Summary
היכולת לזהות במדויק התמלילים או חלבונים ברקמות דרוזופילה הוא קריטי עבור הלומדים שלהם שפע ולוקליזציה הקשורות לתהליך הפיתוח. הנה התיאור של תהליך פשוט לנתח כנפיים הגולמי. אלה כנפיים יכול לשמש כדוגמאות מספר טכניקות (אימונוהיסטוכימיה, PCR assay, וכו ').
Abstract
אגף פיתוח melanogaster דרוזופילה הוא מודל אידיאלי ללמוד מורפוגנזה ברמת רקמות. תוספות אלה לפתח מתוך קבוצה של תאים בשם אגף דיסקים דמותי נוצר במהלך התפתחות. הזחל הדיסקים דמותי צומחים, להגדיל את מספר התאים ויוצרים מבנים אפיתל monolayered. בתוך התיק הגולמי הדיסקים דמותי באד החוצה ומקפלים לתוך bilayers לאורך קו זה הופך לשולי העתידי של האגף. במהלך תהליך זה, מקורם הורידים primodia האורך וריד תאים הגבי ו הגחון פוטנציאליים של משטחי הכנף. במהלך השלב הגולמי הפסים של וריד תאים של כל שטח תקשורת על מנת ליצור צינורות חזק; במקביל, קרוס-הורידים מתחילים היווצרותם.
עם העזרה של סמנים מולקולריים המתאים, זה אפשרי לזהות את המרכיבים המרכזיים להלחין את האגף במהלך התפתחותו. מסיבה זו, היכולת לזהות במדויק התמלילים או חלבונים במבנה זה חיוני ללמוד שלהם שפע ולוקליזציה הקשורות לתהליך הפיתוח של האגף.
ההליך המתואר כאן מתמקדת על מניפולציה כנפיים הגולמי, מתן הנחיות מפורטות כיצד לנתח את האגף במהלך השלב הגולמי. . הקרע של רקמות הגולמי קשה יותר לביצוע מאשר מקביליהם הזחלים לחלל השלישי. זו הסיבה מדוע גישה זו פותחה, כדי לקבל דוגמאות איכותי מהיר ויעיל. פרטים לגבי אופן immunostain ו הר דגימות אלה כנף, כדי לאפשר את הפריט החזותי של חלבונים או מרכיבי התא, ניתנים בפרוטוקול. עם המומחיות הקטנה אפשרי לאסוף 8-10 כנפיים הגולמי באיכות גבוהה תוך זמן קצר.
Introduction
דרוזופילה כנפיים מפותחים של הדיסקים דמותי כנף. הבראשיתי של הדיסקים האלה כנף הם לשים בצד במהלך התפתחות עובריים כקבוצות קטנות של תאים דמותי 20-30 invaginate של האפיתל מתחלקים. בעוד הזחל הולך וגדל השלב לחלל, מיטוזה מתרחש בתאים דמותי במועדים האופיינית ספציפיים, העלאת המספרים שלה (כ 50000 תאים) ויוצרים את הכנף דיסק1,2,3, 4. כמו התאים להתרבות, הם אופנה אפיתל צינורי, וכתוצאה מכך ספירלה קומפקטי מתקפל עצמית. במהלך להתגלמות, טלסקופים האפיתל דיסק מחוץ לאגף טופס דו שכבתי, הורידים האורך להתחיל בתור לקונות ביניהם, אשר מתרחשת פעמיים במהלך כנף התפתחותית5,6.
הסידור של ורידים תמיד יש תבנית זהה; היכולת לזהות בקלות כל שינוי בתוך היווצרות הורידים הופך מוטציות גלוי מאוד (למשל חסרים או מיותרים וורידים, שינוי עמדות וריד, וכו '). מעניין, הווריאציות פנוטיפ בדרך כלל הראיות של מוטציות מוכרות או רומן רכיבים של איתות המסלולים הרלוונטיים לפיתוח כנף. אחד המסלולים זה ממלא תפקיד בקביעת המיקום ושמירה על הווריד וטריטוריות intervein הוא קיפוד (Hh) מסלול6,7,8.
בהתחשב בחשיבות של האגף הגולמי כמערכת מודל, חשוב יהיה להשיג דגימות באיכות טובה לעבוד עם. בעבר, מדענים שפרסמו פרוטוקולים לנתח דרוזופילה כנפיים לא העניק מדריך המתאים כדי להשיג דגימות עביד. ללא ההדרכה של חוקר אחד לא יכול בבירור להמחיש את התהליך. בגישות חלופיות אלה ויבתר הגולם לחלק שני, הפרדת האגף מן הרקמה שמסביב, שטפתי שוב ושוב לפנות את הפסולת. סוג זה של הגישה תביעות לעזוב את האגף חינם של מזהם אבל עקב התנסות קודמת התהליך הוא איטי יותר, ויש סיכוי גבוה יותר להתפשר על המבנה של בכנפיים השבריריות9.
