Summary
Exame ecocardiográfico é frequentemente usada em ratos. Aparelhos de ultra-som de alta resolução caro foram desenvolvidos para esta finalidade. Este protocolo descreve um procedimento ecocardiográfico acessível, combinado com análises morfométricas histológica para determinar a morfologia cardíaca.
Abstract
Um número crescente de modelos do rato geneticamente modificados tornou-se disponível nos últimos anos. Além disso, o número de estudos farmacológicos realizados em ratos é alto. Caracterização fenotípica destes modelos do rato também requer o exame da função cardíaca e morfologia. Ecocardiograma e ressonância magnética (MRI) são abordagens comumente usadas para caracterizar a função cardíaca e morfologia em camundongos. Ecocardiográfica e ressonância magnética equipamentos especializados para uso em pequenos roedores é caro e exige um espaço dedicado. Este protocolo descreve medidas cardíacas em ratos usando um sistema clínico ecocardiográfico com uma sonda vascular humano de 15 MHz. As medições são realizadas em ratos adultos anestesiados. Pelo menos três sequências de imagem são registradas e analisadas para cada animal no modo-M na exibição de eixo curto paraesternal. Depois, exame histológico cardíaco é executado, e diâmetros de casos são determinados em hematoxilina-eosina - ou germe de trigo aglutininas (WGA)-manchado de parafina. Densidade do navio é determinado morfometricamente depois immunostaining Pecam-1. O protocolo tem sido aplicados com sucesso para estudos farmacológicos e diferentes modelos de animais geneticamente sob condições de linha de base, bem como após o infarto do miocárdio experimental pela ligadura permanente do (de artéria coronária descendente anterior esquerda RAPAZ). Em nossa experiência, a investigação ecocardiográfica é limitada a animais anestesiados e é viável em ratos adultos, pesando pelo menos 25 g.
Introduction
Uma grande variedade de modelos de rato geneticamente modificados estão disponíveis, e o número de estudos farmacológicos em camundongos é alta1,2. Ecocardiograma e ressonância magnética são abordagens comumente usadas para a caracterização fenotípica da função cardíaca e morfologia nestes modelos de rato3. O objectivo do protocolo apresentado é analisar a função cardíaca e morfologia em ratos adultos. Ele combina ecocardiográfica, histológicos e medições de imuno-histoquímica. Exame ecocardiográfico é amplamente utilizado em ratos4,5,6,7,8,9,10,11, 12. Pachon et al 11 identificado 205 estudos publicados em circulação, Circulação pesquisa, American Journal of Physiology - coração e fisiologia do sistema circulatórioe Cardiovascular Research entre 2012 e 2015 que usado o exame ecocardiográfico em animais.
Ecocardiografia é usada para identificar fenótipos cardíacos em ratos geneticamente modificados5,6,13,14,15,16, 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22, bem como para analisar a função cardíaca em hipertrofia induzida por sobrecarga crônica, isquemia miocárdica e modelos de cardiomiopatia em camundongos (revistos em12). Equipamento de ecocardiografia melhorado permite a medida padrão de imagem Doppler tecido ventricular esquerda dimensões de pressão sistólica e diastólica (LV), ecografia de contraste miocárdico e a avaliação da função regional de LV e reserva coronariana 12. idealmente, exame ecocardiográfico deve ser executada em ratos conscientes para evitar os efeitos negativos da anestesia na função contrátil, controle reflexo autonômico, e11a taxa de coração. No entanto, essa abordagem é limitada pela exigência de treinar os animais; dificuldades em manter a temperatura do corpo estável; artefatos de movimento; estresse; frequências cardíacas muito altas; e a exigência de pelo menos dois investigadores realizar o experimento, especialmente se um grande número de animais que estão sob investigação. Curiosamente, um estudo recente relatou não há diferenças em parâmetros ecocardiográficos em animais treinados e destreinados19. Realizamos medições ecocardiográficas em ratos anestesiados. Protocolos de anestesia diferente serão discutidos abaixo.
Apesar de ecocardiografia de resolução padrão (> 10 MHz) é suficiente para medir LV sistólica e diastólica dimensões e função cardíaca em ratos adultos, o método é limitado em sua descrição de fenômenos estruturais subjacentes. Assim, aliamos as medições na vivo com histológicos e reagidos análises para medir, por exemplo, casos de diâmetro e embarcação de densidade. Outras investigações histológicas e reagidos, tais como a determinação de proliferação, exame de apoptose, medições de tamanho do infarto, determinação de fibrose e a expressão do marcador específico, também podem ser executadas no mesmo tipo de tratados de tecido, mas não são objecto do presente protocolo. A combinação de na vivo exame ecocardiográfico com análise histológica fornece insights adicionais sobre alterações estruturais subjacentes. Em uma etapa adicional, podemos completar estas medições com investigações ultra estruturais e moleculares. Análise histológica não só completa o exame ecocardiográfico, mas também tornar-se indispensável quando a resolução da Ecocardiografia não é suficiente. Este é especialmente o caso em modelos de camundongos geneticamente modificados que são letal embrionário23,24.
