Das invertierte Herzmodell für interstitielle Transudat-Sammlung aus dem isolierten Rattenherz

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, um kardiale interstitielle Flüssigkeit aus dem isolierten, perfundierten Rattenherz zu sammeln. Um das interstitielle Transudat aus dem koronaren venösen Abwässer-Perfusat körperlich zu trennen, wird das Langendorff-Perfundherz umgekehrt, und das auf der Herzoberfläche gebildete Transudat (interstitielle Flüssigkeit) wird mit einer weichen Latexkappe gesammelt.

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt einen einzigartigen Ansatz, der die Sammlung von Herz-Transudat (CT) aus dem isolierten, salz-perfundierten Rattenherz ermöglicht. Nach der Isolierung und retrograden Perfusion des Herzens nach der Langendorff-Technik wird das Herz in eine umgekehrte Position umgekehrt und wird durch einen in den linken Ventrikel eingeführten Ballonkatheter mechanisch stabilisiert. Dann wird eine dünne Latexkappe, die zuvor auf die durchschnittliche Größe des Rattenherzens abgestimmt ist, über die Epikardoberfläche gelegt. Der Auslaß der Latexkappe ist mit dem Silikonschlauch verbunden, wobei die distale Öffnung 10 cm unterhalb des Grundniveaus des Herzens liegt und eine leichte Absaugung erzeugt. CT, das kontinuierlich auf der Epikardoberfläche erzeugt wird, wird in eisgekühlten Fläschchen zur weiteren Analyse gesammelt. Die Rate der CT-Bildung reichte von 17 bis 147 μl / min (n = 14) in Kontroll- und Infarktherzen, was 0,1-1% des koronaren venösen Abwassersperfusats entspricht. Proteomische Analyse und hohe PerfoRmance liquid chromatography (HPLC) zeigte, dass die gesammelte CT ein breites Spektrum an Proteinen und purinergischen Metaboliten enthält.

Einleitung

Herzinsuffizienz (HF) ist die führende Todesursache bei Menschen weltweit ¹ . HF tritt häufig wegen der Myokarditis, der ischämischen Beleidigung des Myokards und der linksventrikulären Remodelierung auf, was zur fortschreitenden Verschlechterung der kontraktilen Herztierfunktion und der Lebensqualität der Patienten führt. Obwohl Fortschritte in der Kardiologie und Herzchirurgie die HF-Sterblichkeit merklich gesenkt haben, dienen sie lediglich als vorübergehende "Verzögerer" eines unvermeidlich fortschreitenden Krankheitsprozesses, der eine signifikante Morbidität aufweist. Daher unterstreicht der derzeitige Mangel an wirksamer Behandlung die Notwendigkeit, neuartige molekulare Ziele zu identifizieren, die HF verhindern oder sogar umkehren können. Dazu gehören Veränderungen in der extrazellulären Matrix, unkontrollierte Herz-Immunantwort und Wechselwirkungen zwischen Herz- und Nicht-Herz-Zellen ² .

Es ist wichtig zu erkennen, dass die Mikroumgebung, die Herzzellen ausgesetzt sindUm die Immun- und Regenerationsreaktion des verletzten Herzens zu formen. In dem isolierten, salzperfundierten Herz wird CT auf der Herzoberfläche in Form von kleinen Tröpfchen erzeugt, die aus dem interstitiellen Fluidraum ( dh Mikroumgebung), sowohl unter physiologischen als auch pathophysiologischen Bedingungen ^{3 , 4 , 5, abgeleitet sind} . Daher kann die Analyse der CT ( dh interstitielle Flüssigkeit) dazu beitragen, Faktoren zu identifizieren, die den Herzmetabolismus und die kontraktile Funktion ⁶ regulieren oder die Immunzellenfunktionen nach der Migration in das verletzte Herz beeinflussen. Potenziell kann dies zur Entwicklung neuartiger therapeutischer Strategien zur Behandlung von HF führen.

