دراسة مورفولوجيا القلب مشخصين وغذائها في الماوس

Summary

كثيرا ما يستخدم الفحص مشخصين في الفئران. وقد وضعت أجهزة الموجات فوق الصوتية ذات الدقة العالية باهظة الثمن لهذا الغرض. ويصف هذا البروتوكول إجراء مشخصين بأسعار معقولة جنبا إلى جنب مع تحليل شكلي نسيجية لتحديد مورفولوجيا القلب.

Abstract

عدد متزايد من نماذج الماوس المعدلة وراثيا قد أصبحت متاحة في السنوات الأخيرة. وعلاوة على ذلك، العدد الدراسات الدوائية في الفئران مرتفع. توصيف المظهرية من هذه النماذج الماوس يتطلب أيضا دراسة وظيفة القلب ومورفولوجيا. تخطيط صدى القلب، والتصوير بالرنين المغناطيسي (التصوير بالرنين المغناطيسي) هي الأساليب المستخدمة شيوعاً لتوصيف وظيفة القلب ومورفولوجيا في الفئران. مشخصين والتصوير بالرنين المغناطيسي المعدات المتخصصة لاستخدامها في القوارض الصغيرة مكلفة وتتطلب مساحة مخصصة. ويصف هذا البروتوكول قياسات القلب في الفئران باستخدام نظام مشخصين سريرية مع تحقيق الأوعية الدموية بشرية 15 ميغاهيرتز. وتجري القياسات على تخديره من الفئران الكبار. ثلاثة على الأقل من تسلسل الصور وتسجل وتحليلها لكل الحيوانات في وضع M في عرض قصير-محور باراستيرنال. بعد ذلك، يتم إجراء الفحص النسيجي القلب، ويتم تحديد أقطار كارديوميوسيتي على الهيماتوكسيلين-agglutinin ويوزين-أو جنين القمح (WGA)-الملون مقاطع البارافين. وتبلغ كثافة السفينة مورفوميتريكالي العزم بعد إيمونوستينينج بيكم-1. البروتوكول قد تم تطبيقها بنجاح على الدراسات الدوائية ومختلفة الوراثية الحيوانية نماذج تحت ظروف خط الأساس، وكذلك بعد تجريبي احتشاء عضلة القلب بربط دائم (الشريان التاجي تنازلي الأمامي الأيسر الفتى). في تجربتنا، مشخصين التحقيق يقتصر على الحيوانات تخديره وعملياً في الفئران الكبار وزنها على الأقل 25 غراما.

Introduction

وتتوفر مجموعة كبيرة ومتنوعة من نماذج الماوس المعدلة وراثيا، وعدد الدراسات الدوائية في الفئران عالية^1،2. تخطيط صدى القلب، والتصوير بالرنين المغناطيسي هي النهج الشائع استخدامها لتوصيف وظيفة القلب ومورفولوجيا في هذه النماذج الماوس³المظهرية. وهدف البروتوكول المقدم تحليل وظيفة القلب ومورفولوجيا في الفئران الكبار. فهو يجمع بين مشخصين، النسيجي، وقياسات المناعي. فحص مشخصين يستخدم على نطاق واسع في الفئران^4،5،،من^67،،من^{89،10،11، 12}. باشون et al. وحدد ¹¹ 205 الدراسات المنشورة في تداولو تعميم البحوثو المجلة الأمريكية الفسيولوجيا-القلب والدورة الدموية علم وظائف الأعضاءو أبحاث القلب والأوعية الدموية بين 2012 و 2015 أن ويستخدم فحص مشخصين في الحيوانات.

يتم استخدام تخطيط صدى القلب لتعريف تعمل القلب في الفئران المعدلة وراثيا^5،6،،من^1314،،من^{1516، 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22}، فضلا عن تحليل وظيفة القلب في تضخم المزمنة الناجمة عن الحمل الزائد، واحتشاء عضلة القلب الاسكيمية، ونماذج اعتلال عضلة القلب في الفئران (استعرض في¹²). تسمح معدات تحسين تخطيط صدى القلب لهذا الإجراء القياسي البطين الأيسر (LV) الانقباضي والانبساطي الأبعاد وتصوير دوبلر الأنسجة، شعاعية التباين احتشاء عضلة القلب، وتقييم وظيفة LV الإقليمية ومحمية التاجي ¹²-ومن الناحية المثالية، ينبغي إجراء دراسة مشخصين في الفئران واعية لتجنب الآثار السلبية للتخدير في تقلص وظيفة، مراقبة المنعكس اللاإرادي، ومعدل القلب¹¹. ومع ذلك، يقتصر هذا النهج بشرط لتدريب الحيوانات؛ صعوبات في الحفاظ على درجة حرارة الجسم ثابتة؛ التحف الحركة؛ الإجهاد؛ ترددات عالية جداً في القلب؛ والحاجة إلى مالا يقل عن اثنين من المحققين لإجراء التجربة، لا سيما إذا كان يجري التحقيق في عدد كبير من الحيوانات. من المثير للاهتمام، أفادت دراسة أجريت مؤخرا لا توجد فروقات في معلمات مشخصين في الحيوانات المدربة وغير المدربة¹⁹. ونحن أداء قياسات مشخصين في تخديره من الفئران. التخدير مختلف البروتوكولات ستناقش أدناه.

على الرغم من أن الدقة القياسية تخطيط صدى القلب (> 10 ميجاهرتز) هي كافية لتدبير LV الانقباضية وأبعاد االنقباضي ووظيفة القلب في الفئران الكبار، الطريقة محدودة في وصف الظواهر الهيكلية الكامنة وراء. وهكذا، أن نجمع بين القياسات في فيفو مع غذائها وتحاليل إيمونوهيستولوجيكال لقياس الكثافة القطر والسفينة كارديوميوسيتي، على سبيل المثال،. يمكن أيضا إجراء التحقيقات غذائها وإيمونوهيستولوجيكال الأخرى، مثل تحديد انتشار الأسلحة، ودراسة المبرمج، قياسات حجم احتشاء، تحديد التليف، والتعبير علامة محددة، على نفس النوع من معالجة الأنسجة ولكنها ليست موضوع هذا البروتوكول. ويوفر خليط في فيفو الفحص مشخصين بتحليلات النسيجي أفكاراً إضافية في التعديلات الهيكلية الكامنة. في خطوة إضافية، يمكن أن نكمل هذه القياسات مع التحقيقات الجزيئية وهيكلية فائقة. تحاليل نسيجية لا إكمال دراسة مشخصين بل أيضا أصبحت لا غنى عنها عندما حل ضربات القلب غير كافية. وهذا هو الحال خاصة في نماذج الفئران المعدلة وراثيا التي هي قاتلة الجنينية^23،24.