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Protocol
os experimentos descritos aqui foram realizados em conformidade com as leis de bem-estar animal francês e institucionais relevantes, diretrizes e políticas. Foram aprovados pelo Comitê de ética francês (Comité Institutionnel d ' Ethique Pour L' ' Animal de Laboratoire; número NCE/2012-106).
1. ecocardiografia
- determinar o peso do corpo do mouse utilizando uma balança de laboratório padrão, mantendo-a levemente pela cauda para garantir o posicionamento adequado.
- Anestesiar o animal pela injeção intraperitoneal (i.p.) de 50 mg/kg pentobarbital 25 , 26.
Nota: Qualquer outro tipo de anestesia pode ser usado se o mesmo protocolo que é usado ao longo do estudo. Vantagens e desvantagens serão discutidas abaixo. - o mouse de volta em sua própria gaiola e espere até que ele não está respondendo, ele mostra a respiração firme, e pé traseiro reflexos estão ausentes. Para testar isso, esprema um pé ligeiramente e observar se a perna ainda retrai.
- Raspar o lado esquerdo do tórax e a axila esquerda, usando uma máquina de barbear roedor comercial.
Nota: O uso de uma máquina de barbear roedor dedicado permite a remoção completa dos pelos de rato bem para evitar a interferência na medição ecocardiográfica. Comercial de cabelo remoção cremes ou soluções devem ser evitadas, como eles geralmente são perfumados, que irá perturbar o animal depois que ela desperta. Evite barbear excessiva, pois aumenta a perda de calor. - Colocar o animal dormindo sobre uma almofada quente consta para 40-42 ° C em uma posição superficial lado esquerdo, com a cabeça em 12 o ' relógio e a cauda em 6 o ' relógio. Fixar o braço esquerdo, perna esquerda e cauda com fita.
- Aplicar pré aquecido ecocardiografia gel para o peito depilado e a cabeça do transdutor.
- Coloca o transdutor paraesternal esquerdo, dirigindo-a para o lado direito do pescoço para obter um bidimensional (2D) longo-eixo esternal no nível do músculo papilar. O transdutor 90° gire no sentido horário para obter uma visão do eixo curto a nível do músculo papilary. Use uma configuração de profundidade mínima e um zoom para maximizar a imagem qualidade e taxa de quadros. Definir a velocidade de varredura para o máximo.
- Para obter essas configurações, definindo opções de profundidade e zoom diferente pode ser usado, dependendo da máquina e software. Gravar imagens de M-modo 2D-interativa no eixo curto ver 27. Consulte a figura 1A e B 27.
Nota: tenha cuidado para evitar aplicar pressão excessiva no peito, pois isso pode causar bradicardia.
- Para obter essas configurações, definindo opções de profundidade e zoom diferente pode ser usado, dependendo da máquina e software. Gravar imagens de M-modo 2D-interativa no eixo curto ver 27. Consulte a figura 1A e B 27.
- Série de registro pelo menos 3 de 3 loops de cine batida de coração por cada animal.
Nota: Para o software ecocardiográficos utilizado neste estudo, pressione o " adquirir/Save " o botão apenas uma vez. Esta metodologia é específica para o ecocardiográficos com este software específico. Outros pacotes de software podem ser usados com diferentes máquinas. - Depois de gravações bem sucedidas, limpe a Ecocardiografia do gel do tórax de rato, almofada de aquecimento e transdutor. Remova a fita de membros e cauda.
- Deixar o mouse sob observação na rampa de aquecimento, coberta com tecido para evitar desnecessária exposição e calor perda de luz, até que ele acorda de cima
- Coloque o animal de volta em sua jaula.
- Analyze gravou imagens da M-modalidade de esternal eixo curto para determinar a função e ventricular esquerdo (LV) dimensões. Medir a espessura de parede anterior LV na sístole e diástole (LVAWs e LVAWd), os LV final-sistólica e diastólica final diâmetros internos (LVIDs e LVIDd) e a espessura de parede posterior de LV (LVPW) em sístole e a diástole (LVPWs e LVPWd) usando o identificação da interface tecido-sangue sobre as imagens armazenadas.
- Medir as dimensões diastólica aquando da aparente máxima LV diastólica dimensões e LV dimensões sistólica-final no momento da excursão sistólica mais anterior da parede posterior da LV. Toque de tela sensível ao toque no " Analyze " ícone e, em seguida, sobre o " LVAWd " ícone. Posicionar o paquímetro eletrônico na interface entre a cavidade ventricular direita e a parede anterior LV em diástole.
- Posicionar o paquímetro eletrônico na interface entre a parede anterior do LV e cavidade para obter a espessura de parede anterior diastólica LV LV; o software vai mudar diretamente para a medição final-diastólica interna de LV.
- Posicionar o paquímetro na interface entre a cavidade de LV e a parede posterior de LV para obter o diâmetro diastólico final interno LV; o software vai mudar para a medição de espessura de parede posterior de LV.
