Methodenartikel

Chemo-enzymatische Synthese von N- Glykanen für Array-Entwicklung und HIV-Antikörper-Profiling

DOI:

10.3791/55855

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5. Februar 2018

 ,  ,  , 
1Genomics Research Center, Academia Sinica

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Ein modularer Ansatz für die Synthese von N- Glykanen zur Befestigung an einer Aluminiumoxid-beschichtete Glas schieben (ACG Folie) wie ein Glycan Microarray entwickelt wurde und seine Verwendung für die Profilerstellung für eine HIV weitgehend neutralisierende Antikörper nachgewiesen.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir präsentieren Ihnen eine hocheffiziente Weise für die schnelle Zubereitung einer breiten Palette von N-verknüpft Oligosaccharide (schätzungsweise um 20.000 Strukturen zu überschreiten), die auf menschlichen Glykoproteinen weit verbreitet sind. Um die gewünschte strukturelle Vielfalt zu erreichen, begann die Strategie mit der Chemo-enzymatische Synthese der drei Arten von Oligosaccharyl Fluorid Module, gefolgt von ihrer schrittweisen α-selektive Glykosylierungen an der 3-O und 6-O der Positionen der Mannose-Reste von den gemeinsamen Kern Trisaccharide haben eine entscheidende β-Mannoside-Verbindung. Anbei zeigen wir weitere N- Glykane auf die Oberfläche einer Aluminiumoxid-beschichtete Glas (ACG) Folie erstellen Sie eine kovalente gemischte Anordnung für die Analyse von Hetero-Ligand Interaktion mit einem HIV-Antikörper. Geben Sie insbesondere das Bindungsverhalten von ein neu isolierte HIV-1 im großen und ganzen neutralisierende Antikörper (bNAb), PG9, zur Mischung von eng beieinander liegenden Mann5GlcNAc2 (Mensch5) und 2,6-di-Sialylated Bi-antennary N- Glycan (SCT ) auf eine ACG-Array, öffnet sich einen neuen Weg um das effektive Immunogen Design für HIV-Impfstoff-Entwicklung führen. Darüber hinaus verkörpert unsere ACG-Array ein mächtiges Werkzeug um andere HIV-Antikörper für Hetero-Liganden Bindungsverhalten zu studieren.

Einleitung

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N- Glykane auf Glykoproteine sind kovalent das Asparagin verbunden (Asn) Rückstände von den Konsens Asn-Xxx-Ser/Thr Sequon betreffen mehrere biologische Prozesse wie Protein-Konformation, Antigenität, Löslichkeit und Lektin-Anerkennung 1 , 2. die chemische Synthese von N-verknüpften Oligosacchariden repräsentiert eine synthetische Herausforderung wegen ihrer großen strukturellen Mikro Heterogenität und stark verzweigte Architektur. Sorgfältige Auswahl des Schutzes Gruppen Tune Reaktivität der Bausteine, Selektivität in Anomeric Zentren und ordnungsgemäße Verwendung der Projektträger zu erreichen / Activator(s) sind Schlüsselelemente in der Synthese von komplexen Oligosaccharide. Um diese Komplexität zu lösen, wurde eine große Menge an Arbeit, N- Glycan Synthese voraus berichtet vor kurzem3,4. Trotz dieser robusten Ansätze finden eine effektive Methode für die Herstellung einer breiten Palette von N- Glykanen (~ 20.000) bleibt eine große Herausforderung.

Die schnellen Mutationsrate von HIV-1, die umfangreiche genetische Vielfalt und seine Fähigkeit zur Flucht aus neutralisierende Antikörper-Reaktion, zu erreichen ist eine der größten Herausforderungen zu entwickeln, einen sicheren und prophylaktischen Impfstoff gegen HIV-1-5,6 , 7. eine wirksame Taktik, die HIV verwendet, um die Host-Immunantwort zu vermeiden ist die post-translationalen Glykosylierung der Umschlag Glykoprotein gp120 mit einem vielfältigen N-Glykane abgeleitet vom Host Glykosylierung Maschinen8, verbunden 9. Ein kürzlich veröffentlichter Bericht über die genaue Analyse von rekombinanten Monomeren HIV-1 gp120 Glykosylierung von menschlichen embryonalen (HEK) 293T Nierenzellen schlägt das Auftreten von strukturellen Microheterogeneity mit einer charakteristischen zellspezifische Muster10 , 11 , 12. daher die Glycan Besonderheiten der HIV-1-bNAbs erfordert gut charakterisierten gp120 Verständnis im Zusammenhang mit N- Glycan Strukturen in einer Menge, die ausreicht für die Analyse.

Die Entdeckung von Glycan-Microarray-Technologie zur Verfügung gestellt hohe Durchsatz-basierte Exploration Besonderheiten der unterschiedlichsten Kohlenhydrat-bindende Proteine, Viren/Bakterien Adhesins, Giftstoffe, Antikörper und Lectines13,14 . Die systematische Glykane Anordnung in einem angeordneten Chip-basierten Format könnte problematisch geringe Affinität Protein-Glycan Interaktionen durch multivalente Präsentation15,16,17,18bestimmen. Diese Chip-basierte Glycan Anordnung scheint bequem effektiv Zell-Zell-Schnittstellen zu imitieren. Um die Technologie zu bereichern und überwinden die ungleichmäßige Problem mit herkömmlichen Array Formate, entwickelt unsere Gruppe vor kurzem eine Glycan-Array auf eine Aluminiumoxid-beschichtete Glas (ACG) Folie mit phosphonic Acid-ended Glykoproteinen, um die Signalstärke zu verbessern, Homogenität und Empfindlichkeit19,20.