Die Sammlung von CT aus murinen Herzen ist technisch anspruchsvoll. In regelmäßigen Langendorff-perfundierten Herzen ist die exklusive CT-Sammlung schwierig, weil die Mischung der CT mit CoronarY venöse Abwässerperfusate verdreht unvorhersehbar jede Konzentration von Metaboliten / Enzymen, die aus dem interstitiellen Raum freigesetzt werden. Eine mögliche Strategie, diese Einschränkung zu überwinden, besteht darin, den venösen Abfluss durch Kanülen des Pulmonals auszuschließen und gleichzeitig die Lungenvene zu lenken ⁷ . Diese Methode steht jedoch vor Schwierigkeiten, die mit der Kanülierung und Ligation der Pulmonalarterie und der Vene verbunden sind, was ein potentielles Auslaufen von venösen Abwässern in das Herztransudat verursacht. Das Konzept der Verwendung eines umgekehrten Herzmodells wurde zuerst von der Gruppe von Kammermeier eingeführt, die das isolierte, perfundierte Herz in eine umgekehrte Position umwandelte und eine dünne Latexkappe auf die Epikardoberfläche legte, um kontinuierlich CT ohne die Verunreinigung des venösen Abwassers abzutasten ^{8 , 9} Unter Verwendung dieses Verfahrens zeigte CT eine sehr empfindliche Messung der aus dem Herzen ⁹ freigesetzten Metaboliten,Die Kapillartransfer von Fettsäuren ⁸ und die Viruspartikel ¹⁰ .

In jüngster Zeit wurden parakrine Faktoren, die die lokale Immunantwort regulieren und die Herzangiogenese ¹¹ erhöhen können, in die vorteilhaften Wirkungen einer Stammzell-Therapie auf Herzerkrankungen verwickelt. Die Analyse der CT im umgekehrten Herzen kann dazu beitragen, diese einzelnen parakrinen Faktoren chemisch zu identifizieren. Darüber hinaus kann CT helfen, die Faktoren, die bei der in vivo Aktivierung von Immunzellen im Herzen beteiligt sind, zu identifizieren.

Die detaillierte Beschreibung der CT-Sammlung von der Herzoberfläche, die hier zur Verfügung gestellt wird, ist experimentell nützlich für Forscher, die das Zusammenspiel von Immunzellen, Fibroblasten, Endothelzellen und Kardiomyozyten im Zusammenhang mit der Gesamt-Herzfunktion untersuchen. Wie oben erwähnt, trägt die interstitielle Flüssigkeit die Information für die Zell-zu-Zell-Kommunikation innerhalb des Herzens, whIch kann bequem durch die Sammlung von CT beurteilt werden. Die ausführliche technische Beschreibung, einschließlich eines Videoprotokolls, wie man CT aus dem umgekehrten Herzen sammelt, sollte die zukünftige Anwendung dieser einzigartigen Technik erleichtern.

Protokoll

Alle Experimente wurden von der örtlichen Regulierungsbehörde ( LANUV Nordrhein-Westfalen, Deutschland) genehmigt und wurden nach den Richtlinien der Tiernutzung durchgeführt. Die Tiere wurden mit einer Standard-Chow-Diät gefüttert und erhielten Leitungswasser ad libitum . Alle Geräte und Chemikalien, die für jeden Schritt des Experiments notwendig sind, sind in der Tabelle der Materialien verfügbar.

1. Vorbereitung der Latexkappe und des intraventrikulären Ballons

1. Machen Sie eine Aluminiumform mit einer Fräsmaschine, die der durchschnittlichen Größe des Rattenherzens entspricht (Körpergewicht von 300-350 g). Polieren Sie die Form mit superfeinem (10/0) ​​Schmirgelpapier.
   HINWEIS: Die detaillierten Metriken der Form sind in Abbildung 1A dargestellt .
2. Vertikal fixieren Sie den Hals der Aluminium-Form auf die Fräsmaschine, um die Latex-Kappe vorzubereiten.
   HINWEIS: Die Fräsmaschine bewirkt, dass sich die Form langsam dreht. Alternativ kann ein Elektromotor verwendet werden. Li>
3. 20 ml flüssiger Latex (handelsüblich, siehe Tabelle der Materialien ) in einen 50 ml Glasbecher geben.
4. Senken Sie die Form, bis der gesamte Körper der Form in die Latexlösung eingetaucht ist.
5. Langsam die Form (5 cm / min) beim Drehen heben.
6. Halten Sie die Form für weitere 15 Minuten, bis der Latex auf der Oberfläche der Form verfestigt ist.
7. Füge etwa 1 g Talkumpuder zur Oberfläche der Form hinzu (bereits mit einem dünnen Latexfilm bedeckt), um Schäden beim Ablösen zu vermeiden.
8. Vorsichtig mit den Fingern die bereits getrocknete Latexkappe von der Formoberfläche abziehen; Die Latexkappe ist nun betriebsbereit ( Bild 1B ).
9. Verbinden Sie den Auslass der Latexkappe mit einem 15-cm-Silizium-Schlauch (ID = 0,2 mm), der später für die Sammlung von CT verwendet wird.
10. Füllen Sie den ventrikulären Latexballon mit Wasser und fixieren Sie ihn fest auf eine L-förmige Metallkanüle, die mit einer 1 mL wassergefüllten Spritze (> Fig. 1C).
    HINWEIS: Dies wird verwendet, um die aufrechte Positionierung des Herzens zu gewährleisten (siehe unten).
11. Vergewissern Sie sich, dass der Ballon luftdicht ist, indem Sie mehrere Entlüftungs- / Aufblasversuche mit der beigefügten 1-ml-Spritze durchführen.
12. Verbinden Sie die Kanüle über einen Dreiwege-Anschlag mit einem Druckaufnehmer für die zukünftige Messung des intraventrikulär entwickelten Drucks ( Abbildung 1C ).

