Selektionsabhängige und unabhängige Erzeugung von CRISPR / Cas9-vermittelten Gen-Knockouts in Säugetierzellen

Zusammenfassung

Jüngste Fortschritte in der Fähigkeit, somatische Zelllinien genetisch zu manipulieren, haben großes Potenzial für grundlegende und angewandte Forschung. Hier präsentieren wir zwei Ansätze für CRISPR / Cas9-produzierte Knockout-Produktion und Screening in Säugetierzelllinien, mit und ohne Verwendung von selektierbaren Markern.

Zusammenfassung

Das CRISPR / Cas9 Genom Engineering System hat die Biologie revolutioniert, indem es genaue Genombearbeitung mit wenig Aufwand ermöglicht. Geleitet von einer einzigen Guide-RNA (sgRNA), die Spezifität verleiht, spaltet das Cas9-Protein beide DNA-Stränge am Zielort. Der DNA-Bruch kann entweder nicht-homologe Endverbindungen (NHEJ) oder Homologie gerichtete Reparatur (HDR) auslösen. NHEJ kann kleine Deletionen oder Insertionen einführen, die zu Frame-Shift-Mutationen führen, während HDR größere und präzisere Störungen ermöglicht. Hier präsentieren wir Protokolle zur Erzeugung von Knockout-Zelllinien durch Kopplung von etablierten CRISPR / Cas9-Methoden mit zwei Optionen für die nachgeschaltete Auswahl / Screening. Der NHEJ-Ansatz nutzt eine einzelne sgRNA-Cut-Stelle und selektionsunabhängiges Screening, bei der die Proteinproduktion durch Dot-Immunoblot in einer Hochdurchsatz-Weise beurteilt wird. Der HDR-Ansatz verwendet zwei sgRNA-Cut-Stellen, die das Gen von Interesse überspannen. Zusammen mit einer bereitgestellten HDR-Vorlage kann diese Methode eine Löschung erreichenVon zehn kb, unterstützt durch die eingefügte wählbare Widerstandsmarkierung. Die entsprechenden Anwendungen und Vorteile jeder Methode werden diskutiert.

Einleitung

Stabile genetische Veränderungen bieten einen Vorteil gegenüber transienten Methoden der zellulären Störung, die in ihrer Effizienz und Dauer variabel sein können. Die genomische Bearbeitung ist in den letzten Jahren aufgrund der Entwicklung von zielspezifischen Nukleasen, wie z. B. Zinkfinger-Nukleasen ^{1 , 2 , 3 , 4 , 5} , Transkriptionsaktivator-ähnliche Effektor-Nukleasen (TALENs) ^{6 , 7 , 8 ,}

Protokoll

1. Identifizierung von Homologieregionen um die gewünschte Löschung

HINWEIS: Nur bei selektionsbasierter Bearbeitung erforderlich.

1. Wähle zwei Regionen, anfänglich 1,5-2 kb, auf beiden Seiten des gewünschten Löschorts, die als Homologiearme in der HDR-Schablone dienen (Abbildung 1A ). Identifizieren Sie Regionen, die BsaI-Erkennungsstellen auf beiden Strang (GGTCTC) fehlen, um das Klonen zu erleichtern. Wenn BsaI-Stellen unvermeidbar sind, verwenden Sie ein alternatives IIs-Restriktionsenzym (BsmBI, SapI, BbsI) und modifizieren die entsprechenden Stellen im Empfängerplasmid (pUC19-BsaI), Resistenzma....

Ergebnisse

Für die Erzeugung von ELAVL1-Knockout-Linien war ein robuster Antikörper verfügbar, so dass die Bearbeitung mit einzelnen sgRNAs (Abbildung 1A , links) durchgeführt wurde, gefolgt von Punkt-Immunoblot. Drei sgRNAs wurden unabhängig transfiziert, um die Effizienz zu vergleichen und die Ziel-Effekte in den resultierenden Klonen auszuschließen. Nach dem Sammeln und Blotting von Zelllysaten aus klonalen Populationen auf zwei Nitrozellulosemembranen wurden die Bl.......

Diskussion

Das CRISPR / Cas9-System ermöglicht eine effiziente Erzeugung stabiler genomischer Modifikationen, die eine konsistentere Alternative zu anderen transienten Manipulationsverfahren bieten. Hier haben wir zwei Methoden zur schnellen Identifizierung von CRISPR / Cas9-Gen-Knockouts in Säugetierzelllinien vorgestellt. Beide Methoden erfordern wenig zelluläres Material, so dass Tests in frühen Stadien der Klonalkultur durchgeführt werden können, spart Zeit und Reagenzien. Um die Effizienz beider Methoden zu erhöhen, empfehlen.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Kompetente E. coli Zellen
Plasmid Vorbereitungskit
pSpCas9(BB)	Plasmid Addgene	42230	Ran et al. 2013, Klonierung von sgRNAs
BbsI-Enzym	ThermoFisher	FD1014	Ran et al. 2013, Klonierung von sgRNAs
T7 DNA Ligase	NEB	M0318L	Ran et al. 2013, Klonierung von sgRNAs
Tango Buffer	ThermoFisher	BY5	Ran et al. 2013, Klonierung von sgRNAs
PlasmidSafe Exonuklease	Epicentre	E3105K	Ran et al. 2013, Klonierung von sgRNAs
Q5 Hot Start High Fidelity Polymerase	NEB	M0494A	HA Amplifikation
pUC19-BsaI			Modifiziertes pUC19-Plasmid, mutierte vorhandene BsaI-Stelle und fügte nach dem BamHI/EcoRI-Verdau zwei nach außen gerichtete BsaI-Stellen ein
pGolden-Neo	Addgen	51422	Resistenzkassette
pGolden-Hygro	Addgen	51423	Resistenzkassette
BsaI-Enzym	NEB	R3535S	Homologiearmkonstruktion
T7 DNA-Ligase	NEB	M0318L
PlasmidSafe Exonuklease	Epicentre	E3105K
Zahnstocher			bakterielle PCR
Taq-Polymerase			bakterielle Kolonie PCR
HEK293 humane Zellen
DMEM Corning		10-013-CV
FBS	Corning	MT35010CV
Penicillin-Strep (opt.)	Gibco	15140-122
6-Well-Platten	BioLite	12556004
TransIT-LTI Transfektionsreagenz	Mirus	MIR2300	nur für die Lipofektion
Opti-MEM	ThermoFisher	31985062	nur für die Lipofektion
G418 (Neomycin)	Sigma Aldrich	A1720-5G
Hygromycin	Sigma Aldrich	H3274-250MG
96-Well-Platten	ThermoFisher	12556008
passiver Lysepuffer, 5x	Promega
1x SDS-Ladepuffer			Rezept beschrieben im Protokoll
Nitrocellulosemembran	Bio-Rad	162-0115
TBST			Rezept beschrieben im Protokoll
Dehydrierte Milch
SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate	ThermoFisher	34075	für HRP-konjugierte Sekundärantikörper
Extracta DNA-Vorbereitung für PCR	Quantabio	95091-025
KOD-Polymerase	Novagen	71316