON = 2,4 ± 1,2 x 10 ⁵ .

3. Magnetisch aktivierte Zellsortierung

_content "> HINWEIS: APC von SVF auf Basis von CD34- und PDGFRα-Zelloberflächenmarkern isolieren, indem alle Schritte bei 4 ° C durchgeführt werden.

1. Spin Zellen für 5 min bei 300 x g. Den Überstand ausgießen und das Zellpellet im MCS-Blockierpuffer bei 1 x 10 ⁶ Zellen / ml resuspendieren und für 20 min inkubieren.
   HINWEIS: Zellsuspensionen von 1 x 10 ⁶ - 2 x 10 ⁸ Zellen / ml können effektiv getrennt werden.
2. Inkubieren von Zellen mit 5 & mgr; l FITC-konjugiertem Maus-anti-CD34 (1 & mgr; g / 1 × 10 ⁶ Zellen) für 30 Minuten bei 4 ° C. Spin-Zellen für 5 min bei 300 xg und 4 ° C.
   1. Inkubieren mit 4 & mgr; l Anti-FITC-Mikroperlen und 96 & mgr; l MCS-Puffer (Gesamtvolumen von 100 & mgr; l) für 5 min bei 4 ° C im Dunkeln, um CD34 ⁺ und CD34-Zellen zu trennen.
3. Befestigen Sie den Magnetabscheider am Stand und legen Sie die MultiSort (MS) -Säule mit den Säulenflügeln nach vorne in den Separator. Lege eine 5 mlSammelröhrchen unter der MS Säule im oberen Rohrhalter.
4. Vorbereitung der MS-Säule durch Spülen mit MCS-Pufferlösung. Tragen Sie 500 μl MCS-Puffer auf die Spalte und lassen Sie den Puffer durchlaufen. Abwässer abnehmen und Sammelröhrchen wechseln
5. Load-Antikörper-markierte Zellsuspension auf die vorbereitete MS-Säule geben. Sammle Durchfluss mit unmarkierten Zellen.
6. Waschen MS Säule mit 500 μl entgaste MCS Puffer 3x. Sammeln Sie unmarkierte Zellen, die durchlaufen und mit dem Durchfluss durch den vorherigen Schritt kombinieren.
7. Entfernen Sie die MS-Säule aus dem Magnetabscheider und legen Sie sie auf ein neues Sammelrohr. 1 ml MCS-Puffer auf die MS-Säule pipettieren. Sofort die Fraktion mit den magnetisch markierten Zellen durch festes, aber langsames Aufbringen des mit der Säule versorgten Kolbens ausspülen, um kein überschüssiges Gas in die Säule zuzulassen.
   HINWEIS: Die isolierten Zellnummern variieren je nach Standort. Durchschnittliche Anzahl CD34 ⁺ APC, isoliert aus der SVF-Population proMg Gewebe sind: aPVAT = 2,6 ± 0,43 x 10 ² , mPVAT = 9,6 ± 1,4 x 10 ² , GON = 1,3 ± 0,22 x 10 ³ .
8. Spin-Zellen für 5 min bei 300 × g und 4 ° C. Inkubieren der CD34 ⁺ -Fraktion, die in 10 & mgr; l einer 1: 200-Lösung / 1 × 10 ^6- Zellen Kaninchen-anti-PDGFR & agr; für 30 min bei 4 ° C gesammelt wurde.
   1. Die Zellen erneut 5 min bei 300 xg und 4 ° C zentrifugieren. Inkubieren markierter Zellen mit 4 & mgr; l Anti-Kaninchen-IgG-Mikroperlen und 96 & mgr; l MCS-Puffer durch Wiederholen der Schritte 3.3 bis 3.7 zum Isolieren.
      HINWEIS: Die isolierten Zellnummern variieren je nach Standort. Die durchschnittlichen Zahlen von PDGFRα ⁺ APC, die aus der CD34 ⁺ -Population pro mg Gewebe isoliert wurden, sind: aPVAT = 2,4 ± 0,64, mPVAT = 8,4 ± 2,4, GON = 10,4 ± 1,9, was 0,5 bis 10% der zuvor isolierten Population beträgt.

