Method Article

3D Microtissues für injizierbare Regenerative Therapie und Hochdurchsatz-Drogen-Screening

DOI:

10.3791/55982

⸱

October 4th, 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, School of Medicine, Tsinghua University, 2Collaborative Innovation Center for Diagnosis and Treatment of Infectious Diseases, 3School of Life Sciences, Tsinghua University

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung von elastischen 3D makroporöse Microcryogels durch die Integration von Microfabrication mit Cryogelation Technologie. Beim Laden mit Zellen, entstehen 3D Microtissues, die kann leicht injizierte in Vivo , regenerative Therapie zu erleichtern oder zu Arrays für in-vitro- Hochdurchsatz-Drogen-Screening montiert.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Um traditionelle 2D Zellkultur auf 3D Zellkultur zu aktualisieren, haben wir Microfabrication integriert, mit Cryogelation Technologie, makroporösen Microscale Cryogels (Microcryogels), zu produzieren, die mit einer Vielzahl von Zelltypen, 3D Microtissues bilden geladen werden kann. Hier präsentieren wir Ihnen das Protokoll um vielseitige 3D Microtissues und ihre Anwendungen in regenerative Therapie und Drogentest zu fabrizieren. Größe und Form-steuerbare Microcryogels kann auf ein Array Chip fabriziert werden die geernteten off-Chip als einzelne Zelle geladen Träger für injizierbare regenerative Therapie oder weiter auf dem Chip in 3D Microtissue Arrays für Hochdurchsatz-montiert werden Drogen-Screening. Aufgrund der hohen elastischen diese Microscale Cryogels weisen die 3D Microtissues große Injectability für die minimal-invasiv-Therapie durch Schutz der Zellen vor mechanischen Querkraft beim Einspritzen. Dadurch verstärkte Zelle überleben und therapeutische Wirkung im Mausmodell Extremität Ischämie. Unterdessen erleichtert die Montage des 3D Microtissue Arrays in einem Standardformat 384-Multi-Well die Verwendung von gemeinsamen Laboreinrichtungen und Geräte, Hochdurchsatz-Drogen-screening auf dieser vielseitigen 3D Zelle-Kultur-Plattform ermöglicht.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Traditionelle Zellkultur auf abgeflachte zweidimensionale (2D) Oberflächen, wie z.B. einer Kulturschale oder Multi-well-Platten, kann kaum Zelle Verhaltensweisen in der Nähe ihrer Heimat Bundesstaaten entlocken. Genaue Rekapitulation der native zellulären Mikroumgebungen, die von verschiedenen Zelltypen, extrazellulären Matrizen und bioaktiven lösliche Faktoren im dreidimensionalen (3D) Architekturen1,2,3 umfassen ,4, unbedingt Biomimicking Gewebe in Vitro für Anwendungen im Tissue engineering, regenerative Medizin, konstruieren grundlegende Biologie Forschung und Drug Discovery5,6,7 ,8,9.

Anstelle von 2D Zellkultur 3D Zellkultur ist weit verbreitet, biomimetische mikroarchitektonische voraus und funktionelle Merkmalen der Zellen in Vitrokultiviert. Eine beliebte 3D Cell-Kultur-Methode ist es, aggregierte Zellen in Sphäroide7,8,9,10. Zelluläre Sphäroide könnte zu verletzten Gewebe mit verstärkten zelluläre Retention und Überleben im Vergleich zur Injektion von verteilten Zellen injiziert werden. Jedoch führen ungleichmäßige Sphäroid Größen und unvermeidliche mechanische Verletzungen Zellen beim Einspritzen von Flüssigkeit Querkraft auferlegt zu schlechte Zelle therapeutische Effekte11,12,13. In ähnlicher Weise hat der inhärenten Ungleichförmigkeit während der Anhäufung der Sphäroide ihre Übersetzung in 3D zellbasierten Hochdurchsatz-Drogen-screening-anspruchsvolle10gemacht.

Ein weiteres Verfahren zur 3D Zellkultur wird mit Hilfe von Biomaterialien, die in der Regel Zellen in wässrige Hydrogele oder poröse Gerüste kapselt erreicht. Es ermöglicht eine größere Flexibilität bei der Konstruktion 3D Architekturen. Für Therapie werden Zellen, die in loser Schüttung Gerüste gekapselt in der Regel tierischen Körper über chirurgische Implantation geliefert, die invasive und traumatisch, daher seine große Übersetzung ins Bett zu beschränken ist. Auf der anderen Seite ermöglichen wässrige Hydrogele minimal-invasive Therapie durch die Injektion von Zellen in tierische Körper, so dass in Situ Gelierung über Thermo-chemische oder enzymatische Vernetzung11in Hydrogel-Vorläufer-Lösung suspendiert. Jedoch da Zellen geliefert werden, während die Hydrogel-Vorläufer noch in einem wässrigen Zustand sind, sind sie auch mechanische Scherkräfte beim Einspritzen ausgesetzt. Nicht nur so, könnte chemische oder enzymatische Vernetzung während in Situ Gelierung Hydrogel auch Schäden an den Zellen innerhalb verhängen. Für Drogen-Screening Probleme Biomaterial-gestützte Zellkulturen mit Gleichförmigkeit, Kontrollierbarkeit und Durchsatz. Mit Hydrogele, Zellen in der Regel während der Gelierung, engagieren sich der Prozess kann durch die Zellviabilität und Funktion beeinträchtigen.. Gelierung während der Aussaat Zelle behindert auch Nutzung durch die meisten Hochdurchsatz-Ausrüstung, da das Hydrogel kann auf Eis, Gelbildung vor Zelle Aussaat zu verhindern gehalten werden müssen, und das Hydrogel könnte Abgabe Tipps, die in der Regel sehr dünn um Genauigkeit zu gewährleisten sind Marmelade Hochdurchsatz-Screening. Vorgeformte Gerüste könnte potenziell Biomaterial Herstellung Verfahren aus Zellkultur, trennen aber die meisten Gerüst-basierten Produkten als Schüttgüter mit relativ niedriger Durchsatz14zur Verfügung stehen.

