Summary
Ультразвуковое обследование часто используется в мышах. Дорогой высокого разрешения ультразвуковых устройств были разработаны для этой цели. Этот протокол описывает доступные эхокардиографические процедуры, в сочетании с гистологической морфометрический анализ для определения сердца морфологии.
Abstract
Все большее количество моделей генетически модифицированных мышь стала в последние годы. Кроме того количество фармакологических исследований, выполненных в мышей является высоким. Фенотипические характеристики этих моделей мыши также требует изучения функции сердца и морфологии. Часто используемые подходы к характеризуют функции сердца и морфология мышей эхокардиография и магнитно-резонансная томография (МРТ). Оборудование ультразвуковое и МРТ специализированных для использования в мелких грызунов является дорогостоящим и требует выделенного пространства. Этот протокол описывает кардиологических измерений в мышей с использованием клинических эхокардиографические системы с 15 МГц человека сосудистого зонда. Измерения проводятся на наркотизированных взрослых мышей. По крайней мере три последовательности изображений регистрируются и анализируются для каждого животного в M-режиме в представлении парастернальной короткой оси. Впоследствии, сердечной гистологическое обследование, и диаметры cardiomyocyte определяются на гематоксилином-эозином или зародышей пшеницы агглютининов (WGA)-окрашенных парафиновых срезах. Плотность судна — определяется morphometrically после Pecam-1 иммуноокрашивания. Протокол был успешно применяется для фармакологических исследований и различных генетических животных моделей в исходных условиях, а также после экспериментальной инфаркт миокарда, постоянным перевязка левой передней нисходящей коронарной артерии ( ЛАД). По нашему опыту, Эхокардиографическое исследование ограничивается наркотизированных животных и осуществимым в взрослых мышей, весом по меньшей мере 25 g.
Introduction
Большое разнообразие моделей генетически модифицированные мыши доступны, и количество фармакологических исследований на мышах-высокий1,2. Часто используемые подходы для фенотипического описания функции сердца и морфология в этих моделях мыши3эхокардиография и МРТ. Цель представленных протокола заключается в анализе функции сердца и морфология в взрослых мышей. Она сочетает в себе эхокардиографические, гистологические и иммуногистохимическое измерения. Ультразвуковое обследование широко используется в мышей4,5,6,,78,9,10,11, 12. Pachon и др. 11 определены 205 исследований, опубликованных в циркуляции, Исследования циркуляции, Американский журнал физиологии - сердца и кровообращения физиологиии Сердечно-сосудистых исследований между 2012 и 2015 годы использовано ультразвуковое обследование в животных.
Эхокардиографии используется для выявления сердечной фенотипы в генетически измененных мышей5,6,13,14,,1516, 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22, а также о том, как анализировать функции сердца в хроническая гипертрофия перегрузки индуцированной ишемии миокарда и кардиомиопатия модели мышей (обзор в12). Улучшенная эхокардиография оборудование позволяет для стандартной мерой левого желудочка измерения систолического и диастолического (LV), ткань Doppler изображений, эхография миокарда контраст и оценки региональных функции LV и коронарного резерва 12. в идеале, ультразвуковое обследование должно выполняться в сознательных мышей, чтобы избежать негативные последствия анестезии на сократительной функции, вегетативная рефлекс управления, и ЧСС11. Тем не менее этот подход ограничен требованием для обучения животных; трудности в поддержании температуры тела стабильным; движение артефакты; стресса; очень высокие частоты сердца; и требования по крайней мере двух следователей для выполнения эксперимента, особенно, если большое количество животных находятся под следствием. Интересно, что недавнее исследование сообщил никаких различий в эхокардиографических параметров в подготовленных и неподготовленных животных19. Мы осуществляем эхокардиографические измерений на наркотизированных мышей. Протоколы разных анестезии будет обсуждаться ниже.
Хотя стандартное разрешение эхокардиография (> 10 МГц) является достаточной для измерения LV систолического и диастолического размеры и функции сердца у взрослых мышей, метод ограничен в его описание базовых структурных явлений. Таким образом, мы объединяем в естественных условиях измерений с гистологическим и иммуногистохимического анализа для измерения, например, диаметра и судно плотности cardiomyocyte. Другие гистологического и иммуногистохимического исследования, например определение распространения, экспертиза апоптоза, инфаркте размеры, определение фиброза и конкретных маркер выражения, могут также выполняться на тот же тип Обработка тканей, но не являются предметом настоящего Протокола. Сочетание в vivo Эхокардиографическое обследование с гистологический анализ обеспечивает дополнительное понимание базовых структурных изменений. В качестве дополнительного шага мы можем завершить эти измерения с молекулярной и ультра-структурных исследований. Гистологический анализ не только полное ультразвуковое обследование, но и стать незаменимым при резолюции эхокардиографии не является достаточным. Это особенно верно в моделях генетически измененных мышей, которые являются эмбриональных смертоносных23,24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
во исполнение соответствующих институциональных и французский животных законов, руководящих принципов и политики были проведены эксперименты, описанные здесь. Они были одобрены французского Этический Комитет (Comité Institutionnel d ' Ethique Pour l ' животное де Laboratoire; номер NCE/2012-106).
1. эхокардиография
- определить вес тела с использованием стандартных лабораторных баланс слегка держа ее за хвост для обеспечения надлежащего позиционирования мыши.
- Анестезировать животное впрыской внутрибрюшинного (и.п.) 50 мг/кг Пентобарбитал 25 , 26.
Примечание: Любые другие виды анестезии может использоваться, если тот же протокол используется на протяжении всего исследования. Ниже будут обсуждены преимущества и недостатки. - Положил мыши обратно в свои собственные клетки и ждать до тех пор, пока он не отвечает, он показывает устойчивый дыхание, и задние ноги рефлексы отсутствуют. Чтобы проверить это, слегка сжать ноги и наблюдать ли нога по-прежнему втягивается.