ההליך המתואר כאן פותחה על ידי הדרישה למצוא שיטה מהירה ויעילה להשיג דגימות כנף הגולמי מתאימים לזהות חלבונים ספציפיים או התמלילים באמצעות פרוטוקולים immunodetection או מבחני (PCR) תגובת שרשרת של פולימראז. כדי להמחיש זאת, ביטוי של לוקליזציה של Patched (Ptc או הקולטן הקנוני של הנתיב Hh) מזוהה בדגימות כנף הגולמי, מתן פרוטוקול הכולל את הפרטים הרלוונטיים כדי לבצע בהצלחה את השלם נוהל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
יום 1
1. איסוף של culturing הגלמים.
- להסיר את 0 h לאחר היווצרות puparium (APF) או prepupae באמצעות מברשת רטובה של בקבוקונים בתרבית ומניחים בקבוקונים חדשים כמעט להשלים תקופת פיתוח (ראה 2.1 ו- 2.2).
הערה: צריך להיות מתוחזק אוכלוסיה בריאה של זבובים באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים culturing. לאחר שלושה או ארבעה ימים שבהם הביצים מוטלות, ניתן להסיר את המבוגרים בקבוקונים. כדי לאפשר את התפתחות אופטימלית של האנשים. הם נשמרים בטמפרטורה קבועה עד הזחלים לחלל השלישי ליזום להתגלמות. המעבר זחל הגולמי מסומן על ידי היווצרות prepupa נחשב את 0 h APF. Prepupa הוא זחל לבנים משותק הכולל של המלבן, צורה עם בולטות קדמית spiracles עגולה.
יום 2
2. העברה, ניתוח של קיבוע.
- להעביר את הגלמים (2 h לפני הזמן פיתוח הוא להשלים) באמצעות מברשת צבע, עד השקופית מיקרוסקופ עם סרט הדבקה דו-צדדי דבקה זה. מקם את הגלמים כדי ליצור שורה עם מעלה הגבי צדדים cephalic מסתיים פונות לאותו הכיוון.
- לחזור לשקופית מיקרוסקופ טמפרטורה קבועה ולאפשר הגלמים להשלים את הזמן המתאים התפתחותית (כלומר 24-30 h APF).
הערה: השקופית מיקרוסקופ עם קלטת דו-צדדית יהיה פלטפורמה חלוף ניתוח כדי להסיר את המקרה הגולמי (ראו להלן). זמן לשגות בשקופית מיקרוסקופ (מחוץ המבחנה) עוזר לייבש את התיק הגולמי עושה את. זה בקלות שבירים עם מלקחיים. - הסר את operculum המקרה הגולמי באמצעות מלקחיים.
- לפענח את המקרה עם מלקחיים (כפי שמוצג בסרטון) ביצוע קו לאורך הצד של הגולם הסוף סימטרית. זה אפשרי לזהות את הצורה פנימי של הגולם שהופך ניכר רווח מעל הציר של האגף הגולמי ההארה מתאימות. שטח זה משמש מדריך כדי לבצע את הפתיחה ללא פגיעה הגולם.
- הסרת חלקים של המקרה, לאסוף אותם ליד הגבול נפתח ולהסתובב איתם לצד הנגדי שבו הקלטת דו-צדדית יחזיק אותם. בסוף הקרע הגלמים יהיה כמעט "עירום", שרק חתיכה קטנה של התיק לסקר את הקצה האחורי.
הערה: מטרת להשאיר כמות קטנה של התיק סימטרית בקצה העליון נועד להבטיח שחרור חלק מהתיק אותן לשקופית עם קלטת דו-צדדית. ההיגיון העומד מאחורי פעולה זו היא כי אם תסיר מדי של התיק אתה מאוד להסתכן בפגיעה הגולם. לעומת זאת אם תסיר מעט מדי, הגולם לא בקלות יבוא חינם של התיק. - לדחוף למטה (עם מלקחיים) השארית של התיק. תנועה זו מעלה בקצה הקדמי של הגולם, ומאפשר גם בראש וגם החזה להישאר בעמדה מועדף לדבוק וכדי להעביר בשלב שלאחר מכן.