2. Vorbereitung von Krebs-Henseleit-Puffer (KHB) und dem Langendorff-Perfusionssystem

1. Richten Sie ein Langendorff-Perfusionssystem ein, indem Sie entweder Konstantstrom (angetrieben durch eine Rollenpumpe) oder einen konstanten Druck (erzeugt durch einen statischen Druck in einer Glassäulen) -Modus verwenden.
   HINWEIS: Details der Langendorff-Herzpräparation wurden zuvor beschrieben ¹² .
2. 2 L eines modifizierten KHB (in mM: 116,02 NaCl, 4,63 KCl, 1,10 MgSO & sub4; · 7H & sub2; O, 1,21 K & sub2; HPO & sub4; , 2,52 CaCl ₂ · 2H ₂ O, 24,88 NaHCO ₃ , 8,30 D-Glucose und 2,0 Natriumpyruvat).
   1. Wiegen alle Chemikalien, aber CaCl ₂ und lösen sie in 1,8 l doppelt destilliertem Wasser in einem 2-l-Kolben auf.
   2. Das Medium mit Carbogen (95% O ₂ /5% CO ₂ ) für mindestens 5 min bei Äquilibrierung (pH: 7,4) unter magnetischem Rühren aufblasen.
   3. 0,74 g CaCl ₂ · 2H ₂ O zugeben und das Gesamtvolumen auf 2 l mit doppelt destilliertem Wasser auffüllen.
   4. Setzen Sie das Rühren fort und sprudeln Sie das Medium mit Carbogen für weitere 5 min.
   5. Filtern Sie die KHB durch einen 0,2 μm Filter, um kleine Partikel zu eliminieren, die die Mikrozirkulation des Herzens behindern können.
3. Vorbereitung des Langendorff-Perfusionssystems
   1. Den gefilterten KHB in ein vorgewärmtes Wasserbad (38 ° C) stellen; Bleiben Sie mit Carbogen sprudeln, um einen Druck von 100 cmH ₂ O Inside zu erzeugenDer KHB-Reservoir.
   2. Verbinden Sie den Vorratsbehälter mit der Glassäule, um 100 cmH ₂ O hydrostatischen Druck für die Langendorff-Perfusion mit KHB herzustellen; Weiterhin die KHB in der Säule mit Carbogen sprudeln.
   3. Stellen Sie die Temperatur des Erwärmungssystems so ein, dass die Temperatur am Aortenkanülenauslass 37 ° C beträgt.
   4. Stellen Sie sicher, dass das Schlauchsystem blasenfrei ist.
   5. Oxygenieren Sie das KHB mit Carbogen für weitere 5 min, bis die PO ₂ im KHB 500-600 mmHg erreicht (gemessen mit einem Blutgasanalysator).
4. Stellen Sie das Perfusionssystem so auf, dass es bei einem konstanten Druck von 100 cmH ₂ O oder bei konstantem Durchfluss von ca. 10-20 mL / min mit manueller Umschaltung läuft. Alternativ können Sie mit einem austauschbaren STH-Pumpenregler sofort in den Perfusionsmodus wechseln.

3. Isolierung und Kanülierung des Herzens

HINWEIS: Männliche Wistar-Ratten mit Körpergewichten von 300-350 g wurden verwendet, so dass die Größen der Herzen auf die vorgegossene Latexkappe abgestimmt waren. Ratten wurden entweder eine Ligation der linken Arterienabsenkung (KOPF) für 50 min, gefolgt von Reperfusion oder wurden sham betrieben. Einzelheiten der Methodik zur Induktion von Myokardinfarkt (MI) wurden an anderer Stelle angegeben ¹³ . Die umgekehrten Herzversuche an den Infarkttieren wurden 5 Tage nach der Operation durchgeführt.