Um den Stand der Erkenntnisse über Glycan Epitope neu isolierte HIV-1 breit neutralisierenden Antikörpern (bNAbs) zu verbessern, haben wir eine hocheffiziente modulare Strategie für die Herstellung einer breiten Palette von N-Glykanen21 verbunden ,22 Drucken auf eine ACG schieben (siehe Abbildung 1). Spezifität Profile Studien von HIV-1-bNAbs auf eine ACG-Reihe angeboten, dass die ungewöhnliche Erkennung von Hetero-Glycan Bindungsverhalten von hochpotenten bNAb PG9, die von HIV isoliert wurde Personen23,24,25infiziert.

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Protokoll

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1. Vorbereitung des D1/D2 Arm Module22

  1. Vorbereitung der Mittelstufe 2
    1. Wiegen, Werkstoff- 1 (siehe Abbildung 2, p-methoxyphenyl-O-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-D-mannopyranoside (100 mg, 0.204 Mmol)) in einem 15 mL Tube ab und lösen sich in Tris Puffer (25 mM, pH 7,5) mit Mangan Paraquatdichlorid (MnCl2, 10 mM), um eine endgültige Glycan-Konzentration von 5 mM zu erreichen.
    2. Fügen Sie 2 Äquivalente von Uridin-diphosphat-Galaktose (UDP-Gal).
    3. 150 Einheiten des Enzyms β-1, 4 Galactosyl Transferasen aus bovine Milch hinzufügen und die Mischung bei 37 oC für 15 h inkubieren.
    4. Nach 15 h, führen Dünnschichtchromatographie (TLC) Gesamtverbrauch des Ausgangsmaterials durch spotting das Reaktionsgemisch auf einer TLC Platte an, entwickeln mit n-Butanol/Essigsäure Säure/Wasser (H2O) mit einem 1:1:1 Verhältnis und Fleckenbildung durch eine Lösung von 0,25 M Cerium Ammonium Molybdat gefolgt von Heizung. Dann die Reaktion durch Erhitzen auf 90 oC für 5 min zu stillen.
    5. Das Reaktionsgemisch mit einer Geschwindigkeit von 2.737 x g für 3 min Zentrifugieren, und laden Sie den Überstand an der Spitze der Säule Polyacrylamid-Gel (siehe Tabelle der Materialien). Eluieren der Spalte, die Verwendung von destilliertem deionisiertes Wassers, und sammeln Sie das Produkt mit Bruchteilen von 1-2 mL.
    6. Überwachen der gesammelten Fraktionen von TLC26, entwickeln mit n-Butanol: H2o: Essigsäure mit einem 1:1:1 Verhältnis und Fleckenbildung durch eine Lösung von Cerium Ammonium Molybdat gefolgt von Heizung. Lyophilize27 das Produkt mit Fraktionen zu Mittelstufe 2 (115 mg, 86 %) als weißes Pulver. Das Produkt durch NMR28 und Massenspektroskopie29 (siehe zusätzliche Datendatei) zu charakterisieren.
  2. Vorbereitung der Mittelstufe 3
    1. Wiegen ab Material 2 (siehe Abbildung 2, p-methoxyphenyl-O-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-D-mannopyranoside (80 mg, 0,122 Mmol)) in einem 15 mL-Tube und in Tris auflösen Puffer (25 mM, pH 7,5) enthaltenden MnCl2 (10 mM) zur Vorbereitung einer endgültigen Glycan-Konzentration von 5 mM.
    2. Fügen Sie 2 Äquivalente Guanosin-5'-Diphospho-β-L-Fucose Binatrium-Salz (BIP-Fuc).
    3. Hinzufügen von 150 Einheiten des Enzyms α-1, 3 Fucosyl Transferasen von Helicobacter Pylori (Hp1-3FTΔ26695) und inkubieren Sie die Mischung bei 37 oC für 15 h.
    4. Folgen Sie den Schritten 1.1.4.
    5. Folgen Sie den Schritten 1.1.5.
    6. Folgen Sie Schritt 1.1.6 Mittelstufe 3 (82 mg, 84 %) erhalten als weißes Pulver. Das Produkt von NMR und Massenspektroskopie (siehe zusätzliche Datendatei) zu charakterisieren.
  3. Vorbereitung der Module 4 und 5
    1. Wiegen Sie zusammengesetzte 2, p-methoxyphenyl-O-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-D-mannopyranoside (0,230 g, 0.360 Mmol) oder zusammengesetzte 3, p- Methoxyphenyl-O-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-[α-L-fucopyranosyl-(1→3)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-α-D-mannopyranoside (0,100 g, 0,125 Mmol) in ein 25 mL Einzel-Hals Rundboden Kolben und unter Vakuum für 30 min trocknen.
    2. Entfernen Sie die Flasche aus Vakuum, füllen Sie ihn mit Stickstoffgas hinzufügen eine magnetische Stir Bar, cap es mit einem Gummiseptum und legen einen Stickstoff-Ballon.
    3. Injizieren Sie 7 mL trockenem Pyridin und 3 mL Essigsäureanhydrid (Ac2O) in die Küvette in einem Eisbad auf 0 oC. Rühren die daraus resultierende Reaktion für 12 h bei Raumtemperatur mit einem Magnetrührer bei 600-700 u/min gebracht. Verdunstet das Lösungsmittel mit einem Rotary Verdampfer mit einem Vakuum Druck von 0 - 10 Mbar bei 50 oC.