Protocol

أجريت التجارب الموضحة هنا امتثالا للقوانين ذات الصلة المؤسسية والفرنسية رعاية الحيوان، والمبادئ التوجيهية، والسياسات. أقرتها لجنة الأخلاقيات الفرنسية (لجنة إينستيتوتيونيل د ' ل صب واﻷخﻻق ' مختبر دي الحيوان؛ وعدد مرشحي/2012-106).

1-تخطيط صدى القلب

1. تحديد وزن الجسم من الماوس باستخدام توازن مختبر قياسية أثناء الضغط عليه خفيفا من ذيله لضمان تحديد المواقع المناسبة.
2. تخدير الحيوان عن طريق الحقن داخل (القائمة) 50 مغ/كغ بينتوباربيتال ^، من ²⁵ إلى ²⁶-
   ملاحظة: يمكن استخدام أي نوع آخر من التخدير إذا تم استخدام البروتوكول نفسه طوال فترة الدراسة. مزايا وعيوب ستناقش أدناه.
3. ضع الماوس مرة أخرى في قفص والانتظار حتى أنها لا تستجيب، فإنه يظهر التنفس المطرد، وردود الفعل القدم الخلفية غائبة. لاختبار هذا، الضغط على أقدام قليلاً ومراقبة ما إذا كانت الساق لا تزال تتراجع.
4. يحلق في الجانب الأيسر من الصدر والابط الأيسر استخدام آلة حلاقة القوارض تجارية-
   ملاحظة: يسمح استخدام آلة الحلاقة القوارض مكرسة للإزالة الكاملة للماوس غرامة الشعر لتجنب التدخل في قياس مشخصين. وينبغي تجنب كريمات إزالة الشعر التجارية أو الحلول، كما أنها هي عادة المعطر، التي سوف تخل بالحيوان بعد أن يوقظ. تجنب الحلاقة المفرط، كما أنه يزيد من فقدان الحرارة.
5. وضع الحيوان النوم على وسادة دافئة تعيين إلى 40-42 درجة مئوية في موقف اليسار من جانب ضحلة، مع الرأس في 12 س ' على مدار الساعة والذيل في 6 س ' على مدار الساعة. إصلاح الذراع اليسرى والساق اليسرى، والذيل مع الشريط.
6. تطبيق استعد قبل جل تخطيط صدى القلب على صدره حلق ورأس محول.
ضع
7. محول اليسار parasternal، توجيهها إلى الجانب الأيمن من العنق للحصول على نظرة طويلة-محور parasternal ثنائي الأبعاد (2D) على مستوى العضلات الحليمية. تشغيل محول 90° باتجاه عقارب الساعة للحصول على طريقة عرض المحور قصيرة على مستوى العضلات بابيلاري. استخدام إعداد الحد أدنى من عمق وتكبير لتكبير صورة الجودة ومعدل الإطارات. تعيين سرعة الاجتياح إلى أقصى حد- ويمكن استخدام
   1. للحصول على هذه الإعدادات وتكبير مختلفة وعمق إعداد خيارات، اعتماداً على الجهاز والبرامج. عرض سجل تسترشد في 2D M-وضع الصور في محور قصيرة- ²⁷. الرجوع إلى الشكل 1 ألف و ب ²⁷-
      ملاحظة: العناية لتجنب الضغط المفرط في الصدر، وهذا قد يسبب بطء القلب-
8. سجل على الأقل 3 سلسلة من 3 حلقات سينمائية فاز القلب لكل الحيوانات.
   ملاحظة: للحصول على اتشوكارديوجراف البرمجيات المستخدمة في هذه الدراسة، اضغط " اكتساب/حفظ " الزر مرة واحدة فقط. هذه المنهجية محددة إلى اتشوكارديوجراف مع هذا البرنامج بالذات. يمكن استخدام حزم البرامج الأخرى مع مختلف الآلات.
9. بعد جل نجاح التسجيلات، مسح قبالة تخطيط صدى القلب من القفص الصدري الماوس، ولوحة تدفئة، ومحول طاقة. قم بإزالة الشريط من أطرافه والذيل.
10. اترك الماوس تحت الملاحظة على لوحة تدفئة، مغطاة بأنسجة لتجنب لا لزوم لها فقدان الحرارة والتعرض الخفيفة، حتى أنه يستيقظ المكياج.
11. وضع الحيوان مرة أخرى في قفصة.
وسجلت
12. تحليل M-وضع الصور من عرض المحور قصيرة parasternal لتحديد الأبعاد (LV) البطين الأيسر ووظيفته. قياس سمك الجدار الأمامي LV في االنقباض واالنبساط (لفاوس ولفاود)، وفي LV الداخلية نهاية الانقباضي والانبساطي نهاية الأقطار (لفيدس ولفيد) وسمك الجدار الخلفي LV (لفبو) في االنقباض واستخدام االنبساط (لفبوس ولفبود) تحديد واجهة الأنسجة الدموية على الصور المخزنة.
قياس الأبعاد االنبساطي الأبعاد االنبساطي LV الظاهر القصوى في الوقت
13. والوقف أبعاد نهاية الانقباضية في وقت الرحلة الانقباضية الأمامي أكثر من الجدار الخلفي LV. على الاستفادة اللمس " تحليل " رمز ثم في " لفاود " رمز. الموقف قدمه ذات الورنيّة الإلكترونية المتعلقة بالعلاقة بين تجويف البطين الأيمن والجدار الأمامي LV في االنبساط.
14. الموقف قدمه ذات الورنيّة الإلكترونية المتعلقة بالعلاقة بين الجدار الأمامي LV وتجويف LV للحصول على سمك الجدار الأمامي االنبساطي LV؛ والبرنامج ستتحول مباشرة إلى قياس نهاية الانبساطي داخلية LV.
15. الموقف قدمه ذات الورنيّة على الواجهة بين تجويف LV و LV الجدار الخلفي للحصول على قطر LV نهاية الانبساطي الداخلية؛ والبرنامج يقوم بالتبديل إلى قياس سمك الجدار الخلفي LV.
ضع
16. قدمه ذات الورنيّة في الواجهة بين الجدار الخلفي LV وتامور للحصول على سمك الجدار الخلفي االنبساطي LV. لإبعاد الانقباضية LV، اضغط على الشاشة تعمل باللمس في " لفاوس " الرمز والموقف قدمه ذات الورنيّة الإلكترونية المتعلقة بالعلاقة بين تجويف البطين الأيمن والجدار الأمامي LV في االنقباض.
17. الموقف قدمه ذات الورنيّة الإلكترونية المتعلقة بالعلاقة بين الجدار الأمامي LV وتجويف LV للحصول على سمك الجدار الأمامي الانقباضية LV. كرر هذه العملية كما هو موضح أعلاه لقطر نهاية الانقباضية داخلية LV وسمك الجدار الخلفي الانقباضية LV. استخدام الاتفاقية الرائدة التي اعتمدت "المجتمع الأمريكي من تخطيط صدى القلب" لتتبع حدود للوفلر وابيكارديال ^{13 ، 27}-
    ملاحظة: معلمات الدالة الهوس LV سيتم تلقائياً حساب باستخدام القياسات السابقة. يعرف LV كسرى تقصير (خ) خ (%) = [(LVIDd-LVIDs)/لفيد] x 100. ويحسب كسر قذفي LV (الإنكليزية والفرنسية) مع تعديل الصيغة تيتشولز، حيث EF (%) = [(LVIDd³-LVIDs³)/لفيد ³] x 100 ¹². يشير إلى الرقم 1 أ وب.
18. تخزين البيانات على أقراص مدمجة أو ذاكرة USB العصي وعمل نسخ احتياطية-
19. الاستيراد، تحليل، وتصدير البيانات باستخدام البرنامج المناسب.
    ملاحظة: بعد القياسات خط الأساس، وهذه التجربة يمكن أن يكون مؤقتاً. إذا كان إجراء مقارنة مباشرة بين الحيوانات بالضربة القاضية والبرية من نوع ليتيرماتيس، المضي قدما في تحليلات النسيجي ⁶. للعرقية-ERT2؛ خطوط الماوس لوكس/لوكس، تواصل في اليوم التالي مع تاموكسيفين التعريفي بالحقن القائمة، ك وصف ^{5 ، 24}. إذا كان حمل تجريبي احتشاء عضلة القلب بعملية ربط الشريان التاجي الأيسر ^{5 ، 28}، يمكن إجراء الجراحة مباشرة بعد القياسات مشخصين، عند الفئران يتم تحت التخدير. خلاف ذلك، ينبغي الإبقاء على تأخير الحد أدنى من أسبوع واحد بين جولتين من التخدير الحد من معدل الفتك بعد العمليات الجراحية-