- קח שקופית חדשה עם סרט הדבקה דו-צדדי, היפוך זה גולם או שורה הגלמים. אנו ממליצים על ביצוע גישה זו על ידי התבוננות תנועות בסיועם stereomicroscope כדי למנוע שבירה של הגלמים.
- הקש מעט כדי להפוך את הגלמים לדבוק הקלטת, בעדינות והחלק את השקופית כדי להסיר את הגלמים משאר המקרים. היפוך השקופית למיקרוסקופ: הגלמים יהיה תקוע בצד הגבי ברמה של הראש שלהם / אזור בית החזה.
- מכסה כל הגלמים עירום עם 4% paraformaldehyde, לחכות 10 דקות. מניסיוננו, זו מאובדן זמן עם מקבע מסייע לשינוי מרקם של הקוטיקולה הפיכתה המשרד, פחות דביק, קל לטפל.
הערה: כדי לבצע את החילוץ חומצה ריבונוקלאית (RNA), paraformaldehyde תחליף עבור באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) עשה עם RNase ללא מים ולהסיר את הכנפיים הגולמי עושה חתך (בעזרת מספריים) ליד נקודת הציר של כל גפה. באמצעות מלקחיים, להעביר את הכנף הגולמי צינור microcentrifuge עם 1 מ"ל של ריאגנט guanidinium thiocyanate ופנול. לאחר איסוף סך של 50-80 כנפיים, לאחסן את הצינור microcentrifuge ב-80 מעלות צלזיוס עד ביצוע ה RNA החילוץ10,11. - עושים חתך קטן על האזור ציר של הזרוע או בקרבתה. לאפשר את מקבע להגיע האפיתל כנף. באמצעות פיפטה (p200) מיושרות מקבע מעל הכנף. בעת שטיפה החלף מזוהמים שמלמדות עם חדש. לאחר שטיפה, ממשיך האגף לשבועיים למשך 5 דקות.
הערה: למרות התמרון הזה עוזר לסלק את רוב רקמת מזהמים, כמה hemocytes, טיפות השמן יכול להישאר לכודים בין הרבדים אפיתל הגבי ו הגחון של האגף (ראה איור 1 א'). - דמעה עם מלקחיים מגבול לציפורן (כפי שמוצג בסרטון) מרחיבה את החור ועל הפעלת על שחרורו של האפיתל כנף מן הקרום לציפורן. ברגע הרקמה כנף הוא שוחרר, השאירו זה הפתרון paraformaldehyde להשלמת 30 דקות של קיבעון.
- להעביר את הכנפיים קבוע אחד נקוו 4 צלחת פלסטיק מלאים PBST (טריטון X-100 0.05%). חנות בן לילה ב 4 º C.
יום 3
3. ראשי נוגדן הדגירה.
- Permeabilize הרקמה המקננת הכנפיים הגולמי ב- PBST (טריטון X-100 0.2%) למשך 15 דקות באמצעות פלטפורמה נדנדה כדי להקל על תנועה בינונית נוזלי עדין.
הערה: עד הרכבה הדגימות, השלבים צריכה להתבצע באמצעות פלטפורמה נדנדה. - לחסום את הדגימות באמצעות PBSTA (BSA 3%, טריטון X-100 0.1%) לשעה.
- להשתמש המאגר אותו לדלל נוגדן ראשוני (העכבר אנטי-Ptc, בטחונות) של דגירה הכנפיים הגולמי בן לילה ב 4 º C.
יום 4
4. משני נוגדן הדגירה.
- שטיפת דגימות דקות 4 x 10 כל אחד עם PBST (טריטון X-100 0.05%)
- דגירה עם נוגדנים משניים (למשל, העכבר אנטי מצומדת כדי fluorochrome) מדולל על הריכוז המתאים ב- PBSTA (BSA 3%, טריטון X-100 0.1%) בטמפרטורת החדר בחושך, כבר שעתיים.