    4. Verdünnen Sie die krude Mischung mit 30 mL Dichlormethan (DCM) und extrahieren mit gesättigten wässrigen Natrium-Hydrogencarbonat (Nahco33) (2 x 20 mL) in ein 50 mL separatory Trichter.
    5. Extrahieren Sie erneut die wässrige Schicht mit DCM (3 x 15 mL) und die kombinierten organischen Schichten über Natriumsulfat getrocknet. Das Natriumsulfat durch Filtration entfernen und waschen mit DCM (5 mL). Verdampfen des Lösungsmittels über einen Drehverdampfer am 400 Mbar Unterdruck bei 40 oC.
    6. Laden Sie die Projektmappe krude Mischung in 2 mL von DCM auf dem Silizium-Bett.
    7. Eluieren Sie die Spalte mit ein Gemisch mit Toluol und Aceton von 0 - 20 % Aceton in Toluol und sammeln Sie Bruchteile von 5-10 mL.
    8. Überwachen Sie die gesammelten Fraktionen von TLC (Schritte 1.1.4 und 1.1.6), entwickeln mit Toluol/Aceton (7/3), und mit einer Lösung aus Cerium Ammonium Molybdat Färbung durch Erhitzen auf einer heißen Platte gefolgt.
    9. Verdunsten Sie das Produkt mit Fraktionen mit einem Drehverdampfer, um gewünschte Produkte wie weißer Schaum in 72 % und 85 % Ertrag, bzw. zu erhalten.
    10. Die Produkte in 7 mL Acetonitril auflösen: Toluol: H2O in einem 4:2:1 Verhältnis in ein 25 mL Rundboden Kolben.
    11. Fügen Sie beim Abkühlen auf 0 oC mit einem Eisbad Cerium Ammoniumnitrat (2 Äquivalente hinzu). Rühren Sie die Reaktion bei Raumtemperatur für 3 h bei ~ 500-800 u/min.
    12. Nach TLC Gesamtverbrauch des Ausgangsmaterials angibt (TLC entwickeln mit Toluol/Aceton (7/3) und Visualisierung von UV-Absorption bei 254 nm oder durch Färbung mit einer Lösung aus Cerium Ammonium Molybdat gefolgt von Heizung), verdünnen das Reaktionsgemisch mit Ethylacetat (30 mL) und Extrakt mit H2O (15 x 2 mL).
    13. Extrahieren Sie die kombinierten organischen Schichten mit 5 mL der gesättigten Natriumchlorid (NaCl)-Lösung.
    14. Verdampfen des Lösungsmittels über einen Drehverdampfer am 240 Mbar Unterdruck bei 40 oC.
    15. Laden Sie die Projektmappe Rohprodukt in 2 mL von DCM auf dem Silizium-Bett. Eluieren Sie die Spalte mit ein Gemisch mit Toluol und Aceton (0 - 20 % Aceton in Toluol) und sammeln Sie Bruchteile von 5-10 mL. Überwachen Sie die gesammelten Fraktionen von TLC, entwickeln mit Toluol/Aceton (7/3).
    16. Verdunsten Sie die Produkt-haltige Fraktionen mit einen Drehverdampfer auf 77 Mbar Unterdruck und 40 oC, gewünschte Produkte als weißer Schaum zu bekommen.
    17. Lösen sich die entsprechenden Alkohole in 10 mL von DCM in einer 25 mL Einzel-Hals Rundboden Kolben und kühl bis-30 oC.
    18. Fügen Sie Diethylaminosulfur Trifluoride (DAST, 2 Äquivalente). Rühren Sie die Reaktionsmischung bei-30 oC 2 h.
    19. Nach TLC Verbrauch zeigt des Ausgangsmaterials (TLC entwickeln mit Toluol/Aceton (4/1) und Visualisierung von UV-Absorption bei 254 nm oder durch Färbung mit einer Lösung aus Cerium Ammonium Molybdat gefolgt von Heizung), verdünnen Sie das Reaktionsgemisch mit DCM (30 mL) , und waschen mit gesättigten Nahco33 (15 x 2 mL).
    20. Extrahieren der kombinierten organischen Schicht mit 5 mL gesättigte NaCl-Lösung, trocknen Sie es durch Hinzufügen von wasserfreiem Magnesiumsulfat, Filtern Sie das Gemisch nach Waschen mit DCM (5 mL) und sammeln es in einem 100 mL Einzel-Hals Rundboden Kolben.
    21. Verdampfen des Lösungsmittels über einen Drehverdampfer am 400 Mbar Unterdruck bei 40 oC.
    22. Laden Sie die Projektmappe Rohprodukt in 2 mL DCM auf dem Silizium-Bett. Eluieren Sie die Spalte mit einer Mischung aus Toluol und Aceton (0-20 % Aceton in Toluol) und sammle Bruchteile von 5-10 mL.
    23. Überwachen Sie die gesammelten Fraktionen von TLC, entwickeln mit Toluol/Aceton (7/3).
    24. Verdampfen Sie das Produkt mit Fraktionen mit einem Drehverdampfer um Wunschprodukte 4, [2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-3,4,6- O-Triacetyl-α-D-Mannopyranosyl Fluorid (54 % über 2 Stufen) und 5, [2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[2,3,4-O-triacetyl-α-L-fucopyranosyl-(1→3)-3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)- 3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl Fluorid (67 % über 2 Stufen) als weißer Feststoff.
    25. Das Produkt von NMR und Massenspektroskopie (siehe zusätzliche Datendatei) zu charakterisieren.