2. إعداد "عينات القلب" "التقييم النسيجي"

1. التضحية الحيوانات بخلع عنق الرحم. قياس أوزانها الجسم. تطهير الصدر والبطن باستخدام مسحه كحول 70%.
إجراء
2. على شق عرضية في الجلد 1 سم القاصي على القص. استخدام الملقط حادة، إزالة الجلد من الصدر، تتحرك في اتجاه الرأس. إجراء القص طفيفة مع الملقط الجميلة وفتح الحجاب الحاجز عن طريق إدراج نهاية حادة مقص جيد-
3. قص القفص الصدري على الجانبين موازية للقص. نقل القص في اتجاه الرأس. قم بتحديد موقع القلب في الصدر. عقد جذع القلب والأوعية الدموية مع الملقط الجميلة وقطع أدناه باستخدام مقص جيد-
4. فتح الصدر والمكوس قلب كامل خارج الصدر وقياس وزن القلب وإقامة وزن القلب للجسم نسبة ^{4 ، ،} من ^{5 6 ، 23 ، 29 ، 30 .}
°
5. إصلاح القلب في 2 مل من محلول فورمالين 10% مخزنة محايدة في أنابيب 15 مل بين عشية وضحاها في 4 جيم
   تحذير: خطر! ويجب أن يتم العمل مع حلول الفورمالين في غطاء الأبخرة كيميائية؛ ارتداء قفازات ونظارات السلامة.
   ملاحظة: كما يختلف تكوين المخزن المؤقت للحلول الفورمالين مع مختلف الموردين، استخدام المورد نفسه طوال فترة الدراسة-
6. في اليوم التالي، قطع القلوب في الطائرة عرضية، في الوسط، وتحويلها إلى أشرطة الكاسيت لتضمين البارافين، التي تتم في مختبر علم الأمراض باستخدام جهاز تضمين الآلي.
7. أداء تمزيقها.
   1. كتل البارافين القسم في سمك 3 ميكرومتر باستخدام مبضع وتعويم لهم في ماء 40 درجة مئوية حمام يحتوي على ماء مقطر.
   2. نقل المقاطع على الشرائح. تسمح أن الشرائح الجافة بين عشية وضحاها في حاضنة 37 درجة مئوية وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى جاهزة للاستخدام-
      ملاحظة: البروتوكول يمكن أن يكون مؤقتاً هنا حتى المستخدم على استعداد لتلطيخ (الخطوة 3)-
8. ديبارافينيزي وترطيب الأنسجة الشرائح.
   1. بوضع الشرائح في تلطيخ الجرار مع إدراج الزجاج في فرن 55 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة تذوب في البارافين.
   ديبارافينيزي الشرائح في اثنين من التغييرات من 200 مل زيلين نفط أو زيلين نفط بديل لمدة 5 دقائق في كل من
   2. -
      تنبيه: شديدة الاشتعال والسمية! العمل في غطاء الأبخرة كيميائية؛ ارتداء قفازات ونظارات السلامة.
   3. نقل الشرائح إلى 200 مل كحول 100%. إجراء تغييرات اثنين لمدة 3 دقائق ونقل مرة واحدة من خلال 200 مل كحول 95% للحد الأدنى 3
      تنبيه: الاشتعال! ابق بعيداً عن مصادر الاشتعال؛ لا التدخين.
   4. شطف مرتين في 200 مل من الفوسفات مخزنة المحلول الملحي (PBS) لمدة 5 دقائق وتابع مع الخطوة 3 أو 4 أو 5-

