Summary
正確にショウジョウバエのティッシュの成績証明書または蛋白質を検出する能力は、その豊かさとローカライズ開発プロセスに関連の勉強にとって重要です。ここ蛹翼を分析する簡単な手順の説明です。これらの翼は、いくつかのテクニック(免疫組織化学、PCR 法等)のサンプルとして使用できます。
Abstract
キイロショウジョウバエの翼の開発は、組織レベルでの形態形成を研究するための理想的なモデルです。これらの肢は、翅成虫原基萌芽期の開発の間に形成の名前セルのグループから開発します。幼虫の段階で成虫原基の成長、細胞の数の増加と単層上皮構造を形成します。蛹のケース内成虫ディスクはうち芽、翼の今後のマージンになりますラインに沿って二重に折る。このプロセス中には、縦 primodia 静脈静脈翼の将来の背側と腹側の表面に細胞を起源としています。蛹の段階で各表面の静脈細胞のストライプのタイトなチューブを生成するために通信します。同時にクロス静脈の形成を開始します。
適切な分子マーカーの助けを借りて、その開発中に翼を構成する主要な要素を識別することが可能です。このため、正確にこの構造体の成績証明書または蛋白質を検出する能力は、彼らの豊かさと翼の開発プロセスに関連するローカリゼーションを勉強するため重要です。
手順は、蛹の段階で翼を分析する方法の詳細な手順を提供して、蛹の翼を操作することに焦点を当ててを紹介します。蛹の組織の郭清は 3 齢幼虫での対応よりも難しくなります。これは、迅速かつ効率的な高品質なサンプルを取得するこの方法を開発した理由です。Immunostain とマウントする方法の詳細について蛋白質または細胞のコンポーネントの可視化できるように、これらの翼サンプルは、プロトコルで提供されます。少しの専門知識を持つ 8-10 高品質蛹翼を短時間で収集することが可能です。
Introduction
ショウジョウバエ羽翅成虫原基から開発されています。これらの翼のディスクの原初は、胚上皮から鞘に収めた 20 30 成虫細胞の小さなグループとして萌芽期の開発の間に脇に置きます。有糸分裂がディスク1,2,3、その数 (約 50000 細胞) を上げると翼を形成特性の特定の時間に成虫細胞に発生する幼虫が 3 令期に高まる一方 4。細胞の増殖、彼らの自己折りたたみコンパクトなスパイラルの結果、尿細管上皮をファッションします。蛹化、ディスク上皮は 2 層フォーム翼に望遠鏡を縦方向の静脈は、翼発達5,6の中に 2 回発生するそれらの間の腔として起動。
常に静脈の配列が同一のパターン;静脈形成内すべての変化を簡単に識別できる変異非常に目に見える (例えば行方不明または余分な静脈、静脈の位置等の変更。) になります。興味深いことに、表現型変化、通常知られているまたは新しいコンポーネント翼開発に関連するシグナルの突然変異の証拠です。位置の決定、静脈と intervein 地域を維持する役割を果たしている経路の 1 つはハリネズミ (Hh) 経路6,7,8です。
モデル システムとして蛹翅の重要性を考えると、それはで動作するように良い品質のサンプルを得ることが重要なります。過去には、ショウジョウバエのハネを解剖するためのプロトコルを公開している科学者実行可能なサンプルを達成するために適切なガイドを与えていません。研究者の指導なし 1 つ明確にプロセスを視覚化することはできません。これらの代替解剖アプローチの蛹は周囲の組織から分離すること、2 つの翼に分割、瓦礫の撤去には繰り返し洗浄します。この種類の自由の翼を残す方法クレームの汚染しますが、以前の経験のために、処理が遅くなります、壊れやすい翼9の構造を損なうことのより高いチャンスがあります。
ここで説明する手順は、蛹翅サンプルの特定の蛋白質や謄本バイオアセッテイ プロトコルまたはポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) の試金を使用しての検出に適してを取得する高速かつ効率的な方法を見つけるための需要によって開発されました。式およびパッチ適用 (Ptc または Hh 経路の正規受容体) のローカリゼーション、これを説明するためにが正常に完全なを実行する関連する詳細情報を含むプロトコルを提供する蛹翅のサンプルで検出されました。プロシージャ。
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Protocol
日 1
1. 収集と養殖の蛹。
- 培養瓶からウェット絵筆を使用して前蛹や蛹殻形成過程 (APF) 後 0 h を削除し、開発期間をほぼ完全に新しい瓶にそれらを置く (2.1 および 2.2 を参照)。