1. Anästhesieren von Ratten unter Verwendung eines Isofluranverdampfers (2% V / V), der mit einer Tierhaltekammer (20 L) verbunden ist.
2. Übertragen Sie die Ratten auf eine Operationstabelle (nicht temperaturgesteuert), nachdem eine tiefe Anästhesie erreicht ist.
3. Heben Sie die Haut und Muskeln knapp unter dem Brustbein mit Pinzette und schneiden Sie den unteren Rand der Rippen mit schweren Scheren.
4. Mit feinen Scheren, machen Sie einen kleinen Schnitt in das Zwerchfell, am Rippenrand. Schneiden Sie die Rippen kaudal, um eine Klappe der gesamten ventralen Brustwand zu machen.
5. Gönnen Sie sich das Herz mit dem DaumenNd Index und Mittelfinger und langsam heben Sie es nach oben, so dass die Herzgefäße leicht gestreckt werden.
6. Heben Sie das Herz an, bis die Aorta vollständig ausgesetzt ist.
7. Legen Sie das Herz in ein 100 ml-Becherglas mit 50 ml eiskaltem KHB (4 ° C) und verschieben Sie es in den Perfusionsapparat.
8. Sofort das Herz über die Aorta auf eine tropfende Kanüle bringen und mit einer Naht (4-0) festziehen. Vermeiden Sie Luftblasen, die ins Herz eindringen.
9. Einen konstanten Perfusionsdruck (100 cmH ₂ O) anwenden. Alternativ kann eine volle Durchflussrate (beginnend mit 20 mL / min) angewendet werden.
   Anmerkung: Die Zeit von der Öffnung des Thorax bis zur Anbringung des Herzens an die Perfusionskanüle sollte etwa 3 min in den Händen eines erfahrenen Betreibers dauern.

4. umgekehrtes Herzmodell

1. Die Aortenkanüle vorsichtig drehen, bis die hintere Wand des Herzens in Sicht ist.
2. Das Bindegewebe mit einer Schere entfernenUm die Öffnung des linken Vorhofs auszusetzen, so dass es für die intraventrikuläre Kanülierung bereit ist.
3. Setzen Sie den entleerten Latexballon an einen starren Katheter über den linken Vorhof in den linken Ventrikel.
4. Den Ballon aufblasen, bis er die gesamte Ventrikelhöhle füllt (das Aufblasvolumen ist auf der Spritze vormarkiert).
5. Invertiere das Herz, bis es umgedreht ist und es durch den intraventrikulären Ballonkatheter unterstützt.
6. Wie in Abbildung 1C gezeigt , mechanisch stabilisieren Sie das umgekehrte Herz in einer aufrechten Position unter Verwendung des intraventrikulären Ballons mit einem starren Metallkatheter.
7. Passen Sie die Position des Herzens an, um eine übermäßige Verdrehung der Aortenwurzel zu vermeiden.
8. Den diastolischen Druck auf 3-5 mmHg einstellen (gemessen durch den intraventrikulären Ballon, siehe Abbildung 1C ).
9. Beobachten Sie die epikardiale Oberfläche des Herzens und stellen Sie sicher, dass kleine Tröpfchen bilden.
10. Legen Sie die Latexkappe oNto die Oberfläche des Herzens durch sanftes Drücken, um das ganze Herz mit den Fingern zu decken.
11. Vergewissern Sie sich, dass die Latexkappe den größten Teil der ventrikulären Oberfläche bedeckt.
12. Entfernen Sie die Luftblasen, falls vorhanden, in die Kappe und den Schlauch, indem Sie mit einer 1-ml-Spritze vorsichtig saugen.
13. Stellen Sie die distale Öffnung des CT-Rohrs auf 10 cm unterhalb der horizontalen Höhe des Herzens ein.
    HINWEIS: Diese Vorgehensweise sorgt für ein geringes Ansaugen durch negativen hydrostatischen Druck.
14. Sammeln Sie Tropfen von CT in einem 1,5 ml Sammelröhrchen, das in Eis gemischt 1: 1 mit NaCl gegeben ist. Sammle etwa 0,15-1,5 ml CT.
    HINWEIS: Die Eis / NaCl-Mischung stabilisiert die Temperatur im Sammelröhrchen unter Null (ca. -4 ° C).
    HINWEIS: Die Probenahmezeit hängt vom experimentellen Zweck ab. Die Durchflussrate des CT beträgt bei den koronar-ligierten Tieren (n = 11) etwa 27 ± 20 μl / min bei scheinoperierten Tieren (n = 3) und 100 ± 47 μl / min.
15. Wäge- und Snap-Freeze-CT-ProbenIn flüssigem Stickstoff und lagern bei -80 ° C für spätere Messungen.