3. توضع وتلطيخ ويوزين

1. شطف الشرائح مع الأجزاء في الماء المقطر.
2. وصمة عار الأنوية مع الحل توضع للدقيقة 8
3. شطف في إدارة مياه الحنفية للحد الأدنى 10
4. وصمة عار مع الحل ثم للحد الأدنى 2
5. ديهيدراتي ثلاث مرات لمدة 2 دقيقة في الإيثانول 100% (EtOH). مسح ثلاث مرات لمدة 2 دقيقة في زيلين نفط أو بديل زيلين نفط. جبل في وسط تصاعد المستندة إلى زيلين نفط.
تصوير الشرائح
6. وقياس قطر كارديوميوسيتي على مستوى النواة في أقسام طولية من حاجز إينتيرفينتريكولار. قياس الخلايا على الأقل 100 كل قسم وثلاثة أقسام للقلب-

4. تلوين وغ

1. احتضان الشرائح التي تم الحصول عليها من الخطوة 2.7 مع تيتراميثيلرهوداميني (أو الأصباغ الفلورية الأخرى)-مترافق وغ (1: 100 في برنامج تلفزيوني) لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في غرفة رطبة.
2. يغسل ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق-
3. جبل مع الأسفار تصاعد الوسائط التي تحتوي على DAPI. مخزن في 4 درجات مئوية في الظلام قبل التحليل-
   تنبيه: ارتداء العين حماية وقفازات مقاومة للمواد الكيميائية متوافقة.
4. صورة الشرائح.
   1. استخدام مجهر مزودة ببرنامج التحصين الموسع-الإضاءة الفلورية وتصفية مجموعات DAPI وتيتراميثيلرهوداميني (الرجوع إلى الجدول للمواد). تعيين الفتحة إلى الحد الأقصى، وسطوع للتعرض للسيارات-
   فصل
   2. الحصول على الصور في 400 x التكبير لقنوات الأحمر والأزرق. فتح الصور في إيماجيج. ضبط السطوع والتباين إذا لزم الأمر (صورة > ضبط > سطوع/تباين).
   3. تعيين كل صورة إلى 8-بت (صورة > نوع > 8 بت). تراكب الصور DAPI ووغ. استخدام القناة الزرقاء DAPI والقناة الحمراء وغ؛ تعيين قنوات الأخضر والرمادي بلا (صورة > لون > دمج القنوات) ³¹-
5. تحديد أقطار كارديوميوسيتي على مستوى النواة في مقاطع عرضية من حاجز إينتيرفينتريكولار.
   1. تعريف حجم الصور في إيماجيج. ولهذا الغرض، تصوير كائن معروفة الحجم (مثلاً، دائرة هيموسيتوميتير في التكبير نفسه كأقسام القلب؛ الخطوة 4.4).
   2. استخدام أداة الخط المستقيم لرسم خط من البداية إلى النهاية لهيكل المعروفة (تحليل > تعيين مقياس).
      ملاحظة: سيتم عرض المسافة بالبكسل تلقائياً؛ وسيكون وحدة من طول المسافة المعروفة وإدخالها. المضي قدما مع القياسات كارديوميوسيتي على مستوى النواة-
   3. رسم خط مستقيم من الغشاء وغ الإيجابية من خلال نواة DAPI الإيجابية للموقع الآخر من غشاء الخلية وغ-إيجابية (تحليل > التدبير). في الإطار "نتائج"، تأكد من وجود قيم طول عدد هادفة المواضع العشرية (تحليل > تعيين قياسات > العشرية).
   4. قياس الخلايا على الأقل 100 كل قسم وثلاثة أقسام للقلب. تصدير النتائج إلى Excel (انقر على نتائج > ملف > حفظ ك >.csv) ^{6 ، 31}-

5. بيكم-1 "إيمونوستينينج"