注:養殖の標準プロトコルを使用して、ハエの健全な人口を維持しなければなりません。卵がレイアウトは、3 つまたは 4 日後、大人は個人の最適な開発を許可するバイアルから削除できます。3 齢幼虫が蛹化を開始するまで、彼らは一定の温度に保たれます。幼虫/蛹の転移は 0 h APF を考慮イラガ前蛹の形成によってマークされます。イラガ前蛹は、前気門を突出の円形、長方形には不動の白い幼虫です。
日 2
2. 転送、郭清と固定。
- 転送 (2 h 開発時間が前に完了) 蛹、絵筆に両面テープを顕微鏡スライドを遵守。背側面と頭部を持つ行が同じ方向を向いて終了フォームに蛹を配置します。
- 顕微鏡スライドを一定の温度に戻り、蛹 (すなわち24 30 h APF) 適切な発達時期を完了するを許可します。
注:両面テープで顕微鏡スライドを蛹の場合 (下記参照) を削除する一時的な郭清のプラットフォームとなります。(バイアル) 外顕微鏡スライドの時間の経過は、鉗子で簡単に壊れやすい、蛹のケースを乾燥するのに役立ちます。 - 鉗子を使用して蛹のケースから、蓋を取り外します。
- (ビデオで示すように)、鉗子で箱を壊す尾末に蛹の側面に沿って行を作るします。適切な照明と蛹の翼のヒンジのすぐ上の領域を明らかになり蛹の内部形状を検出することが可能です。このスペースは、蛹を傷つけることがなく、開口部を実行するためのガイドとして機能します。
- 開いた枠でそれらを拾い、両面テープがそれらを保持する反対側にそれらを運ぶケースの部分を削除します。解剖の終わりに蛹はほとんど「裸」、ケースの小さい部分だけをカバーする後部のヒントになります。
注: 上部の尾側端の場合の少量を残しての目的は、両面テープでスライドにケースからスムーズなリリースを確保するためです。このアクションの背後にある理由ですのであまりにも多くを削除するかどうかはケースの蛹を損傷大幅リスクします。その一方であまりを削除する場合蛹簡単に来ないケースの無料。 - 場合の残りの部分 (鉗子) と押し下げます。この動きは、頭と胸部に従うと後続の手順で転送する優先位置にとどまること、蛹の前端を発生します。
- 両面テープで新しいスライドを取るし、蛹や蛹の行にそれを反転します。蛹の破損を防ぐために顕微鏡の助けを借りて運動を観察することによってこのアプローチを実行することをお勧めします。
- 蛹のテープに固執し、場合の残りの部分から、蛹を取除くためにスライドがゆるやかに少し押します。顕微鏡のスライドを反転: 蛹は自分の頭のレベルで背側に立ち往生されます/胸部領域。
- 4% パラホルムアルデヒドですべての裸蛹をカバーし、10 分を待ちます。我々 の経験で定着剤と時間のこの経過はしっかり、少ない粘着性と扱いやすいキューティクルの一貫性を変更するのに役立ちます。
注:リボ核酸 (RNA) の抽出を実行するには、RNase で作られたリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) の代替パラホルムアルデヒドは無料の水、各肢のヒンジ ポイント近く (はさみ借りて) カットを作り蛹の翼を取り外します。鉗子を使用して、ためチオシアン酸とフェノール試薬 1 mL の微量遠心チューブに蛹翅を転送します。50 80 羽の合計を収集した後に、RNA 抽出10,11を実行するまで-80 ° C で遠心チューブを格納します。 - またはその近くに翼のヒンジ領域で小切開を行います。翼上皮に到達する定着剤を許可します。ピペット (p200) フラッシュ定着性を使用して、翼の上。フラッシュを交換するタイミング、汚染された新たにこだわる。フラッシュ後、に 5 分間漬けます翼を維持します。
注:この演習は汚染組織の大半を離れてオフに役立ちますが、いくつかの血液細胞と脂肪滴は翼の背側と腹側の上皮層の間に閉じ込められて残ることができる (図 1A参照)。 - (ビデオで示すように)、キューティクル国境から鉗子で涙穴を拡大し、表皮嚢から翼上皮のリリースを有効にします。翼の組織をリリースすると、一度は、固定の 30 分を完了するパラホルムアルデヒド溶液中残します。
- 1 pbst; 満ちている 4 流したプラスチックの皿に固定翼を転送 (トリトン X-100 0.05%)。4 ° C で一晩ストア
日 3
3. 一次抗体の孵化。
- PBST で蛹の翼の培養組織を permeabilize (トリトン X-100 0.2%) 穏やかな液体中の動きを容易にする揺動のプラットフォームを使用して 15 分。
注:サンプルをマウントするまでロッキング プラットフォームを使用して手順を実行する必要があります。 - PBSTA を使用してサンプルをブロック (BSA 3%、トリトン X-100 0.1%) 1 時間。