- Posicionar o paquímetro na interface entre a parede posterior do LV e o pericárdio para obter a espessura de parede posterior diastólica LV. Para dimensões sistólica LV, toque a tela de toque sobre o " LVAWs " ícone e posição o compasso de calibre eletrônico na interface entre a cavidade ventricular direita e a parede anterior do LV no systole.
- Posicionar o paquímetro eletrônico na interface entre a parede anterior do LV e cavidade para obter a espessura de parede anterior sistólica LV LV. Repita o processo conforme descrito acima para o diâmetro final-sistólica interno de LV e a espessura da parede posterior sistólica LV. Use a Convenção de ponta adotada pela sociedade americana de ecocardiografia para rastrear as fronteiras endocárdico e epicárdico 13 , 27.
Nota: Parâmetros da função contrátil LV serão automaticamente calculados usando as medidas anteriores. O LV fracionária de encurtamento (FS) é definido como FS (%) = [(LVIDd-LVIDs)/LVIDd] x 100. A fração de ejeção de LV (EF) é calculada com a fórmula modificada de Teicholz, onde EF (%) = [(LVIDd3-LVIDs3)/LVIDd 3] x 100 12. Consulte a figura 1A e B. - Armazenar os dados em CDs ou cartões de memória USB e faça cópias de backup.
- Importação, analisar e exportar os dados usando o software apropriado.
Nota: Após as medições de linha de base, o experimento pode ser pausado. Se realizar uma comparação direta entre animais nocaute e selvagem-tipo littermates, prosseguir com a análise histológica 6. Para Cre-ERT2; linhas de rato de salmão/salmão fumado, continuar no dia seguinte com tamoxifeno indução por injeção i.p., como descrito na 5 , 24. Se induzir miocárdio experimental pela ligadura da artéria coronária esquerda 5 , 28, a cirurgia poderia ser realizada diretamente após as medidas ecocardiográficas, quando os ratos estão sob anestesia. Caso contrário, um prazo mínimo de uma semana entre as duas rodadas da anestesia deve ser mantido para limitar a taxa de letalidade pós-operatória.
2. Preparação de amostras de coração para avaliação histológica
- sacrificar os animais por deslocamento cervical. Meça seu peso corporal. Desinfectar o peito e abdômen, usando um algodão embebido em álcool 70%.
- Fazer uma incisão transversa na pele 1cm distal ao esterno. Usando pinças sem corte, retire a pele do tórax, indo na direção da cabeça. Segure o esterno levemente com a pinça fina e abrir o diafragma, inserindo o fim brusco da tesoura bem.
- Cortar a caixa torácica em ambos os lados paralelos ao esterno. Mova o esterno na direção da cabeça. Localize o coração no tórax. Mantenha o tronco vascular do coração com a pinça fina e corte abaixo usando a tesoura bem.
- Abra o baú e retirar todo o coração fora do tórax, medir o peso de coração e estabelecer um peso do coração-a-corpo relação 4 , 5 , 6 , 23 , 29 , 30 < /sup >.
- Fix o coração em 2 mL de solução de formol tamponado a 10% neutro em tubos de 15 mL a noite no 4 ° C.
Cuidado: perigo! Trabalho com soluções de formalina deve ser feito em uma coifa de química; usar luvas e óculos de segurança.
Nota: Como a composição do tampão de soluções de formol varia com diferentes fornecedores, utilize o mesmo fornecedor ao longo do estudo. - No dia seguinte, cortar os corações no plano transversal, no meio e transferi-los para fitas para a incorporação de parafina, que é realizada no laboratório de patologia, usando um aparelho automatizado de encastre.
- Executar seccionamento.
- Blocos de parafina de seção em uma espessura de 3 µm usando um micrótomo e boia-los em uma água de 40 ° C do banho com água destilada. As seções sobre guias de transferência de
- . Permitir que os slides para secar durante a noite em uma incubadora de 37 ° C e armazená-los em 4 ° C até que esteja pronto para uso.
Nota: O protocolo pode ser pausado aqui até que o usuário está pronto para a coloração (etapa 3).
- Deparaffinize e hidratar o tecido desliza.
- Coloque os slides na coloração de frascos com pastilhas de vidro em um forno de 55 ° C por 10 min derreter a parafina.
- Deparaffinize os slides em duas mudanças de 200ml de xilol ou xileno substituto por 5 min cada.
Atenção: Altamente inflamável e tóxico! Trabalho em uma coifa de química; usar luvas e óculos de segurança. - Transferir os slides para 200 mL de álcool a 100%. Fazer duas alterações por 3 min cada e transferir uma vez através de 200 mL de álcool 95% por 3 min.
Cuidado: Inflamável! Mantenha longe de fontes de ignição; Não se pode fumar. - Lavar duas vezes em 200 mL de tampão fosfato solução salina (PBS) por 5 min cada e continue com o passo 3, 4 ou 5.
3. Hematoxilina e eosina coloração
- enxaguar os slides com suas seções em água destilada.
- Mancha os núcleos com solução de hematoxilina de 8 min.