1. أداء مستضد فضحه.
   1. مل 1,600 إضافة سترات الصوديوم العازلة (سترات الصوديوم 10 ملم، 0.05% 20 توين، pH 6.0) إلى طنجرة الضغط. وضع طنجرة ضغط على هوتبلت وتشغيله على طاقة كاملة. لا تقوم بتأمين غطاء طنجرة ضغط في هذه المرحلة؛ ببساطة ضعه في الأعلى-
      تنبيه: ساخنة!
   2. حالما يغلي المخزن المؤقت سترات الصوديوم، نقل الشرائح من الخطوة 2، 5 إلى طنجرة ضغط. تأمين غطاء طنجرة الضغط. بمجرد أن وصلت طنجرة الضغط الكامل، انتظر دقيقة 7. عندما انقضت دقيقة 7، إيقاف هوتبلت ومكان طنجرة ضغط في المصارف فارغة. تفعيل صمام الإفراج عن الضغط وتشغيل المياه الباردة على موقد. بمجرد أنه قد رفع الضغط، فتح الغطاء وتشغيل المياه الباردة في الطبخ لدقيقة 5 مكان الشرائح في 200 مل من برنامج تلفزيوني.
      ملاحظة: بدلاً من ذلك، فضحه مستضد ميكروويف يمكن استخدامها، على الرغم من أن يزداد خطر الانهاك.
2. استخدام 0.3% فوق أكسيد الهيدروجين في الميثانول إلى كتلة نشاط البيروكسيديز الذاتية للحد الأدنى 5 شطف الشرائح لثلاث مرات لمدة 2 دقيقة كل في 200 مل من برنامج تلفزيوني.
   تنبيه: القابلة للاشتعال والسامة!
3. احتضان الشرائح لمدة 15 دقيقة في المخفف العادي حظر المصل (5% مصل الماعز العادي في برنامج تلفزيوني) يحتوي أيضا على كتلة avidin (4 قطرات في 1 مل)-
4. الاستفادة من السائل من الفروع واحتضانها لهم مع جسم بيكام-1 من الأرانب، وتضعف 01:50 في برنامج تلفزيوني المحتوية على مصل الماعز العادي 2.5% و 4 قطرات من كتلة البيوتين كل مل بعناية. احتضان الشرائح بين عشية وضحاها في دائرة رطبة في 4 ° C.
5. يغسل ثلاث مرات لمدة 5 دقائق في كل الشرائح في 200 مل من برنامج تلفزيوني. احتضان الفروع مع بيوتينيلاتيد الماعز الأرنب المضادة مفتش جسم المخفف 1: 200 في برنامج تلفزيوني المحتوية على مصل الماعز العادي 2.5% ح 1 في درجة حرارة الغرفة. تغسل ثلاث مرات لمدة 5 دقائق في كل الشرائح في 200 مل من برنامج تلفزيوني.
6. احتضان tالأقسام أنه مع وجود نظام البيروكسيديز avidin/البيوتين القائم لمدة 20 دقيقة (A كاشف وكاشف ب الحاجة إلى أن تكون مجتمعة 30 دقيقة مسبقة لاستخدام). تغسل ثلاث مرات لمدة 5 دقائق في كل الشرائح في 200 مل من برنامج تلفزيوني.
حل
7. 1 3,3 '-ديامينوبينزيديني (DAB) وفوق أكسيد الهيدروجين اليوريا 1 قرص في 5 مل الماء المقطر مزدوجة. احتضان الفروع مع الحل الدأب لحوالي 3 دقيقة، رصد التنمية اللون بعناية. وقف رد الفعل اللون بلطف الغسيل الشرائح في 200 مل من برنامج تلفزيوني.
   تنبيه: مسببة للسرطان؛ ارتداء القفازات المقاومة للمواد الكيميائية!
8. كونتيرستين الأنوية لمدة 6 دقائق مع الهيماتوكسيلين. شطف في إدارة مياه الحنفية للحد الأدنى 2 ديهيدراتي ثلاث مرات لكل 2 دقيقة في 200 مل كحول 100%. قم بمسح كل 200 مل في زيلين نفط أو بديلاً زيلين نفط ثلاث مرات لمدة 2 دقيقة. جبل في وسط تصاعد المستندة إلى زيلين نفط.
9. تصوير الشرائح (على الأقل عشرة حقول في التكبير 40 x من حاجز إينتيرفينتريكولار من كل قلب) وقياس كثافة منطقة بيكم-1 استخدام البرمجيات ImageJ متاحة بحرية ³¹. استخدام لون deconvolution ³² المساعد للبث الإذاعي الرقمي وتوضع وضبط تباين الصورة على نفس المستوى-
   ملاحظة: في حالة اللون البنى والأرجواني/الأزرق التداخل الطيفي الكبير، الذي قد يسبب صعوبات مع deconvolution اللون، واحد يمكن أن تحاول ماركات مختلفة توضع حل للحصول على تلطيخ النووية واضحة وأزرق فاتح. وبدلاً من ذلك، يمكن أن يقوم الفلورة أو العد اليدوي من الشعيرات الدموية.

Representative Results

في الشكل 1، تثبت تسجيلات مشخصين الممثل فائدة تخطيط صدى القلب لتحديد تعمل القلب في الفئران المعدلة وراثيا. يمكن بسهولة التعرف على الفرق بين ماوس مع وظيفة القلب العادي (الشكل 1A) وحيوان مع البطين الأيسر المتوسعة وانخفاض وظيفة LV (الشكل 1B). ويبين الشكل 2 مقارنة كارديوميوسيتي قياسات القطر في الحيوانات دون (الشكل 2A) ومع تضخم القلب (الشكل 2) استخدام البارافين الهيماتوكسيلين ويوزين-ملطخة بقلب المقاطع وقياسات مقاطع طولية لانسجة القلب. يوضح الشكل 3 قياس أقطار عرضية كارديوميوسيتي استخدام مقاطع البارافين وغ الملون من قلوب لمراقبة الحيوانات مع تضخم القلب (الشكل 3B) والفئران (الشكل 3A). ويصور الشكل 4 فائدة immunohistochemistry بيكام-1 (DAB تلطيخ الركازة، براون) من أقسام القلب لتحديد كثافة السفينة من أنسجة القلب العادي (الشكل 4A) وقلوبنا مع زيادة الأوعية (الشكل 4B ).

الشكل 1: الدقة القياسية تخطيط صدى القلب (> 10 ميجاهرتز) لإبعاد مقياس LV الانقباضي والانبساطي ووظيفة القلب في الفئران مع تضخم القلب المتوسعة بعد احتشاء عضلة القلب مقابل مراقبة الحيوانات.
تسجيلات مشخصين الممثل من الفئران العادية وصحية (A) والحيوانات مع تمدد LV وانخفاض وظيفة LV بعد احتشاء عضلة القلب (Tie2-CreERT2؛ PPARβ/δ + تاموكسيفين الفئران)⁵ (ب). كما يرد لفاو ولفيد، ولفبو. تمثل أشرطة بيضاء الانقباضي والانبساطي قياس النقاط. أنها تتوافق مع المؤشر النقاط المحددة للقياسات وموضحة في الخطوة 1، 12 من البروتوكول. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