- 同じバッファーを使用して一次抗体 (マウス抗-Ptc は、1: 100) を希釈し、4 ° C で一晩蛹の翼を孵化させなさい
日 4
4. 二次抗体の孵化。
- 洗浄サンプル 4 × 10 の分を各 PBST (トリトン X-100 0.05%)
- (例えば、抗マウス螢光色素に共役) 二次抗体とインキュベート PBSTA で適切な濃度に希釈して (BSA 3%、トリトン X-100 0.1%) 室温 2 時間、暗闇の中で。
注:それが適切な場合、組織を counterstain に 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) やファロイジンを使用します。これらのプローブを信号の重なりを防ぐために蛍光色素の発光波長を考慮して二次抗体に追加します。 - 洗浄サンプル 4 × 10 の分を各 PBST (トリトン X-100 0.05%)
5. 取付
- 彼らは正方形の頂点であるかのように、顕微鏡スライドの透明なマニキュアの 4 ドットを配置することによってサンプル スライドを準備します。
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Representative Results
プロトコルでは、翼のおなじみの形態を保持する蛹翅試料の採取の簡単な方法を提供しています。これらの製剤から 2-d または 3-D、配布または翼の分化タンパク質の濃縮を調査として投影できる画像のスタックを取得することが可能です。同様のプロトコル (2.9 の注を参照) は、相補的デオキシリボ核酸 (cDNA) の PCR の反作用で使用されるテンプレートを合成に必要な大型の蛹ウイング サンプル (50 80 蛹翼を含む) を収集するために使用できます。
図 1: ヘッジホッグ経路遺伝子ショウジョウバエ蛹の翼
(A)パッチを適用、ヘッジホッグ経路の正規の受容体は 24-30 h APF で可視化した使用マウス抗-Ptc。 核された counterstained DAPI とアクチン フィラメントが緑色蛍光ファロイジンを用いて可視化するのに対し。アクチンの分布翼静脈やパッチ式との関係をローカライズすることができます。同時にファロイジン染色は、いくつかの血液細胞と脂肪滴 (大きい円) として組織を汚染の有無を明らかにします。20 倍の倍率、前方です。バー、100 μ m (B)スケールアクチンAmplicons (レーン 1、280 bp)、 ptc (レーン 2, 236 bp) と同様の解剖のプロトコルによって生成されたメッセンジャー RNA (mRNA) 翼のサンプルから cDNA synthetized を使用して得られました。MW、分子量。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
郭清はこのビデオで説明されているメソッドを使用して、技術の多くの種類の別の開発段階からショウジョウバエ蛹翼の高品質なサンプルを準備できます (例えば、蛍光抗体法、PCR の試金、cDNA 合成in vitro における翼の開発)。このメソッドの面で関与する科学者は 24-30 h APF を使用しています。しかし若いまたは古い蛹の郭清に不可欠なステップ以内の障害はないはず。変更は、小さいステージ蛹を対応するために行われる必要があります。
プロトコルは、同時に 1 つの蛹またはいくつかの蛹を解剖する実行でした。これは解剖の翼の数が多いに到達しやすく、プロシージャを加速するのに役立ちます。ここでは同時に 4-5 蛹の行を削除するオプションがあります。蛹を一緒に削除するか、それが可能でない場合は同じスライドを個別に削除する続けます (ビデオの第三節を参照してください:「複数の蛹解剖」)。ケースが開けから裸蛹を削除するには、後部の先端が十分に小さいことが重要です。それは完全の場合に削除することが可能転送を速くすると、全体のケースの取り外しに挑戦、蛹の損傷のリスクが高まります。
経験を考慮する重要な操縦方法は (規定開発時間を完了する最後の 2 h) のまま、おもむくまま蛹が孵化器の中が、バイアルの外の顕微鏡スライドに接続されています。この経過時間は、中断しやすく乾燥に役立ちます。免疫組織の解剖時にもう一つの重要なステップはそれにより全体の翼表面に抗体のアクセス権の付与、翼上皮をカバーするキューティクルをはがす。数分 (ヒンジ ポイントに切開を行った後、少なくとも 5 分) を修正した後、この手順を行う必要がありますので、固定液が組織を安定化、キューティクルの一貫性を変更しやすく皮をむく。