- Бритья с левой стороны грудной клетки и левой мышкой, с использованием коммерческих грызунов бритвы.
Примечание: Использование выделенный грызунов бритва позволяет для полного удаления волос хорошо мыши чтобы избежать вмешательства в ультразвуковое измерение. Кремы удаления волос коммерческие или решения следует избегать, поскольку они обычно имеют душистый, которые будут беспокоить животное после того, как она пробуждает. Избегайте чрезмерного бритья, как он увеличивает потери тепла. - Положить спать животных на площадку теплой, равным 40-42 ° C в неглубокой левосторонней позиции, с головой в 12 o ' часы и хвост на 6 o ' часы. Закрепите ленту левой руки, левой ноги и хвост.
- Применить предварительно разогретую эхокардиография геля на бритые грудь и голову преобразователя.
- Место датчика парастернальной слева, направляя его к правой стороне шеи, чтобы получить представление двухмерный (2D) парастернальной Лонг оси на уровне папиллярных мышц. Включите датчик 90° по часовой стрелке, чтобы получить представление короткой оси на уровне мышц papilary. Использование параметра Минимальная глубина и зумом для максимально изображения качества и частоты кадров. Установите скорость развертки на максимум.
- Чтобы получить эти параметры, различные масштаб и глубину, Настройка параметров могут использоваться, в зависимости от машины и программное обеспечение. Записи 2D-руководствуясь M-режим изображения в короткой оси просмотра 27. Обратитесь к рис. 1A и B 27.
Примечание: Будьте осторожны, чтобы избежать чрезмерного давления на груди, как это может вызвать брадикардию.
- Чтобы получить эти параметры, различные масштаб и глубину, Настройка параметров могут использоваться, в зависимости от машины и программное обеспечение. Записи 2D-руководствуясь M-режим изображения в короткой оси просмотра 27. Обратитесь к рис. 1A и B 27.
- Запись по крайней мере 3 серии 3 сердце бить cine петли для каждого животного.
Примечание: Для echocardiograph программное обеспечение, используемое в настоящем исследовании, нажмите " приобретать/сохранить " кнопку только один раз. Эта методология для echocardiograph с этого конкретного программного обеспечения. Другие пакеты программного обеспечения могут быть использованы с различными машинами.
После успешной записи, протрите от эхокардиография гель от грудной клетки мыши, грелки и датчика - . Удалите ленту из конечностей и хвост.
- Оставьте мышь под наблюдением на грелке, покрытые ткани, чтобы избежать ненужных света воздействия и потери тепла, до тех пор, пока он просыпает вверх
- Положил животное обратно в его клетке.
- Анализ записал M-режим изображения с парастернальной короткой оси зрения для определения левого желудочка (LV) размеры и функции. Измерить толщину передней стенки LV систолы и диастола (LVAWs и LVAWd), LV внутренний конец систолическое и диастолическое конце диаметров (LVIDs и LVIDd) и толщина задней стенки LV (LVPW) в систолы и диастола (LVPWs и LVPWd) с помощью определение интерфейса ткани кровь на сохраненные изображения.
- Измерение диастолического размеров в то время очевидным максимальной LV диастолический размер и LV конец систолический размер в то время наиболее передней систолической экскурсии LV задней стенки. Коснитесь сенсорного экрана на " анализ " значок и затем на " LVAWd " значок. Положение на стыке полости правого желудочка и LV передней стенки в диастола Калипер.
- Позиция Калипер на интерфейсе между передней стенки LV и LV полость для получения LV диастолического передней стенки толщиной; программное обеспечение будет непосредственно перейти к LV внутреннего измерения конечного диастолического.
- Позиция суппорта на интерфейсе между полости LV и задней стенки LV для получения внутреннего конечного диастолического диаметр LV; программное обеспечение будет переключаться на измерение толщины задней стенки LV.
- Позиция суппорт на стыке задней стенки LV и перикарда для получения LV диастолического задней стенки толщиной. Для LV систолический размер, коснитесь сенсорного экрана на " LVAWs " значок и положение Калипер на интерфейсе между полости правого желудочка и передней стенки LV в систолой.
- Позиция Калипер на интерфейсе между передней стенки LV и полость LV для получения LV систолического передней стенки толщиной. Повторите этот процесс, как описано выше для LV внутренний диаметр конца систолическое и LV систолического задней стенки толщиной. Используйте передовые Конвенция, принятая американского общества эхокардиографии для отслеживания 13 , эндокарда и эпикардиальной границы 27.
Примечание: LV сократительной функции параметры будут автоматически рассчитываться с использованием предыдущего измерения. LV дробных сокращения (FS) определяется как FS (%) = [(LVIDd-LVIDs)/LVIDd] x 100. Фракция изгнания LV (EF) рассчитывается с модифицированной формуле Teicholz, где EF (%) = [(LVIDd3-LVIDs3)/LVIDd 3] x 100 12. Обратитесь к рис. 1A и B. - Хранить данные на компакт-диски или карты памяти USB и делать резервные копии.
- Импорта, анализировать и экспорт данных с использованием соответствующего программного обеспечения.
Примечание: После этих базовых измерений, эксперимент может быть приостановлена. Если прямое сравнение между нокаут животных и одичал тип однопометники, продолжите гистологический анализ 6. Для Cre-ERT2; жидкий кислород/lox мыши линии, продолжить на следующий день с тамоксифен индукции, и.п. инъекции, как описано в 5 , 24. Если заставить экспериментальной инфаркт миокарда, перевязка левой коронарной артерии 5 , 28, операция может быть выполнена непосредственно после эхокардиографические измерения, когда мышей находятся под наркозом. В противном случае, должна поддерживаться Минимальная задержка одной недели между двумя раундами анестезии ограничить скорость послеоперационная летальность.