5. Analyse der CT

1. Verwenden Sie die CT-Flüssigkeit für die Analyse der Metaboliten, abhängig von der wissenschaftlichen Frage.
   HINWEIS: Die in Fig. 2 und Fig. 3 gezeigten Daten wurden aus einer Konstantdruckperfusion (100 cmH & sub2; O) gesammelt und etwa 0,15-1,5 ml CT-Fluid wurden innerhalb einer Zeitspanne von 10 min gesammelt. Diese Zeit und das Volumen waren ausreichend für das Proteom (Minimum: 50 μl, Abbildung 2 ) ¹⁴ und HPLC (mindestens 20 μl, Abbildung 3 ) ¹⁵ Analyse verschiedener Purine.

Ergebnisse

Das umgekehrte Herzmodell ermöglicht die Sammlung von Herz-Interstitial-Transudat in einem isolierten, retro-perfundierten Rattenherz ( Abbildung 1A -C ). Wenn sie bei einem konstanten Druck von 100 cmH ₂ O perfundiert wurde, lag die Rate der interstitiellen Fluidbildung zwischen 17 und 147 & mgr; l / min, was 0,1 bis 1% des koronaren venösen Abwassers im isolierten Herzen betrug.

Diskussion

Das umgekehrte Herzmodell basiert auf der etablierten Langendorff-Herzperfusionstechnik ¹² und wird durch einfaches Invertieren des Herzens in eine umgekehrte Position und Halten dieser Position unter Verwendung eines starren intraventrikulären Ballonkatheters durchgeführt. Auf diese Weise kann das kardiale interstitielle Transudat physisch von dem koronaren venösen Abflussperfusat getrennt werden, das durch die Schwerkraft von der Basis des Herzens ⁹ tropft. Die CT kann k...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Latexlösung	ProChemie	Z-Latex LA-TZ	http://kautschukgesellschaft.de/%E2%80%A8z-latex-la-tz
Aluminiumform	Hausgemacht-Reverse		Heart Modell
Universal Öfen	Memmert	UNB 400	Reverse Heart Modell
Latex Ballon	Hugo Sachs	Größe 4	Reverse Heart Modell
Fräse	Proxxon	MF70	Umgekehrtes Herzmodell
Natriumchlorid	Sigma	SZBD0810V	Chemikalien
Natriumhydrogencarbonat	Roth	68852	Chemikalien
Kaliumchlorid	Merck	49361	Chemikalien
Magnesiumsulfat Heptahydrat	Merck	58861	Chemikalien
Kaliumdihydrogenphosphat	Merck	48731	Chemikalien
D(+)-Glukose wasserfrei	Merck	83371	Chemikalien
Calciumchlorid-Dihydrat	Fluka	21097	Chemikalienwaage
	VWR	SE 1202	Wägen von Chemikalien
Doppelt destilliertes Wasser	Millpore-lösende		Chemikalien
Medizinischer Druckmessumformer	Gold-Langendorff
Apparat Medizinische Strömungssonde	Transsonic	3PXN	Langendorff Apparat
Heizung Umlaufbad	Haake	B3 ; DC1	Langendorff-Apparatur
Labor- und Vakuumschläuche	Tygon	R-3603	Langendorff-Apparatur
Tierforschung Durchflussmesser	Transsonic	T206	Langendorff-Apparatur
PowerLab Datenerfassungsgerät	AD-Instrumente	Grafik 7.1	Langendorff-Apparatur
LabChart Datenerfassungssoftware	AD-Instrumente	Grafik 7.1	Langendorff Apparat
Schlauchpumpe	Glison	MINIPULS 3	Langendorff Apparat
Glaswassersäule	hausgemachter		Langendorff Apparat
Wasserbad Schutzmittel	VWR	462-7000	Langendorff Apparat
Sterile Einwegfilter (0,2 &; Mikro; m)	Thermo Scientific	595-4520	Langendorff Gerät
Blutgasanalysatoren	Radiometer	ABL90 FLEX PLUS	Gasanalysator
70% Ethanol	VWR	UN1170	Reinigung & Schläuche
100% Ethanol	Merck	64-17-5	Reinigungsschläuche
Wistar Ratten	Janvier-Animals
Edelstahl Schere	AESCULAP	BC702R	Chirurgische Instrumente
Rostfreie Schere	AESCULAP	BC257R	Chirurgische Instrumente
Große Pinzetten	AESCULAP-Chirurgische		Instrumente
8m/m Edelstahl Pinzette	F.S.T	11052-10	Chirurgische Instrumente
superfeines (10/0) Schmirgelpapier	3M	051111-11694	Reverse Heart Modell