2. Vorbereitung des Glycan 10

  1. Vorbereitung der Intermidiate 7
    1. Silber triflate (AgOTf) (0,039 g, 0.155 Mmol), bis(cyclopentadienyl)hafnium(IV) Paraquatdichlorid (Cp2HfCl2) (0,041 g, 0,108 Mmol) in einen 25-mL Einzel-Hals Rundboden Kolben wiegen, im Schlenk Linie Vakuum für 30 min trocknen, entfernen Sie es aus der Vakuum, und füllen Sie ihn mit Stickstoffgas.
    2. Die frisch getrockneten 4 Å Molekularsiebe (0,2 g) in den Kolben mit der AgOTf und Cp2HfCl2zu übertragen, fügen Sie eine magnetische Stir Bar cap mit dem Septum sofort und Hinzufügen A Stickstoff Ballon.
    3. Übertragen Sie 3 mL trockener Toluol in den Kolben mit einem trockenen Glasspritze. Rühren Sie das Reaktionsgemisch für 1 h bei Raumtemperatur und dann abkühlen auf 0 oC.
    4. Injektion einer Lösung von Geber 4 (Abbildung 2, 0,043 g, 0.046 Mmol) und Akzeptor- 6, 5-Azidopentyl-O-2-O-acetyl-4,6-O-benzylidine-β-D-mannopyranosyl-(1→4)-O-(3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy) Carbonylamino-β-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O-3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy)carbonylamino-β-D-glucopyranoside (Abbildung 3, 0,045 g, 0.031 Mmol) in 3 mL Toluol in den Kolben durch das Septum mit einer 10 mL Spritze auf 0 o C. Rühren Sie die Reaktionsmischung bei Raumtemperatur für 3 h.
    5. Nach TLC Verbrauch zeigt der Ausgangsstoffe (TLC, mit DCM/Aceton (8,5/1.5) entwickeln und visualisieren von UV-Absorption bei 254 nm oder durch Färbung mit einer Lösung aus Cerium Ammonium Molybdat gefolgt von Heizung), die Reaktion durch Injektion 10 zu stillen Äquivalente Triethyl Amin.
    6. Filtern Sie der Molekularsiebe durch eine Celite-Bett in einem 50 mL Runde Talsohle Kolben, und weiter mit 10 mL Ethylacetat waschen. Extrahieren Sie die kombinierten organischen Schichten mit einer gesättigten Lösung von wässrigen Nahco33 (2 x 20 mL) in einem 50 mL separatory Trichter. Die wässrige Schicht mit Ethylacetat (3 x 15 mL) zu extrahieren.
    7. Extrahieren Sie die kombinierten organischen Schichten mit gesättigte NaCl-Lösung (5 mL), trocknen Sie es mithilfe von wasserfreiem Magnesiumsulfat, Filtern Sie das Gemisch zum Entfernen der Magnesium-Sulfat, waschen mit Ethylacetat (3 x 15 mL) und das Filtrat in einem 100 mL Runde Talsohle Kolben zu sammeln.
    8. Verdampfen des Lösungsmittels über einen Drehverdampfer am 240 Mbar Unterdruck bei 40 oC.
    9. Laden Sie die Projektmappe Rohprodukt in DCM oben auf der Silica-Bett-Spalte. Eluieren Sie die Spalte mit ein Gemisch mit DCM und Aceton (0-10 % Aceton in DCM) und sammeln Sie Bruchteile von 5-10 mL.
    10. Überwachen Sie die gesammelten Fraktionen von TLC, entwickeln mit DCM/Aceton (8,5/1.5). Verdunsten Sie die Fraktionen mit Produkt mit einem Drehverdampfer um zu erhalten Intermidiate 7, 5-Azidopentyl-O-{[2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-[ 3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl]}-(1→3)-[2-O-acetyl-4,6-O-benzylidine-β-D-mannopyranosyl-(1→4)-O-(3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy)carbonylamino-β-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O-3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-( 2,2,2-Trichloroethoxy) Carbonylamino-β-D-Glucopyranoside (0,052 g, 70 %), als weißer Schaum.
    11. Das Produkt von NMR und Massenspektroskopie (siehe zusätzliche Datendatei) zu charakterisieren.
  2. Vorbereitung der Intermidiate 8
    1. Hexasaccharide 7 (Abbildung 3, 0,040 g, 0,016 Mmol) in einen 25-mL Einzel-Hals Rundboden Kolben wiegen, unter Vakuum für 1 h trocknen Vakuum entfernen, füllen Sie ihn mit Stickstoffgas, fügen Sie eine magnetische Stir Bar und cap es mit einem Gummiseptum.
    2. Übertragen Sie 3 mL Acetonitrile:methanol (MeOH) (Verhältnis 2:1) in den Kolben.
    3. Fügen Sie p-Toluol Sulfonsäure-Monohydrat (0,001 g, 0,008 Mmol) in den Reaktionskolben und rühren die Reaktion bei 800 u/min für 5 h.
    4. Nach TLC Wasserbedarf des Ausgangsmaterials angibt (TLC, mit DCM/Aceton (8,5/1.5) entwickeln und visualisieren von UV-Absorption bei 254 nm oder durch Färbung mit einer Lösung aus Cerium Ammonium Molybdat gefolgt von Heizung), die Reaktion durch Injektion 10 zu stillen Äquivalente Triethyl Amin.
    5. Verdunstet das Lösungsmittel mit einem Drehverdampfer bei 337 Mbar Unterdruck bei 40 oC.
    6. Lösen Sie die krude Mischung mit etwa 2 mL der DCM auf und laden Sie sie auf dem Bett Kieselsäure.
    7. Eluieren Sie die Spalte mit einer Mischung aus DCM und Aceton (0 - 10 % Aceton in DCM) und sammle Bruchteile von 5-10 mL. Überwachen Sie die gesammelten Fraktionen von TLC, entwickeln mit DCM/Aceton (8,5/1.5). Verdampfen des Lösungsmittels über einen Drehverdampfer an 400 Mbar Unterdruck und 40 oC.