2. Подготовка сердца проб для гистологического оценки
- жертву животных, шейки матки дислокации. Измерьте их веса тела. Лечить груди и живота, с использованием 70% спиртом.
- Сделать поперечный разрез в коже 1 см дистальной к грудине. Использование тупой щипцы, снять кожу от грудной клетки, двигаясь в направлении головы. Слегка придерживайте грудины тонкой щипцы и открыть диафрагму, вставив тупой конец тонкой ножницы.
- Разрезать грудную клетку с обеих сторон параллельно к грудине. Перемещения грудины в направлении головы. Найдите сердце в грудной клетке. Держите ствол сосудов сердца с тонкой щипцами и сократить ниже с помощью тонкой ножницы.
- Открыть сундук и акцизный всего сердца из грудной клетки, измерить вес сердца и создать сердца и тела вес коэффициент 4 , 5 , 6 , 23 , 29 , 30 < /SUP >.
- Исправление сердца в 2 мл нейтрального буферизации формалина 10% раствора в 15 мл пробирок на ночь при 4 ° C.
Предупреждение: опасность! Работа с формалином решения должно быть сделано в Химический вытяжной шкаф; Надевайте перчатки и защитные очки.
Примечание: Состав буфера для решения формалин изменяется с различными поставщиками, использовать того же поставщика на протяжении всего исследования. - На следующий день, вырезать сердца в поперечной плоскости, в середине и перевести их в кассеты для встраивания парафин, который производится в лаборатории патологии, используя автоматизированный аппарат встраивание.
- Выполняют секционирование.
- Разделе парафиновые блоки при толщине 3 мкм, используя микротом и плавать в воде 40 ° C Ванна с дистиллированной водой.
- Передачи секции на слайды. Разрешить слайды для высыхания на ночь в инкубаторе 37 ° C и хранить их на 4 ° С до готовности для использования в.
Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь до тех пор, пока пользователь готов для окрашивания (шаг 3).
- Deparaffinize и Регидратационный ткани слайды.
- Место слайды в пятнать баночки со стеклянными вставками в 55 ° C духовке 10 мин для плавления парафина.
- Deparaffinize слайды в два изменения по 200 мл, ксилол или заменой ксилола в 5 мин.
Предупреждение: Высоко горючих и токсичных! Работа в Химический вытяжной шкаф; Надевайте перчатки и защитные очки. - Передавать слайды в 200 мл 100% алкоголя. Сделать два изменения для 3 мин и после передачи через 200 мл 95% спирта на 3 мин
Предупреждение: Легковоспламеняющиеся! Держать вдали от источников возгорания; не курить. - Полоскать дважды в 200 мл фосфат буфер солевой раствор (PBS) для 5 мин и продолжите с шага 3, 4 или 5.
3. Гематоксилином и эозином
- промыть слайды с их разделами в дистиллированной воде.
- Пятно ядер с гематоксилином решение для 8 мин
- Промыть в проточной водопроводной воды за 10 мин.
- Пятно раствором эозина за 2 мин.
- Dehydrate три раза в течение 2 минут в 100% этанола (EtOH). Очистите три раза в течение 2 мин в ксилоле или ксилола замену. Гора в среде на основе ксилол монтажа.
- Фото слайды и измерить диаметр cardiomyocyte на уровне ядра в продольных секций межжелудочковой перегородки. Измерения по меньшей мере 100 клеток на секцию и три секции за сердце.
4. Пятнать WGA
- инкубировать слайды, полученные из шага 2.7 с тетраметилродамина (или других флуоресцентных красителей)-конъюгированных WGA (1: 100 в PBS) 60 мин при комнатной температуре во влажной камере.
- Мыть в три раза с PBS на 5 мин.
- Гора с флуоресценцией монтаж средств массовой информации, содержащие DAPI. Хранить при 4 ° C в темноте перед анализом.
Предупреждение: Надевайте средства защиты глаз и совместимых химически стойкие перчатки. - Фото слайды.
- Использования микроскопа с флуоресцентным epi освещение и фильтр наборы для DAPI и тетраметилродамина (см. Таблицу материалов). Установите диафрагму максимальные и яркость автоэкспозиция.
- Приобретать отдельные изображения при 400-кратном синий и красный каналы. Откройте изображения в ImageJ. Отрегулируйте яркость и контрастность, при необходимости (изображение > Настройка > яркость/контрастность).
- Присвоено 8-бит каждого изображения (изображение > тип > 8-бит). Наложение изображений DAPI и WGA. Использовать синий канал для DAPI и красный канал для WGA; значение none зеленые и серые каналы (изображение > цвет > объединение каналов) 31.
- Определить cardiomyocyte диаметров на уровне ядра в поперечной части межжелудочковой перегородки.
- Определить масштаб изображения в ImageJ. Для этой цели, сфотографировать объект известного размера (например, камеру Горяева на же увеличение как сердце секций; шаг 4.4).
- Использовать прямой инструмент нарисовать линию от начала до конца из известной структуры (анализ > задать масштаб).
Примечание: Расстояние в пикселях будут автоматически отображаться; известным расстоянием и единица длины придется вводить. Продолжить с cardiomyocyte измерения на уровне ядра. - Нарисовать прямую линию от WGA-положительных мембраной через ядро DAPI-позитивных на противоположной сайт WGA-позитивных клеточной мембраны (анализ > мера). В окне результатов, убедитесь, что длина значения имеют значимое количество десятичных разрядов (анализ > набор измерений > десятичных знаков).
- Измерения по меньшей мере 100 клеток на секцию и три секции за сердце. Экспортировать результаты в Excel (щелкните на результаты > файл > сохранить как > .csv) 31 6 ,.