4. Zellkultur und Adipogenese Induktion

1. Kultur der SVFUnd APC in 6-Well Gewebekulturplatten in Basalmedien mit Ersatz alle 2 Tage. Nach 3 seriellen Passagen, Platte in schwarzen 96-Well-Gewebekulturplatten bei 1x10 ² Zellen / Vertiefung für Proliferationsassays, die bei 8, 24, 48 und 96 h ausgewertet werden, und bei 50.000 Zellen / Vertiefung in 24-Well-Platten oder 10.000 Zellen / Vertiefung in 48-Well-Gewebekulturplatten für Adipogenese-Assays, die qualitativ und quantitativ sind.
2. Supplement APC basale Medien für 48 h nach der Konfluenz und vor der Induktion mit knochenmorphogenem Protein 4 (3,3 nmol / L), wie angegeben für die Differenzierung. Induzieren Zellen nach 48 h von 100% Konfluenz (Tag 0) mit dem APC Induktionsmedium, um die Zellen zu inkubieren.
3. Nach 48 h wechsle die Medien zur Aufbewahrung von Zellen in APC Induktionsmedien ohne IBMX und Dexamethason, für 14 Tage mit Medienwechsel alle 48 Stunden.
4. MCS-Isolierung durch FACS validiert.
   1. Nehmen Sie eine 50 μl (50.000 Zelle) Unterprobe von magnetisch getrenntZellen und waschen mit FACS-Lösung.
   2. Zentrifugieren und in 100 & mgr ^; l einer 1: 1000 Lösung von Esel-Anti-Kaninchen-IgG-Dylight 405 resuspendieren, um die PDGFR ^& agr; ⁺ -Zellen zu markieren. Inkubieren für 30 min vor Licht und bei 4 ° C geschützt.
   3. Waschen von Zellen und Resuspendieren in 200 μl 2% Formaldehydlösung bis zur Analysezeit mit 488 nm (FITC) und 405 nm (Dylight 405) Filtern auf einem Durchflusszytometer.
      ANMERKUNG: Die Lipidakkumulation durch kultivierte Zellen wird quantitativ unter Verwendung eines lipophilen Adipogenese-Fluoreszenzassays in einem Mikroplattenleser gemessen, der Fluoreszenz misst und Präadipozyten als Kalibratoren für die Lipidakkumulation verwendet. Die Lipidakkumulation wird auch qualitativ durch Lipidfärbefärbung und Bildgebung gemessen, die an einem invertierten Mikroskop durchgeführt wird, das mit einer Kamera ausgestattet ist, wobei der Prozentsatz der Gesamtzellen, die das Lipid beobachten oder nicht enthalten, beobachtbar ist. Jeder Plattenleser, der in der Lage ist, Fluoreszenz mit Erregung bei 485 nm und Emission bei 572 zu messenNm eignet sich sowohl für die Analyse als auch für jedes Mikroskop mit einer Kamera, die digitale Bilder erfassen kann.

Ergebnisse

Die Proliferationsfähigkeit von Präadipozyten und das adipogene Potential von Adipozytenvorläufern sind Merkmale, die in vitro beibehalten werden ¹¹ . In vitro- Proliferation von isoliertem SVF und APC aus aPVAT wurden mPVAT und GON von männlichen Ratten bei 8, 24, 48 und 96 h nach dem Plattieren unter Verwendung eines quantitativen DNA-Assays bewertet. Es wurden keine Ortsunterschiede in der SVF-Expansionsrate zu irgendeinem Zeitpunkt beobachtet...

Diskussion

Im Mittelpunkt des vorliegenden Experiments steht die Isolierung, Expansion und adipogene Induktion von APC aus PVAT-Depots. Hier stellen wir ein Protokoll zur Isolierung von APC vor, das auf der Identifizierung von Zellen basiert, die die Oberflächenmarker CD34 und PDGFRα exprimieren. Diese Oberflächenproteine ​​wurden zuvor auf APC mit hohen Proliferationsraten und dem Potential identifiziert, in weiße oder braune Adipozyten in verschiedenen adipösen Depots ^{14 , 15<...}