- Enxaguar em água corrente durante 10 min.
- Mancha com solução de eosina por 2 min.
- Desidratando três vezes por 2 min em 100% de etanol (EtOH). Limpe 3 vezes por 2 min em xilol ou xileno substituto. Monte em um meio de montagem baseada em xileno.
- Fotografar os slides e medir o diâmetro de casos a nível do núcleo em secções longitudinais do septo interventricular. Medir a pelo menos 100 células por seção e três seções por coração.
4. Coloração de WGA
- a incubar obtidos de passo 2.7 com diversos (ou outros corantes fluorescentes)-conjugados WGA (1: 100 em PBS) para 60 min à temperatura ambiente em uma câmara húmida.
- Lave tres vezes com PBS por 5 min cada.
- Montagem com fluorescência montagem mídia contendo DAPI. Loja a 4 ° C, no escuro antes da análise.
Cuidado: Use proteção para os olhos e luvas resistentes a produtos químicos compatíveis. - Fotografar os slides.
- Uso um microscópio equipado com epi-iluminação de fluorescência e filtro define para DAPI e diversos (consulte a Tabela de materiais). Definir a abertura para o máximo e o brilho para auto-exposição.
- Adquirir separa imagens na ampliação de x 400 para o azul e os vermelhos canais. Abra as imagens no ImageJ. Ajustar o brilho e o contraste se necessário (imagem > ajuste > brilho/contraste).
- Definir cada imagem de 8 bits (imagem > tipo > 8-bit). Sobrepor as imagens DAPI e WGA. Use o canal azul para DAPI e o canal vermelho para WGA; definir os canais verdes e cinzento para none (imagem > cor > mesclar canais) 31.
- Determinar os diâmetros de casos a nível do núcleo em secções transversais do septo interventricular.
- Define a escala das imagens no ImageJ. Para este efeito, fotografar um objeto de tamanho conhecido (por exemplo, uma câmara de hemocytometer a mesma ampliação como as seções de coração; passo 4.4).
- Usar a ferramenta em linha reta para desenhar uma linha do começo ao fim da estrutura conhecida (Analyze > definir escala).
Nota: A distância em pixels será exibida automaticamente; a unidade de comprimento e distância conhecida terá que ser inserido. Prosseguir com as medições de casos a nível do núcleo. - Desenhar uma linha reta da membrana WGA-positivo através do núcleo de DAPI-positivo para o site oposto da membrana celular WGA-positivo (Analyze > medida). Na janela de resultados, verifique se os valores de comprimento tem um significativo número de casas decimais (Analyze > definir medidas > casas decimais).
- Medida pelo menos 100 células por seção e três seções pelo coração. Exportar os resultados para Excel (clique em resultados > arquivo > salve como >. csv) 6 , 31.
5. Immunostaining pecam-1
- executar o antígeno desmascaramento.
Buffer
- Adicionar 1.600 mL de citrato de sódio (citrato de sódio de 10 mM, 0,05% de Tween 20, pH 6.0) para uma panela de pressão. Coloque a panela sobre a chapa e transformá-lo em força total. Não prenda a tampa da panela de pressão neste ponto; simplesmente coloque-o no topo.
Cuidado: Quente! - , Uma vez que o tampão de citrato de sódio está fervendo, transferir os slides da etapa 2.5 para a panela de pressão. Fixe a tampa da panela de pressão. Assim que a panela atingir pressão completa, espere por 7 min. Quando transcorridos 7 min, desligue a chapa e coloque a panela de pressão em um coletor de vazio. Ativar a válvula de alívio de pressão e correr água fria sobre o fogão. Uma vez que ele tem de pressurizado, abra a tampa e correr água fria na panela de 5 min. do lugar os slides em 200 mL de PBS.
Nota: Como alternativa, desmascaramento de antígeno de microondas poderia ser utilizado, embora o risco de superaquecimento é aumentado.
- Adicionar 1.600 mL de citrato de sódio (citrato de sódio de 10 mM, 0,05% de Tween 20, pH 6.0) para uma panela de pressão. Coloque a panela sobre a chapa e transformá-lo em força total. Não prenda a tampa da panela de pressão neste ponto; simplesmente coloque-o no topo.
- Uso 0,3% de peróxido de hidrogênio em metanol para atividade de peroxidase endógena bloco 5 min. enxágue os slides para três vezes por 2 min cada em 200 mL de PBS.
Cuidado: Inflamável e tóxico! - a incubar por 15 min em diluídos bloqueio soro normal (5% de soro de cabra normal em PBS) que também contém um bloco de avidina (4 gotas em 1 mL).
- Com cuidado toque o líquido das seções e incube-os com Pecam-1 anticorpos de coelho, diluída 01:50 em PBS contendo 2,5% de soro de cabra normal e 4 gotas de bloco de biotina por mL. Incubar os slides durante a noite em uma câmara húmida a 4 ° C.