5. PECAM-1 иммуноокрашивания
- выполняют антигена разоблачения.
- Добавить 1600 мл натрия цитрата буфер (цитрат натрия 10 мм, 0,05% 20 анимации, pH 6.0) для скороварки. Место скороварки на конфорку и поверните его на полную мощность. Не закрепляйте крышка скороварки на данный момент; просто остальные его на вершине.
ВНИМАНИЕ: Горячий! - После кипячения буфера цитрата натрия, передавать слайды с шагом 2,5 скороварки. Закрепите крышку скороварки. Как только плита достиг полного давления, ждать 7 мин. Когда прошло 7 минут, выключите конфорку и скороварку в пустую раковину. Активировать клапан выпуска и запустить холодной воды через скороварки. После того, как он де давлением, откройте крышку и запустить холодной воды в плита для 5 минут место слайды в 200 мл PBS.
Примечание: в качестве альтернативы, Микроволновая антигена разоблачения могут использоваться, хотя риск перегрева увеличивается.
- Добавить 1600 мл натрия цитрата буфер (цитрат натрия 10 мм, 0,05% 20 анимации, pH 6.0) для скороварки. Место скороварки на конфорку и поверните его на полную мощность. Не закрепляйте крышка скороварки на данный момент; просто остальные его на вершине.
- Использования 0,3% перекиси водорода в метаноле блока эндогенной пероксидазы деятельности за 5 минут промыть слайды по три раза в течение 2 минут каждый в 200 мл PBS.
Предупреждение: Горючих и токсичных! - Инкубировать слайды для 15 мин в разреженных нормального блокирования сыворотки (5% нормальной козьего сыворотки в PBS), которая также содержит блок авидин (4 капель в 1 мл).
- Тщательно коснитесь жидкости из разделов и инкубировать их с антитела Pecam-1 от кролика, разбавленных 1:50 в PBS, содержащие 2,5% нормальной козьего сыворотки и 4 капли биотина блока на мл. Инкубируйте слайды на ночь в камере влажного на 4 ° C.
- Мыть слайды три раза за 5 мин в 200 мл ФСБ. Инкубируйте секции с биотинилированным анти кролик коза IgG антитела разводят 1: 200 в PBS, содержащие 2,5% нормальной козьего сыворотки 1 ч при комнатной температуре. Вымойте слайды три раза за 5 мин в 200 мл PBS.
- Инкубировать tОн разделы с системой на основе авидин/биотина пероксидазы для 20 мин (Реагент A и реагент Б нужно быть комбинированный 30 минут до использования). Вымойте слайды три раза за 5 мин в 200 мл PBS.
- Растворить 1 3,3 '-Диаминобензидин (DAB) и 1 Мочевина пероксида водорода Планшетные в 5 мл двойной дистиллированной воды. Инкубируйте секции с КАПЛЮ раствора для примерно 3 мин, тщательно контролируя цвет развития. Остановить цветной реакции, аккуратно мыть слайды в 200 мл PBS.
Предупреждение: Канцерогенных; Надевайте защитные перчатки! - Counterstain ядер 6 мин с применением окрасок гематоксилин. Промыть в проточной водопроводной воды на 2 мин Dehydrate три раза за 2 мин в 200 мл 100% алкоголя. Очистите три раза в течение 2 минут каждый в 200 мл, ксилол или заменителя ксилола. Гора в среде на основе ксилол монтажа.
- Фотографию слайдов (по крайней мере десять полей при 40 кратном от межжелудочковой перегородки каждого сердца) и измерения плотности области Pecam-1, с использованием свободно доступных ImageJ программного обеспечения 31. Использовать цвет деконволюция 32 плагин для DAB и гематоксилином и Отрегулируйте контрастность изображения до того же уровня.
Примечание: В случае, если цвет коричневый и фиолетовый/синий спектральный пересекается, что может вызвать трудности с цветом Деконволюция, один можно попробовать различные марки гематоксилином решение получить четкие, светло голубой ядерной пятнать. Кроме того, может быть выполнена иммунофлюоресценции или ручной подсчет капилляров.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На рисунке 1представитель эхокардиографические записи продемонстрировать полезность эхокардиографии для выявления сердечной фенотипов генетически измененных мышей. Можно легко определить разницу между мышь с нормальной функции сердца (рис. 1A) и животного с пролабированием левого желудочка и снижение LV функции (рис. 1B). Рисунок 2 показывает сравнение cardiomyocyte измерения диаметра в животных без (рисунок 2A) и гипертрофии сердца (рис. 2B) с помощью гематоксилином эозином окрашенных парафин сердце секции и измерения продольные разделы ткани сердца. Рисунок 3 показывает измерение cardiomyocyte поперечной диаметров с использованием WGA-окрашенных парафиновых срезах от сердца управления мышей (Рисунок 3А) и животных с гипертрофии сердца (рис. 3B). На рисунке 4 изображена утилита иммуногистохимия Pecam-1 (DAB субстрата, коричневый окрашивание) сердечной секций для определения плотности судно нормальной сердечной ткани (Рисунок 4A) и сердца с повышенной ангиогенез (Рисунок 4B ).
Рисунок 1: Стандарт резолюции эхокардиография (> 10 МГц) мера LV систолический и диастолический размеры и функции сердца у мышей с пролабированием гипертрофии сердца после инфаркта миокарда против контроля животных.