رقم 2: الهيماتوكسيلين ويوزين-ملطخة بأقسام لقياس أقطار كارديوميوسيتي في خلايا مقطعة طوليا من الفئران مع متسعة القلب تضخم ومراقبة الحيوانات. صور الممثل من أقطار كارديوميوسيتي في الفئران مع أحجام كارديوميوسيتي العادي (A) والحيوانات مع كارديوميوسيتي زيادة أحجام (Tie2-CreERT2؛ PPARβ/δ + تاموكسيفين الفئران)⁵ (ب). خطوط سوداء تشير إلى أقطار المقاسة. يتم تمثيل القيم لكل قياس. تغيير حجم أشرطة = 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 3: مقاطع وغ الملون لقياس أقطار كارديوميوسيتي عرضية في أجزاء من أنسجة القلب من الفئران مع تضخم القلب المتوسعة مقابل السيطرة على الحيوانات- صور الممثلة لأقطار كارديوميوسيتي في الفئران بالحجم العادي كارديوميوسيتي (A) والحيوانات مع كارديوميوسيتي زيادة أحجام (Tie2-CreERT2؛ PPARβ/δ + تاموكسيفين الفئران)⁵ (ب). وقد كونتيرستينيد نوى مع DAPI. خطوط بيضاء تشير إلى أقطار يقاس على مستوى الأنوية (أزرق). يتم تمثيل القيم لكل قياس. تغيير حجم أشرطة = 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 4: مقاطع إيمونولابيليد بيكم-1 تحليل كثافة السفينة القلب في مكافحة الفئران والحيوانات مع زيادة الأوعية.
الصور التمثيلية للسفينة وسم الفئران مع كثافة الأوعية الدموية العادية (أ) والحيوانات مع زيادة الأوعية الدموية (Tie2-CreERT2؛ PPARβ/δ + تاموكسيفين الفئران)⁵ (ب). وقد كونتيرستينيد نوى مع الهيماتوكسيلين. الأسهم تشير إلى السفن بيكم-1-إيجابية. تغيير حجم أشرطة = 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

وقد وضعت أساليب مختلفة لتقييم هيكل القلب ووظيفة في الفئران، بما في ذلك تخطيط صدى القلب وتعزيز التباين التصوير بالرنين المغناطيسي والصغرى الأشعة المقطعية والحيوانات الأليفة مسح. نظراً للفعالية من حيث التكلفة والبساطة، تخطيط صدى القلب هو الأسلوب الأكثر استخداماً للتحليل الوظيفي في الفئران¹¹. بشكل عام، بسبب صغر حجم القلب وتواتر ارتفاع معدل ضربات القلب في الفئران، ومحولات الطاقة مع تردد > ينبغي أن تستخدم 10 ميجاهرتز، على الرغم من أن قد تم الإبلاغ عن قياسات ناجحة مع 8 أو 9 ميجاهرتز محولات الطاقة^4،7 . ما وظيفة القلب ارتباطاً وثيقا بدرجة حرارة الجسم وتردد القلب، من المهم أن تتحكم هذه المعلمات طوال فترة الدراسة. وضع الماوس على وسادة تدفئة أمر ضروري للحفاظ على درجة حرارة جسم الحيوان أنيسثيتيزيد المستمر. ومن الناحية المثالية، ينبغي أن تستخدم وسادة تدفئة التي تسيطر عليها مع تحقيق المستقيم ضبط درجة حرارة الجسم إلى 38 درجة مئوية. إذا لم يكن هذا متوفراً، يجب تعيين لوحة تدفئة من سنتين إلى ثلاث درجات فوق هذه القيمة. وينبغي تجنب التدفئة مصابيح، كما أنها تعقد مهمة للمحقق وخطر ارتفاع درجة حرارة الحيوانات.

للتحكم في معدل ضربات القلب ووظيفة القلب، نوع التخدير مهم جداً. تستخدم معظم الدراسات إيسوفلوراني، التخدير من السهل للحث على طريق الاستنشاق في دائرة للاستقراء (3% إيسوفلوراني)، ويمكن الحفاظ عليه عن طريق قناع استنشاق (1-2% إيسوفلوراني)، وهو فقط لمدة قصيرة. المواد الأخرى المستخدمة عادة هي بينتوباربيتال، 2,2,2-تريبروموثانول والكيتامين + xylazine يمزج^11،12. المثير للدهشة، وقد ذكر إيسوفلوراني بخرق وظيفة القلب في القياسات مشخصين، وهذا التأثير كان أكثر وضوحاً في الكيتامين + xylazine المجموعة¹¹. وعملت الكيتامين وحدها أفضل في هذه الدراسة¹¹. غاو وآخرون. أفادت نتائج آخر استنساخه مع 2,2,2-تريبروموثانول¹². وكانت النتائج في نفس النطاق إيسوفلوراني، 2,2,2-تريبروموثانول، وبينتوباربيتال¹². أيضا، لم تكن معدلات القلب مختلفة في 2,2,2-تريبروموثانول وبينتوباربيتال تضم¹². القلب وآخرون عن انخفاض معدلات القلب في الكيتامين + مجموعة xylazine مقارنة ب المجموعة 2,2,2-تريبروموثانول¹⁶. في تجاربنا استخدام سلالات مختلفة وراثيا الماوس والتخدير بينتوباربيتال، معدلات القلب متوسط يتراوح بين 350 و 450 نبضة في الدقيقة. ومع ذلك، تم طرد الكسور > 80%، التي تتطابق مع القيم الموجودة في الحيوانات واعية¹¹. قياسات مشخصين تحت خط الأساس تكون الشروط من لدينا مختبر^4،5،6 في نفس النطاق ذكرت في أماكن أخرى^{11،12،14 ،،}من^1516،17،،من^{1819،20،21،22،26} . خلافا بينتوباربيتال، الكيتامين وإيسوفلوراني و 2,2,2-تريبروموثانول تتسم ببداية سريعة والانتعاش. وبالتالي، ينبغي أن يكون التوقيت بين التخدير والقياسات مشخصين نفسه بالنسبة لجميع الحيوانات في هذه الدراسة إلى تجنب درجات مختلفة من التعافي من التخدير. بينتوباربيتال أفعال تعد، ولكن له عيب نافذة علاجية صغيرة، مما يجعل من الضروري تعديل الجرعة أحكام فيما يتعلق بوزن الجسم. التخدير طويل الأمد باستخدام بينتوباربيتال لديه الميزة، يمكن أن يؤديها بعد القياسات مشخصين خط الأساس، والعمليات الجراحية دون الحاجة لإعادة حقن⁵. وينبغي تجنب التخدير المتكررة باستخدام بينتوباربيتال كما في تجربتنا، حقن بفاصل زمني أقل من أسبوع واحد أدت إلى ازدياد معدل الوفيات بعد العملية الجراحية.