- Lavar as lâminas 3 vezes durante 5 min cada em 200 mL de PBS. Incube as secções com biotinilado cabra anti-coelho IgG anticorpo diluído 1: 200 em PBS contendo 2,5% de soro de cabra normal por 1h à temperatura ambiente. Lavar as lâminas 3 vezes durante 5 min cada em 200 mL de PBS.
- Incubar tseções do com um sistema baseado em avidina/biotina peroxidase por 20 min (Reagente A e Reagente B precisa ser combinados 30 minutos antes de usar). Lavar as lâminas 3 vezes durante 5 min cada em 200 mL de PBS.
- Dissolver 1 3,3 '-diaminobenzidina (DAB) e peróxido de hidrogênio 1 ureia comprimido em 5 mL de água bidestilada. Incube as secções com DAB solução por aproximadamente 3 min, monitorando cuidadosamente desenvolvimento de cor. Parar a reação de cor lavando suavemente os slides em 200 mL de PBS.
Cuidado: Cancerígenos; usar luvas resistentes a produtos químicos! - Counterstain os núcleos para 6 min com hematoxilina. Enxaguar em água corrente por 2 min. desidratando por 2 min cada por três vezes em 200 mL de álcool a 100%. Limpe 3 vezes por 2 min cada em 200 mL de xileno ou um substituto do xileno. Monte em um meio de montagem baseada em xileno.
- Fotografar os slides (pelo menos dez campos na ampliação de 40x do septo interventricular de cada coração) e medir a densidade de área Pecam-1 usando o livremente disponível de software ImageJ 31. Usar o plugin de 32 de deconvolução de cor para DAB e hematoxilina e ajustar o contraste da imagem ao mesmo nível.
Nota: caso a cor marrom e roxo/azul tem sobreposição espectral significativa, o que pode causar dificuldades com deconvolução de cor, um poderia tentar diferentes marcas de solução de hematoxilina, para obter a coloração nuclear clara, luz-azul. Alternativamente, pode ser executada de imunofluorescência ou contagem manual dos capilares.
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Representative Results
Na Figura 1, representante gravações ecocardiográficas demonstram a utilidade da ecocardiografia para identificar fenótipos cardíacos em camundongos geneticamente modificados. A diferença entre um mouse com função cardíaca normal (figura 1A) e um animal com uma dilatação do ventrículo esquerdo e função LV reduzida (figura 1B) pode ser facilmente identificada. A Figura 2 mostra a comparação de casos medições de diâmetro em animais sem (Figura 2A) e com hipertrofia cardíaca (Figura 2B) usando seções de coração de parafina corados por hematoxilina-eosina e medições de seções longitudinais do tecido cardíaco. A Figura 3 ilustra a medição de diâmetros transversal de casos usando cortes de parafina WGA-manchado de corações de controle de ratos (Figura 3A) e animais com hipertrofia cardíaca (Figura 3B). A Figura 4 mostra a utilidade da imuno-histoquímica Pecam-1 (coloração de substrato, marrom de DAB) das seções cardíacas para determinar a densidade de vasos do tecido cardíaco normal (Figura 4A) e corações com angiogênese aumentada (Figura 4B ).
Figura 1: Ecocardiografia de resolução padrão (> 10 MHz) medida LV sistólica e diastólica dimensões e função cardíaca em camundongos com dilatada hipertrofia cardíaca após infarto do miocárdio contra animais de controle.
Representante gravações ecocardiográficas de ratos normais e saudáveis (A) e animais com dilatação de LV e função LV reduzida após infarto do miocárdio (Tie2-CreERT2; PPARβ/δ + tamoxifeno ratos)5 (B). O LVAW, LVID e LVPW são indicados. As barras brancas representam a pressão sistólica e diastólica de pontos de medição. Eles correspondem ao cursor pontos definido para medições e são explicados na etapa de protocolo 1,12. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: hematoxilina-eosina-manchado seções para medir diâmetros de casos nas células secionadas longitudinalmente de ratos com dilataram animais controle e hipertrofia cardíacos. Imagens representativas de diâmetros de casos em ratos com tamanhos de casos normais (A) e animais com aumento de casos de tamanhos (Tie2-CreERT2; PPARβ/δ + tamoxifeno ratos)5 (B). As linhas pretas indicam os diâmetros medidos. Os valores para cada medição estão representados. Barras de escala = 50 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: seções manchadas de WGA para medir diâmetros transversal de casos em secções de tecido cardíaco de ratos com hipertrofia cardíaca dilatada versus controlam animais. Imagens representativas para diâmetros de casos em ratos com tamanho normal casos (A) e animais com aumento de casos de tamanhos (Tie2-CreERT2; PPARβ/δ + tamoxifeno ratos)5 (B). Núcleos eram counterstained com DAPI. As linhas brancas indicam os diâmetros medidos ao nível dos núcleos (azuis). Os valores para cada medição estão representados. Barras de escala = 50 µm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Pecam-1 immunolabeled seções para analisar a densidade de vasos cardíacos em ratos controle e animais com maior angiogênese.