Представитель эхокардиографические записи от нормальных, здоровых мышей (A) и животных с LV дилатация и снижение LV функции после инфаркта миокарда (Tie2-CreERT2; PPARβ/δ + тамоксифен мышей)5 (B). LVAW, LVID и LVPW указаны. Белые бары представляют систолического и диастолического точки измерения. Они соответствуют курсор точки для измерений и описаны в протоколе шаг 1.12. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Витражи гематоксилином эозином разделы для измерения диаметров cardiomyocyte в продольном направлении секционного клетки мышей с расширены сердечной гипертрофии и контроля животных. Представитель изображения cardiomyocyte диаметров в мышах с размерами обычных cardiomyocyte (A) и животных с повышенной cardiomyocyte размеров (Tie2-CreERT2; PPARβ/δ + тамоксифен мышей)5 (B). Черные линии указывают измеренных диаметров. Представлены значения для каждого измерения. Масштаб баров = 50 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: WGA-окрашенных разделы для измерения поперечного диаметра cardiomyocyte в разделах ткани сердца от мышей с пролабированием гипертрофии сердца против контроля животных. Представитель изображений для диаметров cardiomyocyte в мышей с нормальной cardiomyocyte размер (A) и животных с повышенной cardiomyocyte размеров (Tie2-CreERT2; PPARβ/δ + тамоксифен мышей)5 (B). Ядра были counterstained с DAPI. Белые линии указывают измеренных диаметров на уровне ядра (синий). Представлены значения для каждого измерения. Масштаб баров = 50 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: Pecam-1 полученных разделы для анализа сердца судно плотность контроля мышей и животных с повышенной ангиогенеза.
Представитель изображений для судна маркировки в мышах с нормальной сосудистой плотность (A) и животных с расширенной васкуляризации (Tie2-CreERT2; PPARβ/δ + тамоксифен мышей)5 (B). С применением окрасок гематоксилин были counterstained ядер. Стрелки указывают на Pecam-1-инфицированных судов. Масштаб баров = 50 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Различные методы были разработаны для оценки сердечной структуры и функции в мышей, в том числе эхокардиография, повысить контраст МРТ, микро КТ и ПЭТ-сканирование. Благодаря своей эффективности и простоте эхокардиографии является наиболее широко используемый метод для функционального анализа в11мышей. В общем, вследствие небольшого размера сердца и высокой частоты сердечных сокращений у мышей, преобразователи с частотой > 10 МГц должны быть использованы, хотя успешный измерения сообщалось с 8 или 9 МГц преобразователи4,7 . Как сердечная функция тесно связана с температуры тела и сердца частота, важно контролировать эти параметры на протяжении всего исследования. Поместив указатель мыши на грелку имеет важное значение для поддержания постоянной температуры тела наркотизированных животного. В идеале следует использовать контролируемые грелку с ректальный датчик для задания температуры тела до 38 ° C. Если это не доступно, электрогрелки должно быть присвоено два-три градуса выше этого значения. Отопление лампы следует избегать, поскольку они усложняют задачу для следователя и риск перегрева животных.
Для контроля частоты сердечных сокращений и сердечной функции, тип анестезии весьма важное значение. Большинство исследований использование изофлюрановая, как анестезия легко побудить при вдыхании в камеру всасывание (3% изофлюрановая), можно сохранить через вдыхание маска (1-2% изофлюрановая) и только от короткой продолжительности. Другие часто используемые вещества 2,2,2-tribromoethanol, Пентобарбитал и кетамин + Ксилазина смешивает11,12. Удивительно, изофлюрановая было сообщено на компромисс сердечной функции в эхокардиографические измерений, и этот эффект был еще более заметна в кетамин + Ксилазина группы11. Кетамин только работал лучше всего в этом исследовании11. Гао и др. сообщили наиболее воспроизводимые результаты с 2,2,2-tribromoethanol12. Результаты были в том же диапазоне для изофлюрановая, 2,2,2-tribromoethanol и Пентобарбитал12. Кроме того тарифы сердца не отличались в 2,2,2-tribromoethanol и Пентобарбитал группы12. Сердце et al. сообщили о более низких ставок сердца в кетамин + Ксилазина группы по сравнению с группой 2,2,2-tribromoethanol16. В наших экспериментах с использованием различных трансгенные мыши штаммов и Пентобарбитал анестезии, Средняя ЧСС, колеблется от 350 до 450 bpm. Тем не менее, фракции выброса были > 80%, что соответствует значениям в сознательных животных11. Эхокардиографические измерения под базовые условия от нашей лаборатории4,5,6 находятся в том же диапазоне, как сообщили других11,12,14 ,,1516,,1718,19,20,21,22,26 . В отличие от Пентобарбитал кетамин, изофлюрановая и 2,2,2-tribromoethanol характеризуется быстрым началом и восстановления. Таким образом сроки между анестезии и эхокардиографических измерений должно быть одинаковым для всех животных в исследовании, чтобы избежать различных степеней восстановления от анестезии. Пентобарбитал действует дольше, но имеет недостаток небольшого терапевтического окна, что делает необходимым скорректировать дозу плотно в том, что касается веса тела. Длинный длительный наркоз, используя Пентобарбитал имеет преимущество, что, после базовые измерения и эхокардиографических, хирургические процедуры могут быть выполнены без необходимости повторной инъекции5. Повторяющихся анестезии, используя Пентобарбитал следует избегать как в наш опыт, инъекции с интервалом менее одной недели привели к увеличению послеоперационная летальность.
При выполнении эхокардиография у мышей с > 10 МГц датчика, качество изображений должно быть достаточно для определения глобальных LV функции. Несколько изображений должны быть приняты для каждого животного уменьшить вариации бить и бить и артефакты движения. Экспертные консультации от подготовленных кардиолог или ученый с опытом работы в эхокардиографии у мышей следует просить в начале оценки качества изображений. Большинство машин эхокардиография вычислить EF от LV внутренних диаметров с использованием формулы11,Teicholz12. Даже когда LV размеры легко измерить, они предоставляют несовершенной оценки объемов LV и областей, так как LV не соответствует любой идеал, упрощенный геометрическую форму. Ни дробных укорочение ни отстрела фракции, полученные с формулой Teicholz — это идеальный параметр определить LV сократительной функции, поскольку они оба основаны на геометрических предположения и описать сократительную способность только две стены. Фракция изгнания, оценивать с помощью метода биплан Симпсон будет более точным, но это было невозможно получить в каждое животное с оборудование, используемое здесь.