    8. Trocknen Sie die Rückstände unter vermindertem Druck zu mittleren 8, 5-Azidopentyl-O-(2-O-acetyl-3,4,6-tri-O-benzyl-ced pressure to give →3)-2-O-Acetyl-4, 6-O-Benzylidine-β - D - Mannopyranosyl-(1→4) - O-(3,6- di-O-benzyl-2-deoxy-2-phthalimido-β-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O-3,6 - di-O-benzyl-2-deoxy-2-phthalimido-nzyl-2-deoxy-2-phth. (Abbildung 3, 0,022 g, 57 %) als ein weißer Feststoff. Das Produkt von NMR und Massenspektroskopie (siehe zusätzliche Datendatei) zu charakterisieren.
  3. Vorbereitung der Intermidiate 9
    1. Vorbereitung der Intermidiate 9 (Abbildung 3) wurde mit Spender 5 (0,015 g, 13.2 µmol) und Akzeptor 8 (Abbildung 3, 0,020 g 8,80 µmol) erreicht.
    2. AgOTf (0,011 g, 44,1 µmol) und Cp2HfCl2 (0,012 g, 30,8 µmol) dienten als ein Promotoren.
    3. Führen Sie die Schritte 2.1.1 bis 2.1.10 zu zwischen- 9, 5-Azidopentyl - O-{[2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-[3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl]} -(1→3)-{2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[2,3,4-O-triacetyl-α-LS160fucopyranosyl-(1→3)-3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl}-(1→6)-[2- O-acetyl-β-D-mannopyranosyl-(1→4)-O-(3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy)carbonylamino-β-D-glucopyranosyl)-(1O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy)carbonylamino-β-D-glucopyranosyl)-D-glucopyra (0.010 g, 34%), as weißer Schaum.
  4. Globale Deprotection intermidiate
    1. Wiegen Sie zusammengesetzte 9 (0,010 g, 2,9 µmol) in einen 25-mL Einzel-Hals Rundboden Kolben, fügen Sie eine magnetische rühren Bar, Kappe mit einem Gummiseptum und legen Sie einen Stickstoff-Ballon.
    2. Transfer von 1, 2 mL 4 Dioxan: H2O (4:1) in den Kolben. Fügen Sie Lithiumhydroxid (LiOH) (0,005 g, 50 % von WT) in die Flasche. Rühren Sie die Reaktionsmischung bei 90-100 oC für 12 h und bei RT abkühlen lassen
    3. Verdunstet das Lösungsmittel mit einem Drehverdampfer und Trocknen des Kolbens unter Vakuum für 1 h, füllen Sie ihn mit Stickstoff aus dem Vakuum Verteiler entfernen und mit einem Gummiseptum Kappe.
    4. Injizieren von 4 mL trockenem Pyridin und 2 mL Essigsäureanhydrid in den Kolben durch das Septum mit einer 10 mL Spritze bei 0 oC. Stir das Reaktionsgemisch für 12 h bei RT
    5. Verdunstet das Lösungsmittel mit einem Drehverdampfer bei 0-10 Mbar Unterdruck bei 50 oC.
    6. Die krude Mischung mit 30 mL von DCM auflösen und die Lösung mit gesättigten wässrigen Nahco33 (2 x 20 mL) in einem 50 mL separatory Trichter zu extrahieren.
    7. Extrahieren Sie erneut die wässrige Schicht mit DCM (3 x 15 mL). Verdunstet das Lösungsmittel mit einem Drehverdampfer.
    8. Eine Lösung des Produktes in etwa 2 mL der DCM auf C18 Kieselsäure Bett zu laden. Die Spalte mit einer Mischung aus Wasser und Methanol eluieren (0 - 100 % Methanol in Wasser) und Bruchteile von 5-10 mL zu sammeln.
    9. Sammeln Sie die Produkt-Brüche und verdampfen unter vermindertem Druck auf gewünschte Produkt als weißer Schaum.
    10. Das Produkt in 5 mL trockenem Methanol in einer 25 mL Runde untere Kolben auflösen und mit einem Gummiseptum verschließen.
    11. Transfer von 0,1 mL Natrium метоксида (NaOMe) in Methanol und Cool zum 0 oC mit einem Eisbad und rühren Sie die Mischung für 12 h.
    12. Entfernen Sie das Lösungsmittel mit einem Drehverdampfer und trocknen Sie das Produkt unter Hochvakuum.
    13. Die rohe Produkte in 5 mL Methanol auflösen: H2o: Essigsäure (6:3:1).
    14. Fügen Sie Palladium Hydroxid (Pd(OH)2) (50 % von wt) und rühren Sie die Reaktion unter Wasserstoffatmosphäre mit einem Wasserstoff-Ballon für 15 h.
    15. Die Reaktion durch eine Celite Bett filtern und mit 2 mL Methanol, gefolgt von 2 mL Dd Wasser waschen.
    16. Verdunstet das Lösungsmittel mit einem Drehverdampfer.
    17. Die krude Mischung mit etwa 1 mL Wasser auflösen und laden Sie sie auf dem Gelbett Polyacrylamid-(siehe Tabelle der Materialien). Eluieren Sie das Produkt mit Wasser und sammeln Sie Bruchteile von 1-2 mL.
    18. Die gesammelten Fraktionen von TLC zu überwachen, entwickeln mit n-Butanol: H2o: Essigsäure (1:1:1).
    19. Die Produkt-Fraktionen zu sammeln und erhalten Sie das gewünschte Produkt 10, 5-Aminopentyl-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-D-mannopyranosyl]-(1→3),-[β-D-galactopyranosyl-(1→4)-(lyophilize α-L-fucopyranosyl-(1→3)-2-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl)-(1→2)-α-D-mannopyranosyl]-(1→6)-β-D-mannopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside (0.002 g, 36%), as a weißes Pulver.
    20. Das Produkt von NMR und Massenspektroskopie (siehe zusätzliche Datendatei) zu charakterisieren.