Imagens representativas para a embarcação rotulagem em camundongos com densidade vascular normal (A) e animais com vascularização reforçada (Tie2-CreERT2; PPARβ/δ + tamoxifeno ratos)5 (B). Núcleos eram counterstained com hematoxilina. As setas apontam para os navios Pecam-1-positivo. Barras de escala = 50 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Diferentes métodos têm sido desenvolvidos para avaliar a estrutura cardíaca e função em ratos, incluindo ecocardiografia avançada contraste MRI, micro CT e PET-scan. Devido à sua relação custo-eficácia e simplicidade, a Ecocardiografia é a técnica mais amplamente utilizada para a análise funcional em ratos11. Em geral, por causa do pequeno tamanho do coração e a alta frequência da frequência cardíaca em ratos, Transdutores com frequência > MHz 10 deve ser usado, embora medições bem sucedidas têm sido relatadas com 8 ou 9 MHz transdutores4,7 . Como a função cardíaca está intimamente relacionada com a temperatura corporal e frequência cardíaca, é importante controlar esses parâmetros ao longo do estudo. Colocar o mouse sobre uma almofada de aquecimento é essencial para manter a temperatura do corpo do animal anestesiado constante. Idealmente, uma almofada de aquecimento controlado com uma sonda rectal para definir a temperatura de 38 ° C deve ser usada. Se este não estiver disponível, a almofada de aquecimento deve ser definida para dois a três graus acima deste valor. Lâmpadas de aquecimento deve ser evitado, como complicam a tarefa para o investigador e o risco de sobreaquecimento dos animais.
Para controlar a frequência cardíaca e a função cardíaca, o tipo de anestesia é altamente importante. A maioria dos estudos usar isoflurano, como anestesia é fácil induzir por inalação em uma câmara de indução (3% de isoflurano), pode ser mantida através de uma máscara de inalação (1-2% de isoflurano) e é só de curta duração. Outras substâncias comumente usadas são 2, 2,2-tribromoetanol, pentobarbital e ketamina + xilazina mistura11,12. Surpreendentemente, isoflurano foi relatado para comprometer a função cardíaca em medidas ecocardiográficas, e este efeito foi ainda mais pronunciado no xilazina ketamina + grupo11. Cetamina só funcionou melhor no presente estudo,11. Gao et al. relatou os resultados mais reprodutíveis com 2, 2,2-tribromoetanol12. Os resultados foram na mesma faixa de isoflurano, 2, 2,2-tribromoetanol e pentobarbital12. Além disso, taxas de coração não eram diferentes no 2, 2,2-tribromoetanol e pentobarbital agrupa12. Coração et al relataram taxas mais baixas do coração na ketamina + grupo de xilazina em comparação com o grupo 2, 2,2-tribromoetanol16. Em nossos experimentos utilizando estirpes diferentes do rato transgénico e anestesia de pentobarbital, as taxas de coração médios variou entre 350 e 450 bpm. Não obstante, frações de ejeção foram > 80%, o que corresponde aos valores em animais conscientes11. Ecocardiográficas medições sob a linha de base, as condições de nosso laboratório4,5,6 estão na mesma faixa como relataram em outro lugar11,12,14 ,15,16,17,18,19,20,21,22,26 . Em contraste com pentobarbital, cetamina, isoflurano e 2, 2,2-tribromoetanol caracterizam-se pela recuperação e início rápido. Assim, o tempo entre as medições ecocardiográficas e anestesia deve ser o mesmo para todos os animais em estudo para evitar diferentes graus de recuperação da anestesia. Pentobarbital age mais, mas tem a desvantagem de uma pequena janela terapêutica, tornando-se necessário ajustar a dose firmemente em relação ao peso corporal. A anestesia de longa duração usando o pentobarbital tem a vantagem de que, após medições ecocardiográfica de linha de base, procedimentos cirúrgicos pode ser realizada sem a necessidade de re-injeção5. Anestesia repetitiva usando pentobarbital deve ser evitada como, em nossa experiência, injeções com intervalo de menos de uma semana resultaram no aumento da mortalidade pós-operatória.
Ao realizar ecocardiografia em ratos com um > transdutor de 10 Mhz, a qualidade das fotos deve ser suficiente para determinar a função global de LV. Várias fotos devem ser tomadas para cada animal reduzir as variações de passo-a-passo e artefatos de movimento. Conselhos de especialistas de um cardiologista treinado ou uma cientista com experiência em ecocardiografia em ratos devem ser pediu no início, para avaliar a qualidade das imagens. A maioria das máquinas de ecocardiografia calculam EF de diâmetros internos de LV usando a fórmula11,de Teicholz12. Mesmo quando as dimensões de LV são fáceis de medir, eles fornecem uma avaliação imperfeita de áreas e volumes de LV porque a LV não obedece a qualquer forma geométrica ideal, simplificada. Nem fracionária fração de encurtamento nem ejeção obtida com a fórmula de Teicholz é um perfeito parâmetro para determinar a função contrátil LV, pois ambos são baseados em uma suposição geométrica e descrever a contratilidade das paredes apenas dois. Fração de ejeção avaliada com método de Simpson o biplano seria mais exata, mas foi impossível obter em todos os animais com o equipamento usado aqui.