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Gewebedissektion
Präparierschalen	Handgefertigt mit Silikonkultur
Petrischale	Pyrex		7740 Glas
Silikon Elastomer	Dow Corning	Sylgard 170	Kit
Geflochtene Seidennaht	Harvard Apparat	51-7615	SP104
Stereomikroskop MZ6	Leica		10447254
Stereomaster Mikroskop Faseroptische Lichtquelle	Fisher Scientific	12562-36
Vannas Schere	George Tiemann & Co	160-150
Splitterzange	George Tiemann & Co	160-55
Gewebeschere	George Tiemann & Co	105-400<
strong>KRBB Lösung
Natriumchlorid	Sigma-Aldrich	7647-14-5
Kaliumchlorid	Sigma-Aldrich	7447-40-7
Magnesiumsulfat	Sigma-Aldrich	7487-88-9
Kaliumphosphat zweibasisch	Sigma-Aldrich	7758-114
Glukose	Sigma-Aldrich	50-99-7
Antibiotikum/Antimikotikum	Corning	30-004-CI
HEPES	Corning	25-060-CI
Tissue Digest
Collagenase Typ 1	Worthington Biochemisches	LS004196
Rinderserumalbumin (BSA)	Fisher Scientific	9048-46-8
Lysepuffer für rote Blutkörperchen	BioLegend	420301	1X Arbeitslösung
Wasserbad	Thermo-Fisher Scientific	2876	Reziprokes Schüttelbad
Biosicherheitswerkbank	Thermo-Fisher Scientific	1385
Rotisserie-Inkubator	Daigger	EF4894C
100 & Mikro; m Cell Sieb	Thermo-Fisher Scientific	22-363-549	Gelb
40 & Mikro; m Cell Strainer	Thermo-Fisher Scientific	22-363-547	Blaues
Hämozytometer	Cole-Parmer	UX-79001-00
Trypan Blue	Sigma-Aldrich	93595
Cell Isolation
OctoMACS Kit	Miltenyi Biotech	130-042-108
(DMEM):F12 Medium	Corning	90-090
Fötales Rinderserum (FBS) mit mittlerer Basenbasis	Corning	35016CV	USA Herkunft
Normales Eselserum	AbCam	AB7475
Anti-CD34	Santa Cruz	SC-7324	FITC-konjugiertes
Anti-PDGFRα	Thermo-Fisher Scientific	PA5-17623
Esel Anti-Kaninchen-IgG	Jackson ImmunoResearch	712-007-003
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) 10X	Corning	46-013-CM	1X Arbeitslösung
EDTA	Fisher Scientific	15575020
Cell Culture
CO 2 Zell-Inkubator	Thermo-Fisher Scientific	51030285	Heracell 160i
6-Well-Platten	Corning	3516	TC-behandelte
48-Well-Platten	Corning	3548	TC-behandelte
96-Well-Platten, Black	Wall Corning	353376	TC-behandeltes
Natriumbicarbonat	Sigma-Aldrich	144-55-8	TC-behandeltes
fötales Kälberserum (FCS)	Corning	35011CV	USA Herkunft
Ascorbinsäure	Sigma-Aldrich	50-81-7
Biotin	Sigma-Aldrich	58-85-5
Pantothenat	Sigma-Aldrich	137-08-6
L-Glutamin	Corning	61-030
Bone Morphogenic Protein 4 (BMP4)	Prospec Bio	CYT-081
Epidermaler Wachstumsfaktor (EGF)	PeproTech	400-25
Leukämie-Hemmfaktor	PeproTech	250-02
Thrombozyten-abgeleiteter Wachstumsfaktor BB	Prospec Bio	CYT-740
Basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF)	PeproTech	450-33
Insulin	Corning	25-800-CR	ITS-Lösung
IBMX	Sigma-Aldrich	28822-58-4
Dexamethason	Sigma-Aldrich	50-02-2
T3 (Trijodthyronin)	Sigma-Aldrich	6893-023
Zellanalyse
CyQUANT Proliferationsassay	Thermo-Fisher Scientific	C7026
AdipoRed Fluoreszenzassay Reagenz	Lonza	PT-7009
Öl Rot O Lipidfarbstoffreagenz	Sigma-Aldrich	O1391	In Solution
M1000 Mikroplatten-Reader	Tecan
Eclipse Inverses Mikroskop	Nikon
Digital Sight DS-Qil Kamera	Nikon