3. Vorbereitung von Glykoproteinen mit Phosphonic Acid Tail19,22

  1. Wiegen der jeweiligen Glycan (2-5 µmol) in einer 5 mL Rundboden Kolben, eine magnetische Stir Bar hinzufügen und mit einem Gummiseptum cap.
  2. Übertragen Sie 400 µL frisch getrocknete Dimethylformamid.
  3. Hinzufügen [2 (2 (2 (BIZ (c(2)-OBN-Gruppe) Phosphoryl) Ethoxyethoxy) Ethyl (2, 5-dioxopyrrolidin1-Yl) Karbonat] (10-25 µmol, im Haus zubereitet), die Glycan-Lösung. Rühren Sie die Mischung mit 800 u/min für 5 h.
  4. Verdunstet das Lösungsmittel mit einem Drehverdampfer bei 5-10 Mbar Unterdruck bei 40 oC.
  5. Das Reaktionsgemisch in 0,5 mL Wasser auflösen und laden an der Spitze des Bettes Polyacrylamid-Gel (siehe Tabelle der Materialien). Eluieren Sie das Produkt mit Wasser und sammeln Sie Bruchteile von 1-2 mL.
  6. Überwachen Sie die gesammelten Fraktionen von TLC26. Vor Ort das Reaktionsgemisch auf einer TLC Platte, und fügen Sie Fleck-Lösung von 0,25 M Cerium Ammonium Molybdat; Folgen Sie durch Erhitzen mit einer Heizplatte. Sammeln Sie das Produkt mit Fraktionen und lyophilize um das gewünschte Produkt als weißes Pulver zu erhalten.
  7. Das Produkt in 2 mL Wasser auflösen und Pd (OH)2 (50 % nach Gewicht) hinzufügen. Rühren Sie die Reaktion bei 800 u/min unter Wasserstoffatmosphäre mit einem Wasserstoff-Ballon für 15 h.
  8. Die Reaktion durch ein Flussmittel kalziniert Bett zu filtern und mit 2 mL Methanol, gefolgt von 2 mL destilliertem deionisiertes Wasser waschen. Verdunstet das Lösungsmittel mit einem Drehverdampfer bei 300 Mbar Unterdruck bei 40 oC.
  9. Die krude Mischung mit etwa 1 mL Wasser auflösen und laden Sie sie auf dem Gelbett Polyacrylamid-(siehe Tabelle der Materialien).
  10. Eluieren Sie das Produkt mit Wasser und sammeln Sie Bruchteile von 1-2 mL. Überwachen Sie die gesammelten Fraktionen von TLC26. Lyophilize Fraktionen (das Produkt mit flüssigem Stickstoff eingefroren, dann legen Sie auf Gefriertrockner unter Vakuum) um das gewünschte Produkt als weißes Pulver zu erhalten. Die Produkte von NMR und Massenspektroskopie (siehe zusätzliche Datendatei) mit D2O als Lösungsmittel zu charakterisieren.