הערה: אם זה מתאים, השתמש 4', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) ו/או phalloidin כדי counterstain את הרקמה. הוסף רגשים אלו עם הנוגדן משני לוקח בחשבון את אורך הגל של פליטה של fluorochromes כדי למנוע את החפיפה של אותות. - שטיפת דגימות דקות 4 x 10 כל אחד עם PBST (טריטון X-100 0.05%)
5. הרכבה
- להכין מדגם שקופית על-ידי הצבת נקודות 4 של לק שקוף על השקופית מיקרוסקופ כאילו היו הקודקודים של ריבוע.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הפרוטוקול מציע שיטה פשוטה עבור קבלת דגימות כנף הגולמי לשמור המורפולוגיה מוכר של האגף. מן ההכנות הללו זה ניתן לקבל ערימות של תמונות יכול להיות מוקרן דו-ממדיים או תלת-ממד, לחקור הפצה ו/או ההעשרה של חלבונים במהלך הבידול של האגף. (ראה ההערה ב- 2.9) פרוטוקול דומה ניתן לאסוף גדול כנף הגולמי המדגם (50-80 מעורבים wings הגולמי) הדרושים כדי לסנתז חומצה deoxyribonucleic משלימים (cDNA), התבנית המשמשת ב- PCR תגובות.
איור 1 : קיפוד ג'ין מסלול ב דרוזופילה כנפיים הגולמי
(א) תוקנו, הקולטן הקנוני של מסלול הקיפוד, היה מדמיין ב 24-30 h APF באמצעות העכבר אנטי - Ptc. הגרעינים היו counterstained עם דאפי ואילו אקטין חוטים הם visualized באמצעות phalloidin של ירוק-פלורסנט. התפלגות אקטין מסייעת למקם כנף ורידים והקשר שלה עם ביטוי שתוקנה . באותו זמן, phalloidin הכתם מגלה הנוכחות של כמה hemocytes, טיפות השמן (עיגולים גדולים) כמו זיהום רקמות. 20 x הגדלה, הקדמי הוא למעלה. קנה המידה של בר, 100 מיקרומטר (B) Amplicons כדי אקטין (ליין 1, 280 bp) ו- ptc (ליין 2, 236 bp) התקבלו באמצעות cDNA synthetized מהדגימה כנף RNA שליח (mRNA) שנוצרו על-ידי פרוטוקול ניתוח דומה. MW, משקל מולקולרי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השיטה של דיסקציה המתואר בסרטון זה יכול לשמש כדי להכין דוגמאות באיכות גבוהה דרוזופילה כנפיים הגולמי של שלבי ההתפתחות השונים עבור סוגים רבים של טכניקות (למשל, immunofluorescence, cDNA סינתזה כדי מבחני ה-PCR, גופית ווינג פיתוח). במונחים של שיטה זו מעורב המדען השתמשו 24-30 h APF. עם זאת צריך להיות שום מכשול בתוך הפעולות החיוניות דיסקציה של גולם צעיר או מבוגר. שינויים ייתכן שיש לבצע כדי להכיל גולם שלב קטן יותר.
הפרוטוקול יכול להתבצע לנתח גולם אחד או מספר הגלמים באותו זמן. זה עוזר כדי להאיץ את התהליך להגיע אל מספר רב של כנפיים גזור להקל. במקרה זה יש אפשרות להסיר שורה של 4-5 הגלמים באותו זמן. באפשרותך להסיר את הגלמים ביחד או אם זה לא אפשרי, להמשיך להסיר בנפרד על גבי השקופית אותו (ראה סעיף III של הוידאו: "מרובים הגלמים לנתיחה"). כדי להסיר את הגולם עירום מהתיק שנפתח, חשוב כי הקצה האחורי הוא קטן מספיק. ניתן להסיר את התיק לחלוטין; למרות שזה העברת מהר יותר, הסרת התיק הוא מאתגר, ויש סיכון גדול יותר של פגיעה הגולם.
ניסיון מכתיבה זה תמרון חשוב לשקול לעזוב (את האחרון 2 h כדי להשלים את זמן פיתוח כאמור) הגולם קשור השקופית מיקרוסקופ בתוך החממה אך בחוץ את המבחנה. זו קפיצה הזמן עוזר לייבש את התיק לשבור להקל. עוד צעד קריטי במהלך ניתוח עבור אימונוהיסטוכימיה, היא לקלף את הקוטיקולה המכסה האפיתל כנף, ובכך מעניק גישה של הנוגדן השטח אגף שלם. שלב זה צריך להיעשות לאחר תיקון למשך מספר דקות (לפחות 5 דקות לאחר ביצוע החתך בנקודת הציר) כי מקבע מייצב הרקמות ומשנה את עקביות לציפורן, שהופך אותו קל יותר לקלף.
בעת ביצוע כל הצעדים אימונוהיסטוכימיה, ודא כי הכנפיים הן בתנועה מתמדת (נדנדה פלטפורמה). התנועה מסייעת לשפר את מחלף חדירה של הפתרונות במהלך שוטף, incubations. עם זאת, חשוב לבצע אותם בעדינות הימנעות המופע של עיוותים בלתי רצויה המורפולוגיה של מבנה שברירי זה (קרי, זה מספיק כי תנודות של פלטפורמת להזיז מעט את נוזלי המכיל בינוני הדגימות).