Após infarto do miocárdio, enfrentamos diversos problemas relacionados com a imagem ecocardiográfica. Em primeiro lugar, qualidade de imagem foi grandemente prejudicada pela cicatriz de toracotomia. Em segundo lugar, os animais eram muito mais sensíveis à anestesia repetida. Finalmente, medições de volume e função baseados em modo-M LV assumem que a geometria de LV é homogênea. Como consequência, a utilização desses índices torna-se mais controversa na presença de anormalidades de movimento de parede LV após infarto do miocárdio.
Em nossas mãos, o uso de uma sonda de 15 MHz permitido para a ocasional, mas não é sistemática, gravação de imagens Doppler. Frequências muito mais altas são necessárias para determinar a função regional de LV ou realizar ecocardiografia de contraste miocárdico, que só pode ser obtida com equipamentos dedicados para roedores12.
Tendo em conta as possibilidades adicionais e maior resolução desses sistemas específicos de roedores, deve-se considerar usá-los no futuro. As desvantagens são os custos mais elevados e a necessidade de um espaço dedicado. Estes high-end, dedicada ao roedor ecocardiográficos será rentáveis se suficiente animais estão sob investigação e um número crítico de cientistas usa o equipamento. Com o treinamento especial oferecido para estas máquinas, pode ser usados por cientistas não especialistas em Cardiologia. O equipamento de ecocardiografia clínica fornece uma resolução limitada, como mencionado acima. No entanto, ainda com êxito é usado em diferente l experienteaboratories11,12; pode ser facilmente usado por cientistas experientes e cardiologistas; é mais móvel e menos exigentes em um espaço dedicado; e, devido ao elevado número de máquinas, permite a consideração de diferentes opções para reduzir custos (por exemplo, alugar, obtenção de equipamento que não está em uso clínico ou fazer compras de segunda mão).
Para análise histológica, o primeiro ponto crítico é minimizar o tempo entre o isolamento do órgão e a fixação do tecido. Como no presente protocolo, a maioria das análises histológicas e coloração baseiam-se na microscopia de luz transmitida; fixação de imersão do tecido em formol coração é suficiente. Se o foco de um projeto é mais na coloração microscópica de fluorescência, deve-se considerar a fixação de perfusão dos animais anestesiados para remover as células vermelhas do sangue no tecido, que mostram autofluorescência.
Para evitar variações na incorporação da parafina, usamos um aparelho de encastre automatizado. Como o ponto de fusão e dureza diferem entre as marcas da parafina, recomendamos o uso do mesmo fornecedor ao longo do estudo. Parafina de corte deve ser realizado em blocos pre-refrigerados usando um micrótomo rotativo. Espessura de corte deve ser mantida constante. Uma espessura de corte de 3 µm permite a visualização clara das fronteiras de membrana nas seções de hematoxilina-eosina-manchadas de coração, que é necessário para a medição de diâmetros de casos. Como forma de cardiomyocytes é irregular, as medições devem ser efectuadas no nível do núcleo. Coloração de WGA fornece uma maneira alternativa para manchar a membrana celular e resultará nos mesmos valores como coloração de hematoxilina-eosina. Antes de análises morfométricas, um deve definir claramente qual parte do coração (ou seja, parede livre ventricular direita ou esquerda ou septo) será medido e se casos secções transversais são determinados no eixo longo ou curto. Devido o transverso, espiral e orientação longitudinal dos cardiomyocytes no coração, é possível obter no mesmo seção transversal longitudinais e transversais seções do cardiomyocytes. Medem-se os diâmetros longitudinais ou transversais é uma questão de Convenção, desde que as células são analisadas a nível do núcleo.
Em nossos estudos, observamos um acordo entre as dimensões ecocardiográficas e relações peso do coração-a-corpo e casos tamanhos4,5,6, mas medições histológicas do tamanho de casos não sempre correspondem aos valores da fração de ejeção. Por exemplo, exercício resulta em aumento dimensões cardíacas, com diâmetros de casos de aumento e uma fração de ejeção preservada. No entanto, insuficiência cardíaca descompensada é caracterizada por aumento dimensões cardíacas, com uma fração de ejeção reduzida e aumento de casos de diâmetros33. Além disso, mostramos recentemente que navio cardíaca maior densidade devido à superexpressão endoteliais específicas de PPARβ não resulta na melhoria da função cardíaca em condições de linha de base, nem em recuperação melhorada após infarto do miocárdio5 .