عند إجراء تخطيط صدى القلب في الفئران مع > محول طاقة 10 ميغاهرتز، نوعية الصور ينبغي أن تكون كافية لتحديد دالة LV عمومية. يجب أن تؤخذ عدة صور لكل الحيوانات للحد من فوز إلى فوز الاختلافات والتحف الحركة. ينبغي أن يطلب مشورة الخبراء من أطباء قلب مدربين أو أحد علماء ذوي الخبرة في ضربات القلب في الفئران في البداية لتقييم جودة الصور. حساب معظم ضربات القلب آلات EF من LV بأقطار داخلية باستخدام صيغة^11،تيتشولز¹². حتى عندما سهلة لقياس أبعاد LV، أنها تقدم تقييما ناقصة LV وحدات التخزين ومناطق لأن الوقف لا يتفق مع أي شكل هندسي مثالية ومبسطة. لا كسرى تقصير ولا الإخراج التي تم الحصول عليها بواسطة الصيغة تيتشولز fraction معلمة مثالية لتحديد وظيفة LV الهوس، وأنها على حد سواء يستند إلى افتراض هندسية ووصف contractility الجدران اثنين فقط. كسر قذفي المقررة مع الأسلوب ذات السطحين سيمبسون أن يكون أكثر دقة، ولكن هذا كان من المستحيل الحصول على كل الحيوان مع المعدات المستخدمة هنا.

بعد احتشاء عضلة القلب، واجهنا العديد من المشاكل ذات الصلة بالتصوير مشخصين. أولاً، جودة الصورة أعاق إلى حد كبير ندبة ثوراكوتومي. ثانيا، كانت الحيوانات أكثر حساسية للتخدير المتكررة. وأخيراً، قياسات الحجم ووظيفة LV م-المستندة إلى وضع تفترض أن الهندسة LV متجانسة. نتيجة لذلك، استخدام هذه الأرقام القياسية ليصبح أكثر إثارة للجدل حضور LV الجدار شذوذ الحركة بعد احتشاء عضلة القلب.

في أيدينا، يسمح باستخدام مجس 15-ميجاهرتز لتسجيل الصور دوبلر عرضية، ولكنها غير منتظمة،. ترددات أعلى بكثير من المطلوب لتحديد وظيفة LV الإقليمية أو القيام بضربات القلب احتشاء عضلة القلب على النقيض، يمكن الحصول عليه فقط مع المعدات مكرس للقوارض¹².

نظراً لإمكانيات إضافية ودقة أعلى من تلك النظم الخاصة بمكافحة القوارض، واحدة ينبغي النظر في استخدامها في المستقبل. عيوب هي ارتفاع التكاليف والحاجة إلى مساحة مخصصة. سوف تكون هذه اتشوكارديوجرافس الراقية، ومخصصة لمكافحة القوارض مربحة فقط إذا ما يكفي الحيوانات قيد التحقيق وعدد الحرج من العلماء استخدام المعدات. تدريب خاص لهذه الآلات، يمكن استخدامها بالعلماء لا خبير في أمراض القلب. معدات تخطيط صدى القلب السريرية يوفر دقة محدودة، كما هو مذكور أعلاه. ومع ذلك، لا يزال بنجاح استخدامه في مختلف ل ذوي الخبرةأبوراتوريس^11،12؛ يمكن استخدامها بسهولة من قبل العلماء المهرة وأطباء القلب؛ هو المحمول أكثر وأقل تطلبا على مساحة مخصصة؛ ونظرا للعدد الكبير من الآلات، ويتيح النظر في خيارات مختلفة لخفض التكاليف (مثل استئجار أو الحصول على المعدات التي ليست قيد الاستخدام السريري أو القيام بمشتريات السلبي).

لإجراء تحاليل نسيجية، النقطة الحرجة الأولى لتقليل الوقت بين عزل الجهاز وتثبيت الأنسجة. كما هو الحال في هذا البروتوكول، تستند معظم التحليلات المصبوغة والنسيجي المجهري الخفيفة المنقولة؛ تثبيت غمر أنسجة القلب في فورمول غير كافية. إذا كان المشروع ينصب أكثر على تلطيخ مجهرية الأسفار، ينبغي النظر تثبيت نضح الحيوانات تخديره لإزالة خلايا الدم الحمراء من الأنسجة، وإظهار صف السيارات مشرق.

لتجنب الاختلافات في تضمين البارافين، نستخدم جهاز تضمين الآلي. كما أن نقطة انصهار وصلابة تختلف بين العلامات تجارية بارافين، نوصي باستخدام نفس المورد طوال فترة الدراسة. ينبغي أن يجري تقطيع البارافين في كتل مبردة مسبقاً باستخدام مبضع روتاري. سمك الفرع يجب أن تبقى ثابتة. سمك الفرع 3-ميكرومتر يسمح التصور واضح لحدود غشاء في أقسام الهيماتوكسيلين ويوزين-ملطخة بالقلب، ومطلوبة من أجل القياس الدقيق لأقطار كارديوميوسيتي. كما شكل كارديوميوسيتيس غير منتظم، يجب إجراء القياسات على مستوى النواة. وغ تلطيخ يوفر وسيلة بديلة وصمة عار غشاء الخلية وسوف ينتج نفس قيم تلوين الهيماتوكسيلين ويوزين. قبل تحليل شكلي، واحدة ينبغي أن تحدد بوضوح أي جزء من القلب (أي البطين الأيمن أو الأيسر الحرة الجدار أو الحاجز) وسوف يقاس وما إذا كان يتم تحديد المقاطع العرضية كارديوميوسيتي في محور طويلة أو قصيرة. سبب عرضي، ودوامه، والاتجاه الطولي من كارديوميوسيتيس في القلب، فمن الممكن الحصول على نفس المقطع العرضي الطولي والعرضي المقاطع من كارديوميوسيتيس. ما إذا كان يتم قياس أقطار الطولي أو العرضي مسألة الاتفاقية، طالما يتم تحليل الخلايا على مستوى النواة.

