Eine schnelle und effiziente Methode, um Pupal Flügel von Drosophila geeignet für Immunodetections oder PCR-Assays sezieren

Zusammenfassung

Die Fähigkeit, präzise Abschriften oder Proteine in Drosophila Gewebe erkennen ist entscheidend für die Untersuchung ihrer Fülle und Lokalisierung, die im Zusammenhang mit den Entwicklungsprozess. Hier ist die Beschreibung eines einfachen Verfahrens pupal Flügel zu sezieren. Diese Flügel können als Muster in verschiedenen Techniken (PCR-Assay, Immunohistochemistry, etc.) verwendet werden.

Zusammenfassung

Flügel-Entwicklung in Drosophila Melanogaster ist ein ideales Modell für das Studium Morphogenese Gewebe Ebene. Diese Anhängsel entwickeln sich aus einer Gruppe von Zellen benannt Flügel imaginalen Scheiben gebildet während der Embryonalentwicklung. In die Larvenstadien wachsen die imaginalen Scheiben, Erhöhung der Anzahl der Zellen und monolayered epitheliale Strukturen bilden. Im Inneren der pupal Fall die imaginalen Scheiben Knospe heraus und Falten in Bilayer entlang einer Linie, die die künftige Marge des Flügels wird. Während dieses Prozesses stammen die longitudinale Primodia Venen Vene Zellen auf den zukünftigen dorsalen und ventralen Flächen des Flügels. Während das Puppenstadium kommunizieren die Streifen der Vene Zellen jeder Fläche um die enge Röhren zu generieren; zum gleichen Zeitpunkt beginnen die Kreuz-Venen ihrer Entstehung.

Mit Hilfe von entsprechenden molekularen Markern ist es möglich, die wichtigsten Elemente des Flügels während seiner Entwicklung zu komponieren zu identifizieren. Aus diesem Grund ist die Fähigkeit, präzise Abschriften oder Proteine in dieser Struktur erkennen kritischer für die Untersuchung ihrer Fülle und Lokalisierung, die im Zusammenhang mit den Entwicklungsprozess des Flügels.

Die Vorgehensweise hier konzentriert sich auf Manipulation pupal Flügel, eine ausführliche Anleitung zum Umgang mit den Flügel während das Puppenstadium zu sezieren. Die Zerlegung des pupal Gewebe ist schwieriger durchzuführen als ihre Gegenstücke in Dritte Instar Larven. Deshalb ist dieser Ansatz entwickelt wurde, um schnell und effizient hochwertige Proben zu erhalten. Details wie Immunostain und montieren diese Flügel Proben ermöglichen die Visualisierung von Proteinen oder Zellbestandteile, im Protokoll zur Verfügung gestellt werden. Mit wenig Erfahrung ist es möglich, 8-10 hochwertige pupal Flügel in kurzer Zeit zu sammeln.

Einleitung

Drosophila Flügel werden aus den Flügel imaginalen Scheiben entwickelt. Das ursprüngliche dieser Flügel Discs während der Embryonalentwicklung als kleine Gruppen von 20-30 imaginalen Zellen, die aus embryonalen Epithel Biomembran beiseite. Während die Larve in die dritte Stufe der Instar wächst, tritt Mitose in die imaginalen Zellen zu bestimmten charakteristischen Zeiten heben seine Zahlen (ca. 50000 Zellen) und bilden die Flügel^{1,2,3Disc, 4}. Da die Zellen sich vermehren, Mode sie eine röhrenförmige Epithel, was zu einer selbst fa....

Protokoll

Tag1

1. Erhebung und Kultivierung Puppen.

1. 0 h nach Puppenkammer Bildung (APF) oder Prepupae mit einem nassen Pinsel aus kultivierten Fläschchen entfernen und legen Sie sie in neue Fläschchen die Entwicklungszeit fast abgeschlossen (siehe 2.1 und 2.2).
   Hinweis: Eine gesunde Population von Fliegen mit Kultivierung Standardprotokolle aufzubewahren. Nach drei oder vier Tagen die Eiablage, können die Erwachsenen Fläschchen erlauben eine optimale Entwicklung der Individuen entnommen werden. Sie sind bei einer konstanten Temperatur beibehalten, bis die dritte Instar Larven Verpuppung initiieren. Die Larven/pupal Übe....

Ergebnisse

Das Protokoll bietet eine einfache Methode für den Erhalt der pupal Flügel-Proben, die die vertraute Morphologie des Flügels zu behalten. Von diesen Vorbereitungen ist es möglich, Stapel von Bildern zu erhalten, die als 2-D oder 3-d, zu untersuchen, Verbreitung und/oder die Anreicherung von Proteinen während der Differenzierung des Flügels projiziert werden konnte. Ein ähnliches Protokoll (siehe Anmerkung in 2,9) lässt sich die große pupal Flügel-Probe (mit 50-80 pupal Flügel) notwendige,.......

Diskussion

Die Methode der Dissektion in diesem Video beschrieben kann zur Vorbereitung hochwertige Proben von Drosophila pupal Flügel aus verschiedenen Entwicklungsstufen für viele Arten von Techniken (z. B. Immunfluoreszenz, cDNA Synthese zu PCR-Assays, in-vitro- Flügel Entwicklung). In Bezug auf diese Methode der beteiligten Wissenschaftler nutzten 24-30 h APF. Es sollte jedoch kein Hindernis in die wesentlichen Schritte in Dissektion der jüngere oder ältere Puppe. Änderungen müssen vorgenommen werden.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Stereomikroskop mit Cool-Light-Beleuchtung	Nikon
Schaukelplattform	Biometra (WT 16)	042-500
Objektträger	StarFrost	8037/1
Deckgläser (24 x 32 mm)	Deltalab	D102432
Pinzette	F.S.T	11252-00
Schere	Lawton	63-1400
Multiwell-Kunststoffschale	Thermo Wissenschaftliche	144444
p100 oder p200 Pipette	Finnpipette (Labsystems)	9400130
1X PBS (Dulbecco)	Gibco	21600-010
4% Paraformaldehyd	Sigma	158127
Triton X-100	Sigma	T8787
BSA	Bio Basic INC.	9048-46-8
Glycerol	Mallinckrodt	5092
Tris	Amresco	497
TRIzol Reagenz	Ambion	15596026
DEPC behandeltes Wasser	MO. BIO	17011-200
Alexa Fluor 546 Anti-Maus-IgG (H+L), 2 mg/ml (Arbeitsverdünnung 1/800)	Invitrogen	A11030
Monoklonales Anti-Ptc (Apa-1) 54 μ g/mL (Arbeitsverdünnung 1/100)	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)		Von Isabel Gerrero von DSHB unter der Schirmherrschaft des NICHD und gepflegt von der University of Iowa, Department of Biological Sciences, Iowa City, IA 52242.
DAPI, 1 mg/ml (Arbeitsverdünnung 1/5000)	Invitrogen	62248
Phalloidin, konjugiert mit Alexa 488, 300 U/1,5 mL Methanol (1/600 Arbeitsverdünnung)	Invitrogen	A12379
Canton S (Fliegenstock)	Bloomington Drosophila Stock Center

SMZ1000