免疫組織化学のすべての手順を実行している間、翼 (ロッキング プラットフォーム) 一定の動きで、ようにしましょう。動きは、インターチェンジおよび洗浄および孵化中に解決策の浸透を改善するのに役立ちます。それにもかかわらず、優しくこの脆弱な構造を (すなわち、それはプラットフォームの振動は、液中に少し移動すること十分な形態に好ましくない歪みの発生を回避できることが重要です。サンプル)。
この手順は、既に出版された蛹翅郭清法を代替と補完的なアプローチを提供します。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
CSIC マリアナ ・ ディ ・ Doménico の共焦点顕微鏡と彼女のテクニカル サポートをこのプロジェクトに与えられた財政援助のために感謝したいと思いますホセ レオナルドあった彼の原稿の修正; のためにルチアーノ ・ コレア、ビデオの作成に彼の献身のために貸出ビデオのための彼女の声と本研究で使用される株式を提供するブルーミントンショウジョウバエストック センターのナタリア Rosano。イザベル ゲレロによってモノクローナル抗 ptc Apa1 は、発育の後援の下から発達研究ハイブリドーマ銀行 (DSHB) が取得・保有アイオワの大学、生物科学専攻、アイオワ ・ シティ、IA 52242。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereomicroscope with cool light illumination | Nikon | SMZ1000 | |
| Rocking platform | Biometra (WT 16) | 042-500 | |
| Microscope slides | StarFrost | 8037/1 | |
| Cover glasses (24 x 32 mm) | Deltalab | D102432 | |
| Forceps | F.S.T | 11252-00 | |
| Scissors | Lawton | 63-1400 | |
| Multi-well plastic dish | Thermo Scientific | 144444 | |
| p100 or p200 pipette | Finnpipette (Labsystems) | 9400130 | |
| 1X PBS (Dulbecco) | Gibco | 21600-010 | |
| 4% paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| BSA | Bio Basic INC. | 9048-46-8 | |
| Glycerol | Mallinckrodt | 5092 | |
| Tris | Amresco | 497 | |
| TRIzol Reagent | Ambion | 15596026 | |
| DEPC treated water | MO.BIO | 17011-200 | |
| Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG (H+L), 2 mg/mL (working dilution 1/800) |
Invitrogen | A11030 | |
| Monoclonal anti-Ptc (Apa-1) 54 μg/mL (working dilution 1/100) |
Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | By Isabel Gerrero from DSHB under the auspices of the NICHD and maintained by The University of Iowa, Department of Biological Sciences, Iowa City, IA 52242. | |
| DAPI, 1 mg/mL (working dilution 1/5000) |
Invitrogen | 62248 | |
| Phalloidin conjugated to Alexa 488, 300 U/1.5 mL methanol (1/600 working dilution) |
Invitrogen | A12379 | |
| Canton S (fly stock) | Bloomington Drosophila Stock Center |
References
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