في دراساتنا، لاحظنا اتفاقا بين أبعاد مشخصين ونسب وزن القلب للجسم كارديوميوسيتي أحجام^4،،من⁵⁶، ولكن لا قياسات نسيجية من حجم كارديوميوسيتي دائماً تتوافق مع قيم كسر قذفي. على سبيل المثال، نتائج ممارسة التدريب في زيادة أبعاد القلب، مع كسر قذفي الحفاظ عليها وزيادة كارديوميوسيتي أقطار. ومع ذلك، التليف قصور القلب يتسم بزيادة أبعاد القلب، مع كسر قذفي انخفاض وزيادة كارديوميوسيتي أقطار³³. وعلاوة على ذلك، نحن مؤخرا أظهرت أن كثافة السفينة القلب زيادة سبب overexpression بطانية محددة من PPARβ لا يؤدي في تحسين وظيفة القلب في ظروف خط الأساس، ولا في تعزيز الانتعاش بعد احتشاء عضلة القلب⁵ .

إيمونوهيستوتشيميستري، من المهم لتشمل عناصر سلبية وأداء مختلف الخطوات الحظر المنصوص عليها في البروتوكول. الخطوة تعرية مستضد في البروتوكول محددة لجسم الأولية المستخدمة. للأجسام المضادة الأولية المختلفة، من الضروري تحديد عما إذا كانت المخازن المؤقتة لفضح pH منخفضة أو عالية ينتج أفضل إشارة. قد يتم استخدام تقنيات التثبيت مختلفة للكشف عن مستضد معين. على سبيل المثال، سجلت بيكام-1 وصف لتعمل بشكل أفضل على الأنسجة الثابتة الزنك، جزءا لا يتجزأ من البارافين، بينما يتطلب تثبيت نفس خطوات إضافية للحد من الخلفية ل جسم ثرومبومودولين³⁴. وهكذا، نحن نستخدم التثبيت الفورمالين العادية، مما سمح بتمديد الدراسة إلى مجموعة متنوعة من المستضدات المختلفة. كثيرا ما يستخدم بديل بيكام-1 إيمونوستاينينج، إيسوليكتين B4 لتصور السفن. وإلى جانب نسبة من خلايا بطانية³⁵، إيسوليكتين B4 تسميات أيضا إطلاق³⁶ والضامة³⁷. وعلاوة على ذلك، قد يتم استخدام مجموعة متنوعة من مولدات المضادات للتمييز بين خلايا بطانية الشرياني والوريدي³⁸. طريقة أنيقة لتصور الوظيفية perfused السفن أو تحديد السفينة تنتشر أو الانحدار هي الحقن الوريدي يكتين إلى جانب الأسفار متبوعاً بتحليل كريوسيكتيونس²⁴. ومع ذلك، هذا النهج إلى حد كبير يحد من إمكانيات للكشف عن المستضدات إضافية وإجراء تحليلات شكلي بسبب نوعية مختلفة كريوسيكشنز.

على المقاطع إيمونوستينيد حيث يتم تصور الإشارة مع الدأب، كثافة المنطقة يمكن الكمية تحديد استخدام البرمجيات ImageJ متاحة بحرية. بيد كالإشارة ليست خطية، ليس بالضبط تتوافق مع درجة تلطيخ بني على إلى مستوى التعبير البروتين.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Wheat germ agglutinin (WGA) conjugated tetramethylrhodamine	Life Technologies, Molecular Probes	W849
Biotinylated Goat Anti-Rabbit IgG Antibody	Vectorlabs	BA-1000
Avidin/Biotin Blocking Kit	Vectorlabs	SP-2001
VECTASTAIN Elite ABC HRP Kit (Peroxidase, Standard)	Vectorlabs	PK-6100
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI	Vectorlabs	H-1200
SIGMAFAST 3,3'-Diaminobenzidine tablets	Sigma	D4168
Hydrogen peroxide solution	Sigma	H1009
Anti-Pecam-1 (CD31) antibody	Abcam	ab28364
Ultrasound transmission gel, Gel Aquasonic 100	Parker
Linear ultrasound probe, L15-7io	Philips Healthcare
Echocardiograph, IE33 xMATRIX	Philips Healthcare
Microscope, Leica DMi8	Leica
Fluorescence Filterset DAPI	Leica	11525304
Filterset TxR	Leica	11525310
Digital Camera, SPOT RT3 Color Slider	Spot Imaging
Imaging Software, SPOT 5.2 Advanced and Basic Software	Spot Imaging
Imaging Computer	Dell
Fine Scissors	Fine Science Tools	14028-10
Large Scissors	Fine Science Tools	14501-14
Scalpel blades	Fine Science Tools	10023-00
Graefe Forceps	Fine Science Tools	11650-10
Rodent shaver	Harvard Apparatus	34-0243
cassettes for paraffin embedding	Sakura	4155F
neutral buffered Formalin	Sakura	8727
Xylene	Sakura	8733
Paraffine TEK III	Sakura	4511
automated embedding apparatus, Tissue-Tek VIP	Sakura	6032
paraffin-embedding station Tissue-Tek TEC 5	Sakura	5229
microtome blades,Accu-Edge S35	Sakura	4685
microscopy slides, Tissue-Tek	Sakura	9533
cover slips, Tissue-Tek	Sakura	9582
Mounting medium Tissue-Tek	Sakura	1408
slide boxes	Sakura	3958
eosine solution	Sakura	8703
hematoxyline solution	Sakura	8711
microtome, RM2125RT	Leica	720-1880 (VWR)
water bath, Leica HI1210	Leica	720-0113(VWR)
Ethanol	VWR	ACRO444220050
15 ml tubes	VWR	734-0451
staining glass dish	VWR	MARI4220004
staining jars	VWR	MARI4200005
Incubator	Binder	9010-0012
DAB and urea hydrogen peroxide tablets, SIGMAFAST 3,3′-Diaminobenzidine tablets	Sigma	D4293
PBS (10X)	Thermo Fisher Scientific	70011044