4. Glycan Array

  1. Vorbereitung der Aluminium beschichtete Glasplatten (ACG-Folie) 19 , 20 , 22
    Hinweis: Herstellung von Aluminium-beschichtete Objektträger erfolgte am Thin Film Technology Division, Instrument Technology Research Center und nationalen angewendet Research Laboratories, Hsinchu Science Park, Taiwan.
    1. Beschichtete Folien zu verpacken, Vakuum-Versiegelung zu verhindern die Bildung von NAO und halten bis der elektrochemischen Reaktion für Oberfläche Anodisierung versiegelt.
  2. Surface Anodisierung Aluminium beschichtete Objektträger 19 , 20 , 22
    1. Den temperaturgesteuerten Inkubator bei 4 ° c eingestellt Bereiten Sie 0,3 M Oxalsäure wässrigen Lösung vor und halten Sie es in ein Eisbad. Nehmen Sie die 500 mL-Becherglas, fügen Sie eine Magnetrührer Bar.
    2. Übertragen Sie die Oxalsäure 0,3 M, 500 mL-Becherglas zu, und platzieren Sie einen 10 cm lange Platin Stab als einer Kathode in die Lösung. Rühren (bei 300 u/min) die Oxalsäure Verlauf der Anodisierung.
    3. Lab-Tracer-Software aktivieren Sie, klicken Sie auf die Schaltfläche "einrichten" dann "Funktion Wahl Sweep Spannung." Die Start- und stop Spannung auf 25,8 V, Anzahl der Punkte auf 100, Einhaltung von 1, und fegen Verzögerung bis 1.200 ms und klicken Sie auf "ok".
    4. Klemmen Sie in Richtung der Kathode Aluminium-beschichtete Glas zugewandte. Klicken Sie auf "run-Test". Beobachten Sie die aktuelle Messung (ca. 8-10 mA).
    5. Nach Oberfläche Anodisierung Objektträger mit doppelt destilliertem Wasser gründlich abspülen, trocken mit Stickstoffgas bereinigen und dann in eine 30 % Relative Feuchte Kammer bis zum späteren Gebrauch speichern.
  3. Herstellung von ACG Glycan microarray 22
    1. Bereiten Sie individuell in Ethylenglykol bei 10 mM Konzentration 100 µL alle monovalenten Glykoproteinen (I-XI).
    2. Verdünnen Sie die oben genannten Glycan mit Drucken Puffer (80 % Ethylenglykol und 20 % deionisiertes Wasser) um 100 µM Konzentration zu machen.
    3. Bereiten Sie für Hetero-Liganden Studie 5 µL der einzelnen I-XI Glykane, und jeder fügen Sie 5 µL der Mann5GlcNAc2 (1:1 Verhältnis hinzu).
    4. Print Microarrays durch Roboter-pin (siehe Tabelle der Materialien), durch die Ablagerung von 0,6 nL die vorbereitete Glykane auf ACG gleitet31.
    5. Speichern Sie die bedruckten Folien in eine Luftfeuchtigkeit kontrolliert trockene Box vor der verbindlichen Test.
  4. Mapping-Glycan Epitope von HIV-1 im großen und ganzen neutralisierende Antikörper PG9 22
    1. Bereiten Sie 1 mL BSA enthaltenen PBST Puffer, 3 % w/V.
    2. Bereiten Sie 70 µL PG9 (50 µg/mL) in PBST Puffer (BSA enthalten PBST Puffer, 3 % w/V).
    3. Bereiten Sie 120 µL Nebenstil fluoreszierende Antikörper Esel Anti-Human-IgG (Alexa Fluor 647 konjugiert) 50 µg/mL in PBST Puffer (BSA enthalten PBST Puffer, 3 % w/V) im Dunkeln.
    4. Mischen Sie Primärantikörper (PG9) und Nebenstil fluoreszierenden Antikörper im Verhältnis 1:1 (60 µL). Inkubieren Sie vorgemischte Antikörper für 30 min bei 4 ° c
    5. Laden Sie die ACG-Folie in die Folie Inkubation Kammer unterteilt in 16 Brunnen. 100 µL vorgemischten Antikörper auf die Glycan-Array übertragen und bei 4 ° C für 16 h inkubieren.
    6. Pipettieren, vorgemischte Antikörper. Entfernen Sie die Folie Inkubation Kammer.
    7. Waschen Sie die Folie zuerst in PBST Puffer (PBS und 0,05 % Tween-20), gefolgt von deionisiertes Wasser und Spin bei 2.000 x g trocknen.
    8. Die Microarray Bildanalyse-Software zu öffnen (siehe Tabelle der Materialien). Fügen Sie eine Folie mit den angeordneten Funktionen nach unten.
    9. Klicken Sie auf das Menü "Einstellungen", legen Sie die Bildauflösung auf 5 µm pro Pixel und die Wellenlänge bei 635 nm mit PMT450 und Kraft zu 100 %.
    10. Klicken Sie auf "Scan" starten imaging der Folie.
    11. Klicken Sie auf "Datei", um das Bild im Tif-Format zu speichern.
    12. Durchführen Sie Bildanalyse durch Anschluss an die Software-Anwender Handbuch32.
    13. Berechnen Sie die Gesamtintensität der Fluoreszenz und illustrieren mit Bildverarbeitungs-Software33 (siehe Tabelle der Materialien).
      Hinweis: Hier ist der durchschnittliche Prozentsatz Fehler für alle Datenpunkte von Fehlerindikatoren präsentiert.