После инфаркта миокарда мы столкнулись с несколько проблем, связанных с Эхокардиографические изображений. Во-первых качество изображения значительно затрудняется торакотомия шрам. Во-вторых животные были гораздо более чувствительны к неоднократные анестезии. Наконец основанные на M-режим LV объем и функции измерения предположить, что геометрия LV является однородной. Как следствие использование этих индексов становится более спорным присутствии LV стены движения аномалии после инфаркта миокарда.
В наших руках использование зондом 15-МГц допускается иногда, но не носит систематического характера, запись Doppler изображений. Определить региональные функции LV или для выполнения миокарда контраст эхокардиографии, которые могут быть получены только с оборудованием, посвященный грызунов12требуются гораздо более высоких частотах.
Учитывая дополнительные возможности и более высоким разрешением этих грызунов конкретных систем, следует учитывать их использования в будущем. Недостатки являются более высокие затраты и потребность выделенного пространства. Эти high-end, грызунов посвященный echocardiographs будет выгодно, только если достаточно животные находятся под следствием и критическое количество ученых использовать оборудование. С специальной подготовки, предлагаемых для этих машин, они может использоваться учеными, не эксперт в области кардиологии. Клинические эхокардиография оборудование обеспечивает ограниченное разрешение, как упоминалось выше. Тем не менее она до сих пор успешно используется в различных опытных ллабораторий,1112; могут быть легко использованы квалифицированных ученых и кардиологами; является более мобильным и менее требовательных на посвященный пространстве; и, из-за большого числа машин, позволяет для рассмотрения различных вариантов для снижения затрат (например, Аренда, получения оборудования, которое отсутствует в клинической практике или пассивное покупок).
Для гистологического анализа первая критическая точка является свести к минимуму время между орган изоляции и фиксации ткани. Как и этот протокол большинство окрашивание и гистологические анализы основаны на передаваемых световой микроскопии; погружение фиксации ткани сердца в formol является достаточным. Если в центре внимания проекта больше на окрашивание микроскопических флуоресценции, одно должно рассматривать перфузии фиксации наркотизированных животных для удаления красных кровяных клеток из ткани, которые показывают яркие авто флуоресценции.
Чтобы избежать вариации в парафин вложения, мы используем автоматизированный аппарат вложения. Как точка плавления и твердость отличаются между марками парафинов, мы рекомендуем использовать того же поставщика на протяжении всего исследования. Парафин секционирование должно выполняться предварительно охлажденные блоков, используя микротом роторный. В разделе толщина должна оставаться постоянной. 3-мкм толщина среза позволяет четкие визуализации границ мембраны в разделах гематоксилином эозином окрашенных сердца, который необходим для точного измерения диаметров cardiomyocyte. Как форма кардиомиоцитов нерегулярные, измерения должны выполняться на уровне ядра. WGA пятнать предоставляет альтернативный способ пятна клеточной мембраны и приведет к те же значения, что гематоксилином-эозином. До морфометрический анализ один следует четко определить, какая часть сердца (т.е., левого или правого желудочка свободный стены или перегородки) будет оцениваться и ли cardiomyocyte сечения определяются в длинной или короткой оси. Благодаря поперечной, спираль и продольной ориентации кардиомиоцитов, в самом сердце можно получить на том же поперечного сечения продольных и поперечных участков кардиомиоцитов. Ли измеряются продольного или поперечного диаметра вызывает Конвенции, до тех пор, как клетки анализируются на уровне ядра.
В наших исследованиях мы наблюдали соглашение между эхокардиографические размеры и соотношения массы сердца и тела и cardiomyocyte размеры4,5,6, но гистологические измерения размера cardiomyocyte не всегда соответствуют значениям фракция изгнания. Например осуществлять подготовку приводит к увеличению сердечной измерениях, с фракция изгнания сохранились и увеличение cardiomyocyte диаметров. Однако декомпенсированной сердечной недостаточности, характеризуется увеличение сердца размеры, с фракция изгнания уменьшение и увеличение cardiomyocyte диаметром33. Кроме того мы недавно показали, что увеличение сердца судно плотность благодаря эндотелиальной конкретных Сверхэкспрессия PPARβ не приведет в улучшение сердечной функции в исходных условиях, ни в расширенной восстановления после инфаркта миокарда5 .
Для иммуногистохимии важно, чтобы включить негативный контроль и выполнять различные блокировки шагов, предусмотренных в протоколе. Антиген демаскирующих шаг в протоколе специфичен для первичного антитела, используемые. Для различных первичных антител необходимо определить ли низкий или высокий рН демаскирующих буферов, привести к лучше сигнал. Фиксации различных методов может использоваться для обнаружения специфического антигена. Например Pecam-1 маркировки как сообщается лучше всего работают на фиксированной цинка, парафин врезанных тканей, в то время как же фиксация требуются дополнительные шаги для уменьшения фона для антител Тромбомодулин34. Таким образом мы используем регулярные формалин фиксации, что позволило расширить исследования в целый ряд различных антигенов. Альтернатива Pecam-1 иммуноокрашивания, isolectin B4 часто используется для визуализации сосудов. Помимо доли эндотелиальных клеток35isolectin B4 ярлыки также глии36 и макрофаги37. Кроме того различные антигены могут использоваться для различия между артериальной и венозной эндотелиальных клеток38. Элегантный способ, чтобы визуализировать функциональных увлажненную судов или определить судно прорастания или регрессии внутривенным введением флуоресценции в сочетании Лектин, затем анализ cryosections24. Однако этот подход во многом ограничивает возможности для выявления дополнительных антигены и выполнять анализ морфометрических из-за разного качества cryosections.