הליך זה מספק גישה משלימים שיטות שפורסם כבר כנף הגולמי לנתיחה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
ברצוננו להודות CSIC על התמיכה הכלכלית שגבה את הפרויקט, מריאנה פינטור Di לסיוע טכני שלה עם מיקרוסקופיה קונפוקלית; כדי חוסה Báez לאונרדו עבור תיקונים כתב היד שלו; כדי לוצ'יאנו קוראה על מסירותו ליצירתו של הוידאו; כדי Rosano נטליה שהשאלת את הקול שלה עבור הווידאו ואת מרכז מניות דרוזופילה בלומינגטון למתן את המניות השתמשו במחקר זה. Apa1 נגד monoclonal-Ptc שפותחה על ידי איזבל גררו שהושג מ התפתחותי מחקרים ליפידים הבנק (DSHB) תחת חסותה של NICHD ומתוחזק על ידי אוניברסיטת איווה, במחלקה למדעי הביולוגיה, איווה סיטי, IA 52242.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereomicroscope with cool light illumination | Nikon | SMZ1000 | |
| Rocking platform | Biometra (WT 16) | 042-500 | |
| Microscope slides | StarFrost | 8037/1 | |
| Cover glasses (24 x 32 mm) | Deltalab | D102432 | |
| Forceps | F.S.T | 11252-00 | |
| Scissors | Lawton | 63-1400 | |
| Multi-well plastic dish | Thermo Scientific | 144444 | |
| p100 or p200 pipette | Finnpipette (Labsystems) | 9400130 | |
| 1X PBS (Dulbecco) | Gibco | 21600-010 | |
| 4% paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| BSA | Bio Basic INC. | 9048-46-8 | |
| Glycerol | Mallinckrodt | 5092 | |
| Tris | Amresco | 497 | |
| TRIzol Reagent | Ambion | 15596026 | |
| DEPC treated water | MO.BIO | 17011-200 | |
| Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG (H+L), 2 mg/mL (working dilution 1/800) |
Invitrogen | A11030 | |
| Monoclonal anti-Ptc (Apa-1) 54 μg/mL (working dilution 1/100) |
Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | By Isabel Gerrero from DSHB under the auspices of the NICHD and maintained by The University of Iowa, Department of Biological Sciences, Iowa City, IA 52242. | |
| DAPI, 1 mg/mL (working dilution 1/5000) |
Invitrogen | 62248 | |
| Phalloidin conjugated to Alexa 488, 300 U/1.5 mL methanol (1/600 working dilution) |
Invitrogen | A12379 | |
| Canton S (fly stock) | Bloomington Drosophila Stock Center |
References
- Serrano, N., O'Farrell, P. H. Limb morphogenesis: connections between patterning and growth. Curr Biol. 7 (3), R186-R195 (1997).
- Blair, S. S. Compartments and appendage development in Drosophila. Bioessays. 17 (4), 299-309 (1995).
- Klein, T. Wing disc development in the fly: the early stages. Curr Opin Genet Dev. 11 (4), 470-475 (2001).
- Beira, J. V., Paro, R. The legacy of Drosophila imaginal discs. Chromosoma. 125 (4), 573-592 (2016).
- De Celis, J. F., Diaz-Benjumea, F. J. Developmental basis for vein pattern variations in insect wings. Int J Dev Biol. 47 (7-8), 653-663 (2003).
- Blair, S. S. Wing vein patterning in Drosophila and the analysis of intercellular signaling. Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 293-319 (2007).
- Bier, E. Drawing lines in the Drosophila wing: initiation of wing vein development. Curr Opin Genet Dev. 10 (4), 393-398 (2000).
- De Celis, J. F. Pattern formation in the Drosophila wing: The development of the veins. Bioessays. 25 (5), 443-451 (2003).
- Classen, A. K., Aigouy, B., Giangrande, A., Eaton, S. Imaging Drosophila pupal wing morphogenesis. Methods Mol Biol. 420, 265-275 (2008).
- Bolatto, C., et al. Spatial and temporal distribution of Patched-related protein in the Drosophila embryo. Gene Expr Patterns. 19 (1-2), 120-128 (2015).
- Zuniga, A., et al. Genes encoding novel secreted and transmembrane proteins are temporally and spatially regulated during Drosophila melanogaster embryogenesis. BMC Biol. 7, 61 (2009).