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Ergebnisse

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Chemo-enzymatische Modulstrategie für die Synthese eines breiten Spektrums von N -Glykanen ist in Abbildung 1dargestellt. Die Strategie ist, dass Vielfalt von Chemo-enzymatische Synthese der drei wichtige Module, gefolgt von der α-spezifische Mannosylation an der 3-O und/oder 6-O am Anfang erstellt werden kann Position der Mannose-Reste des gemeinsamen Kern Trisaccharide von N- Glykanen. Angesichts der strukturellen Vielfal...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eine Klasse von HIV-1-bNAbs einschließlich PG9, PG16 und PGMs 128 141-145 wurden berichtet, hochwirksame bei der Neutralisierung von 70-80 % der zirkulierenden HIV-1-Isolate. Die Epitope von diesen bNAbs sind unter den Varianten der gesamten HIV-1 Gruppe M hoch konserviert, deshalb können sie leiten die effektive Immunogen Gestaltung eines HIV-Impfstoffs neutralisierende Antikörper23,24,25 zu entlocken . Als Teil unserer Bemühun...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren danken den Thin Film Technology Division, Instrument Technology Research Center (ITRC) und nationalen angewendet Research Laboratories, Hsinchu Science Park, Taiwan. Diese Arbeit wurde unterstützt durch die National Science Council (keine zu gewähren. Die meisten 105-0210-01-13-01) und Academia Sinica.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
EssigsäureSigma Aldrich64197
AcetonitrilSigma Aldrich75058
EssigsäureanhydridSigma Aldrich108247
wasserfreies MagnesiumsulfatSigma Aldrich7487889
BortrifluoridethyletheratSigma Aldrich109637
RinderserumalbuminSigma Aldrich9048468
Bio-Gel P2 PolyacrylamidBio-Rad1504118
Bis(cyclopentadienyl)hafnium(IV)-dichloridSigma Aldrich12116664
β-1, 4 Galactosyltransferasen aus RindermilchSigma Aldrich48279
BioDot Cartesion Technologie mit Roboter-Pin SMP3 (Stealth Micro Spotting Pins)Arrayit
Cer-Ammonium-MolybdatTCIC1794
Cer-AmmoniumnitratSigma Aldrich16774213
Sauberer Objektträger Schott 
Cytidin-5′-monophospho-N-acetylneuraminsäureSigma Aldrich3063716
deuteriertes ChloroformSigma Aldrich865496
Donkey Anti-Human IgG (Alexa Fluor647 konjugiertJackson Immuno Research, USA709605098
DichlormethanSigma Aldrich75092
DiethylaminosulfurtrifluoridSigma Aldrich38078090
DimethylformamidSigma Aldrich68122
EthylacetatSigma Aldrich141786
EthylenglykolAcros Organisches107211
FAST Frame Slide InkubationskammernSigma Aldrich
Guanosin 5'- diphospho-b-L-fucose Dinatriumsalz Sigma Aldrich15839700
Lab Tracer 2.0 Software Abschnitt 4 des Protokolls
GenePix Pro 4300A Reader (Microarray-Bildanalyse)Molekulare Gerätewww.moleculardevices.com
GraphPad Prism Software (Bildverarbeitung) GraphPadSoftware, Inchttp://www.graphpad.com/guides/prism/6/user-guide/
LithiumhydroxidSigma Aldrich1310652
ManganchloridSigma Aldrich7773015
MethanolSigma Aldrich67561
N-ButanolSigma Aldrich71363
OxalsäureAcros Organisches144627
PalladiumhydroxidSigma Aldrich12135227
Phosphatgepufferte KochsalzlösungThermo Fisher Scientific
Pyridin, Sigma Aldrich110861
P-Toluolsulfonsäure-MonohydratSigma Aldrich773476
Silbertriflat,Sigma Aldrich2923286
NatriumbicarbonatSigma Aldrich144558
NatriumchloridSigma Aldrich7647145
Natrium HydrogencarbonatSigma Aldrich144558
Natriummethoxid Sigma Aldrich124414
NatriumsulfatSigma Aldrich7757826
Toluol Sigma Aldrich108883
Tris Puffer AmrescoN/AHochreine
Tween-20Amresco9005645
Uridindiphosphat-Galaktose (UDP-Galaktose)Sigma Aldrich137868521
10010023, , ,

Referenzen

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  28. JoVE Science Education Database. Essentials of Organic Chemistry. Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Spectroscopy. JoVE. , Cambridge, MA. (2017).
  29. JoVE Science Education Database. Essentials of Analytical Chemistry. Introduction to Mass Spectrometry. JoVE. , Cambridge, MA. (2017).
  30. Tseng, S. Y., et al. Preparation of Aluminum Oxide-Coated Glass Slides for Glycan Microarrays. ACS Omega. 1 (5), 773-783 (2016).
  31. Blixt, O., et al. Printed covalent glycan array for ligand profiling of diverse glycan binding proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 17033-17038 (2004).
  32. GenePix Pro 6.0 Microarray Acquisition and Analysis Software for GenePix Microarray Scanners User’s Guide & Tutorial. , Axon Instruments/ Molecular Devices Corp. Sunnyvale, CA. (2017).
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