На immunostained участках, где сигнал визуализируется с DAB плотность области могут быть количественно определены использования свободно доступного программного обеспечения ImageJ. Однако как сигнал не является линейной, степень коричневой окраски не точно соответствуют уровню экспрессии белков.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Работа была поддержана правительством Франции (национального исследовательского агентства, НРУ) через программу «Инвестиции в будущее» LABEX SIGNALIFE (Справочник АНР-11-LABX-0028-01) и грантов на K. D. W. от Ассоциации налить sur la исследований le рака, Фонд-де-Франс и план рака Inserm. Д. б. и а. в. получили стипендии от Fondation pour la Recherche сообщала и из города Ниццы, соответственно. Echocardiograph и датчик были любезно предоставляемый Philips. Мы благодарим A. Borderie, S. Destree, M. Кутаджар-Bossert, A. Landouar, A. Мартр, A. Biancardini и S. м. Вагнер за их квалифицированную техническую помощь.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wheat germ agglutinin (WGA) conjugated tetramethylrhodamine | Life Technologies, Molecular Probes | W849 | |
| Biotinylated Goat Anti-Rabbit IgG Antibody | Vectorlabs | BA-1000 | |
| Avidin/Biotin Blocking Kit | Vectorlabs | SP-2001 | |
| VECTASTAIN Elite ABC HRP Kit (Peroxidase, Standard) | Vectorlabs | PK-6100 | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vectorlabs | H-1200 | |
| SIGMAFAST 3,3'-Diaminobenzidine tablets | Sigma | D4168 | |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma | H1009 | |
| Anti-Pecam-1 (CD31) antibody | Abcam | ab28364 | |
| Ultrasound transmission gel, Gel Aquasonic 100 | Parker | ||
| Linear ultrasound probe, L15-7io | Philips Healthcare | ||
| Echocardiograph, IE33 xMATRIX | Philips Healthcare | ||
| Microscope, Leica DMi8 | Leica | ||
| Fluorescence Filterset DAPI | Leica | 11525304 | |
| Filterset TxR | Leica | 11525310 | |
| Digital Camera, SPOT RT3 Color Slider | Spot Imaging | ||
| Imaging Software, SPOT 5.2 Advanced and Basic Software | Spot Imaging | ||
| Imaging Computer | Dell | ||
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| Large Scissors | Fine Science Tools | 14501-14 | |
| Scalpel blades | Fine Science Tools | 10023-00 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11650-10 | |
| Rodent shaver | Harvard Apparatus | 34-0243 | |
| cassettes for paraffin embedding | Sakura | 4155F | |
| neutral buffered Formalin | Sakura | 8727 | |
| Xylene | Sakura | 8733 | |
| Paraffine TEK III | Sakura | 4511 | |
| automated embedding apparatus, Tissue-Tek VIP | Sakura | 6032 | |
| paraffin-embedding station Tissue-Tek TEC 5 | Sakura | 5229 | |
| microtome blades,Accu-Edge S35 | Sakura | 4685 | |
| microscopy slides, Tissue-Tek | Sakura | 9533 | |
| cover slips, Tissue-Tek | Sakura | 9582 | |
| Mounting medium Tissue-Tek | Sakura | 1408 | |
| slide boxes | Sakura | 3958 | |
| eosine solution | Sakura | 8703 | |
| hematoxyline solution | Sakura | 8711 | |
| microtome, RM2125RT | Leica | 720-1880 (VWR) | |
| water bath, Leica HI1210 | Leica | 720-0113(VWR) | |
| Ethanol | VWR | ACRO444220050 | |
| 15 ml tubes | VWR | 734-0451 | |
| staining glass dish | VWR | MARI4220004 | |
| staining jars | VWR | MARI4200005 | |
| Incubator | Binder | 9010-0012 | |
| DAB and urea hydrogen peroxide tablets, SIGMAFAST 3,3′-Diaminobenzidine tablets | Sigma | D4293 | |
| PBS (10X) | Thermo Fisher Scientific | 70011044 |
References
- Ormandy, E. H., Dale, J., Griffin, G. Genetic engineering of animals: ethical issues, including welfare concerns. Can Vet J. 52 (5), 544-550 (2011).
- Karl, T., Pabst, R., von Hörsten, S. Behavioral phenotyping of mice in pharmacological and toxicological research. Exp Toxicol Pathol. 55 (1), 69-83 (2003).
- Phoon, C. K., Turnbull, D. H.
- Wagner, N., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor beta stimulation induces rapid cardiac growth and angiogenesis via direct activation of calcineurin. Cardiovasc Res. 83 (1), 61-71 (2009).
- Wagner, K. D., Vukolic, A., Baudouy, D., Michiels, J. F., Wagner, N. Inducible Conditional Vascular-Specific Overexpression of Peroxisome Proliferator-Activated Receptor Beta/Delta Leads to Rapid Cardiac Hypertrophy. PPAR Res. 2016, 7631085 (2016).
- Ghanbarian, H., et al. Dnmt2/Trdmt1 as Mediator of RNA Polymerase II Transcriptional Activity in Cardiac Growth. PLoS One. 11 (6), e0156953 (2016).
- Meguro, T., et al. Cyclosporine attenuates pressure-overload hypertrophy in mice while enhancing susceptibility to decompensation and heart failure. Circ Res. 84 (6), 735-740 (1999).
- de Araújo, C. C., et al. Regular and moderate aerobic training before allergic asthma induction reduces lung inflammation and remodeling. Scand J Med Sci Sports. 26 (11), 1360-1372 (2016).