Para imuno-histoquímica, é importante para incluir controles negativos e realizar as diferentes etapas de bloqueio fornecidas no protocolo. A etapa de desmascarar de antígeno no protocolo é específica para o anticorpo primário usado. Para os anticorpos primários diferentes, é necessário determinar se desmascarar buffers de alta ou baixa --pH resultarão em um sinal melhor. Técnicas de fixação diferentes podem ser usadas para detectar um antigénio específico. Por exemplo, Pecam-1 rotulagem relatou que funcionam melhor em zinco-fixas, parafina do tecido, enquanto a mesma fixação necessárias etapas adicionais para reduzir o plano de fundo para um anticorpo de trombomodulina34. Assim, usamos a fixação regular formalina, que permitiu para estender o estudo para uma variedade de antígenos diferentes. Alternativa de imunocoloração Pecam-1, isolectin B4 é frequentemente utilizada para visualizar os vasos. Além de uma proporção de células endoteliais35, isolectin B4 também rotula glia36 e macrófagos37. Além disso, uma variedade de antígenos pode ser usada para distinguir entre células endoteliais arteriais e venosas38. Uma maneira elegante de Visualizar funcional perfundidos navios ou para determinar o navio brotando ou regressão é a injeção intravenosa de lectina fluorescência acoplados, seguida pela análise de cryosections24. No entanto, esta abordagem largamente limita as possibilidades para detectar antígenos adicionais e executar análises morfométricas devido a qualidade diferente do cryosections.
Immunostained seções onde o sinal é visualizado com DAB, a densidade de área pode ser quantitativamente determinada usando o software ImageJ livremente disponível. No entanto, como o sinal não é linear, o grau de coloração marrom não correspondem exatamente ao nível da expressão da proteína.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
O trabalho foi financiado pelo governo francês (Agência Nacional de pesquisa, ANR) através do programa "Os investimentos para o futuro" LABEX SIGNALIFE (referência ANR-11-LABX-0028-01) e por subsídios para K. d. W. da Associação pour la Recherche sur le Cancer, Fondation de France e planejar Inserm de câncer. D. B. e V. a. receberam bolsas do Fondation pour la Recherche Médicale e partir da cidade de Nice, respectivamente. O ecocardiográficos e o transdutor foram gentilmente fornecidos pela Philips. Agradecemos Borderie r., S. Destree, M. Cutajar-Bossert, r. Landouar, r. Martres, r. Biancardini e S. M. Wagner por sua assistência técnica qualificada.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wheat germ agglutinin (WGA) conjugated tetramethylrhodamine | Life Technologies, Molecular Probes | W849 | |
| Biotinylated Goat Anti-Rabbit IgG Antibody | Vectorlabs | BA-1000 | |
| Avidin/Biotin Blocking Kit | Vectorlabs | SP-2001 | |
| VECTASTAIN Elite ABC HRP Kit (Peroxidase, Standard) | Vectorlabs | PK-6100 | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vectorlabs | H-1200 | |
| SIGMAFAST 3,3'-Diaminobenzidine tablets | Sigma | D4168 | |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma | H1009 | |
| Anti-Pecam-1 (CD31) antibody | Abcam | ab28364 | |
| Ultrasound transmission gel, Gel Aquasonic 100 | Parker | ||
| Linear ultrasound probe, L15-7io | Philips Healthcare | ||
| Echocardiograph, IE33 xMATRIX | Philips Healthcare | ||
| Microscope, Leica DMi8 | Leica | ||
| Fluorescence Filterset DAPI | Leica | 11525304 | |
| Filterset TxR | Leica | 11525310 | |
| Digital Camera, SPOT RT3 Color Slider | Spot Imaging | ||
| Imaging Software, SPOT 5.2 Advanced and Basic Software | Spot Imaging | ||
| Imaging Computer | Dell | ||
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| Large Scissors | Fine Science Tools | 14501-14 | |
| Scalpel blades | Fine Science Tools | 10023-00 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11650-10 | |
| Rodent shaver | Harvard Apparatus | 34-0243 | |
| cassettes for paraffin embedding | Sakura | 4155F | |
| neutral buffered Formalin | Sakura | 8727 | |
| Xylene | Sakura | 8733 | |
| Paraffine TEK III | Sakura | 4511 | |
| automated embedding apparatus, Tissue-Tek VIP | Sakura | 6032 | |
| paraffin-embedding station Tissue-Tek TEC 5 | Sakura | 5229 | |
| microtome blades,Accu-Edge S35 | Sakura | 4685 | |
| microscopy slides, Tissue-Tek | Sakura | 9533 | |
| cover slips, Tissue-Tek | Sakura | 9582 | |
| Mounting medium Tissue-Tek | Sakura | 1408 | |
| slide boxes | Sakura | 3958 | |
| eosine solution | Sakura | 8703 | |
| hematoxyline solution | Sakura | 8711 | |
| microtome, RM2125RT | Leica | 720-1880 (VWR) | |
| water bath, Leica HI1210 | Leica | 720-0113(VWR) | |
| Ethanol | VWR | ACRO444220050 | |
| 15 ml tubes | VWR | 734-0451 | |
| staining glass dish | VWR | MARI4220004 | |
| staining jars | VWR | MARI4200005 | |
| Incubator | Binder | 9010-0012 | |
| DAB and urea hydrogen peroxide tablets, SIGMAFAST 3,3′-Diaminobenzidine tablets | Sigma | D4293 | |
| PBS (10X) | Thermo Fisher Scientific | 70011044 |
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