- Benavides-Vallve, C., et al. New strategies for echocardiographic evaluation of left ventricular function in a mouse model of long-term myocardial infarction. PLoS One. 7 (7), e41691 (2012).
- Colazzo, F., et al. Murine left atrium and left atrial appendage structure and function: echocardiographic and morphologic evaluation. PLoS One. 10 (4), e0125541 (2015).
- Pachon, R. E., Scharf, B. A., Vatner, D. E., Vatner, S. F. Best anesthetics for assessing left ventricular systolic function by echocardiography in mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 308 (12), H1525-H1529 (2015).
- Gao, S., Ho, D., Vatner, D. E., Vatner, S. F.
- Mor-Avi, V., et al. Current and evolving echocardiographic techniques for the quantitative evaluation of cardiac mechanics: ASE/EAE consensus statement on methodology and indications endorsed by the Japanese Society of Echocardiography. J Am Soc Echocardiogr. 24 (3), 277-313 (2011).
- Collins, K. A., Korcarz, C. E., Lang, R. M. Use of echocardiography for the phenotypic assessment of genetically altered mice. Physiol Genomics. 13 (3), 227-239 (2003).
- Rottman, J. N., Ni, G., Brown, M. Echocardiographic evaluation of ventricular function in mice. Echocardiography. 24 (1), 83-89 (2007).
- Hart, C. Y., Burnett, J. C., Redfield, M. M. Effects of avertin versus xylazine-ketamine anesthesia on cardiac function in normal mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 281 (5), H1938-H1945 (2001).
- Moran, C. M., Thomson, A. J., Rog-Zielinska, E., Gray, G. A. High-resolution echocardiography in the assessment of cardiac physiology and disease in preclinical models. Exp Physiol. 98 (3), 629-644 (2013).
- Fayssoil, A., Tournoux, F. Analyzing left ventricular function in mice with Doppler echocardiography. Heart Fail Rev. 18 (4), 511-516 (2013).
- Schoensiegel, F., et al. High throughput echocardiography in conscious mice: training and primary screens. Ultraschall Med. 32, Suppl 1. S124-S129 (2011).
- Yariswamy, M., et al. Cardiac-restricted Overexpression of TRAF3 Interacting Protein 2 (TRAF3IP2) Results in Spontaneous Development of Myocardial Hypertrophy, Fibrosis, and Dysfunction. J Biol Chem. 291 (37), 19425-19436 (2016).
- Jara, A., et al. Cardiac-Specific Disruption of GH Receptor Alters Glucose Homeostasis While Maintaining Normal Cardiac Performance in Adult Male Mice. Endocrinology. 157 (5), 1929-1941 (2016).
- Kerr, B. A., et al. Stability and function of adult vasculature is sustained by Akt/Jagged1 signalling axis in endothelium. Nat Commun. 7, 10960 (2016).
- Wagner, N., et al. Coronary vessel development requires activation of the TrkB neurotrophin receptor by the Wilms' tumor transcription factor Wt1. Genes Dev. 19 (21), 2631-2642 (2005).
- Wagner, K. D., et al. The Wilms' tumour suppressor Wt1 is a major regulator of tumour angiogenesis and progression. Nat Commun. 5, 5852 (2014).
- Yang, X. P., et al. Echocardiographic assessment of cardiac function in conscious and anesthetized mice. Am J Physiol. 277 (5 Pt 2), H1967-H1974 (1999).
- Rottman, J. N., et al. Temporal changes in ventricular function assessed echocardiographically in conscious and anesthetized mice. J Am Soc Echocardiogr. 16 (11), 1150-1157 (2003).
- Quiñones, M. A., et al. Recommendations for quantification of Doppler echocardiography: a report from the Doppler Quantification Task Force of the Nomenclature and Standards Committee of the American Society of Echocardiography. J Am Soc Echocardiogr. 15 (2), 167-184 (2002).
- van Laake, L. W., et al. Monitoring of cell therapy and assessment of cardiac function using magnetic resonance imaging in a mouse model of myocardial infarction. Nat Protoc. 2 (10), 2551-2567 (2007).
- Wagner, K. D., et al. The Wilms' tumor suppressor Wt1 is expressed in the coronary vasculature after myocardial infarction. FASEB J. 16 (9), 1117-1119 (2002).
- Wagner, K. D., et al. RNA induction and inheritance of epigenetic cardiac hypertrophy in the mouse. Dev Cell. 14 (6), 962-969 (2008).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Ruifrok, A. C., Johnston, D. A. Quantification of histochemical staining by color deconvolution. Anal Quant Cytol Histol. 23 (4), 291-299 (2001).
- Lazzeroni, D., Rimoldi, O., Camici, P. G. From Left Ventricular Hypertrophy to Dysfunction and Failure. Circ J. 80 (3), 555-564 (2016).
- Ismail, J. A., et al.
- Benton, R. L., Maddie, M. A., Minnillo, D. R., Hagg, T., Whittemore, S. R. Griffonia simplicifolia isolectin B4 identifies a specific subpopulation of angiogenic blood vessels following contusive spinal cord injury in the adult mouse. J Comp Neurol. 507 (1), 1031-1052 (2008).
- Ayoub, A. E., Salm, A. K. Increased morphological diversity of microglia in the activated hypothalamic supraoptic nucleus. J Neurosci. 23 (21), 7759-7766 (2003).
- Maddox, D. E., Shibata, S., Goldstein, I. J. Stimulated macrophages express a new glycoprotein receptor reactive with Griffonia simplicifolia I-B4 isolectin. Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (1), 166-170 (1982).
- dela Paz, N. G., D'Amore, P. A. Arterial versus venous endothelial cells. Cell Tissue Res. 335 (1), 5-16 (2009).