Um einige der Mängel des aktuellen 3D Kulturmethoden zu überwinden, haben wir eine Microfabrication-Cryogelation integriert-Technologie, um eine handelsübliche und benutzerfreundliche Microcryogel Array Chip15fabrizieren entwickelt. In diesem Protokoll wird Gelatine ausgewählt, um die Microcryogel Herstellung Technik veranschaulichen, wie es biokompatibel, abbaubar, kostengünstig ist, und keine weitere Änderung für Zellhaftung erforderlich ist. Andere Polymere natürlicher oder synthetischer Herkunft könnte auch für die Fertigung, abhängig von der Anwendung verwendet werden. Über diese Technologie können wir fabrizieren, miniaturisierte und hochelastische Microcryogels mit steuerbaren Größe, Form und Layout. Wenn Sie mit einer Vielzahl von Zelltypen geladen, könnte 3D Microtissues für verschiedene Anwendungen gebildet werden. Diese einzigartigen Eigenschaften ermöglichen gewünschte Injectability, Zellschutz und Site-verwiesene Retention nach Injektion in Vivo für verbesserte therapeutische Effekte. Nicht nur so, könnte die Microcryogels weiter verarbeitet werden, 3D Microtissue Arrays zu bilden, die kompatibel mit gemeinsamen Laborgeräte und Instrumente, Hochdurchsatz-Zellkultur für vielseitige Wirkstoff-Screening und andere zelluläre Assays zu realisieren sind. Hierin werden wir ausführlich den Fertigungsprozess des Microcryogels und die Nachbehandlung als individuelle 3D Microtissues oder 3D Microtissue Arrays für zwei wichtige Anwendungen, Zelltherapie und Drogen-Screening, bzw.10,15 .

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tierversuche folgte strengen Protokoll von der Tier-Ethik-Kommission auf Zentrum Biomedizinische Analytik, Tsinghua Universität zugelassen. Unter Zustimmung der Ethik-Kommission, menschlichen Fettgewebe aus Abteilung der plastischen Chirurgie von Peking Union Hospital mit Einwilligung der Patienten gewonnen.

1. Herstellung von 3D Microcryogels

  1. , Konstruktion und Fertigung von Microstencil Array Chips
    1. Verwendung einer kommerziellen Software Design Arrays von bestimmten Geometrien wie Kreise, Ellipsen, Dreiecke oder Kleeblätter 14, je nachdem Nachanmeldung.
      Hinweis: Finden Sie im Abschnitt 2 des Protokolls für die regenerative Medizin und Abschnitt 3 des Protokolls für Drogen-Screening für Designdetails.
    2. Das Design in der Laser-Gravur Laser Graviermaschine beiliegende Software importieren. Mit Hilfe der Lasereinstellungen entsprechend den Empfehlungen der Fabrik für die Laser-Gravur-Maschine, Laser-Gravur des importierten Designs auf Poly (Methymethacrylate) (PMMA) Blätter.
    3. Waschen die Microstencil Array Chips mit entionisiertem Wasser, um Schmutz von der Laser-Gravur reinigen. Trockene Microstencil Array-chips bei 60 ° c-Store in einem versiegelten Beutel bei Raumtemperatur monatelang.
  2. Herstellung von Microcryogel Array Chips
    1. Platz 4 Microstencil array-Chips auf dem Probenteller und Einfügen in das Plasma Reiniger. Schließen Sie die Tür des Reinigers und schalten Sie die Vakuumpumpe für 2 min, dann schalten Sie die maximale HF-Leistung (18 W), zur Behandlung von Microstencil Array Chips im Plasma Reiniger für 3 min bei Raumtemperatur, Hydrophilie erhöhen.
    2. Add 0,06 g Gelatine auf 1 mL entionisiertem Wasser um 6 % (wt/Vol) Vorläufer Gelatinelösung (genug, um 5 Chips) zu bilden. Bei 60 ° C in einem Wasserbad aufzulösen ausreichend warm. Inkubation auf Eis für 5 min.
    3. Add 3 µL Glutaraldehyd in Vorläufer Gelatinelösung, eine Endkonzentration von 0,3 %. Gründlich mischen.
    4. Pipette 200 µL Vorläufer Lösung mit Glutaraldehyd auf der Oberseite des Microstencil Array Chip.
      Hinweis: 200 µL ist ausreichend für eine 75 mm × 25 mm Chip unabhängig von Gestaltung. Erhöhen Sie die Menge proportional, wenn Fläche des Chips erhöht wird.
    5. Manuell verteilen die Lösung gleichmäßig über den Chip durch Schaben zurück und her mit einem gebogenen Glasstab 2-bis 3-Mal.
      Hinweis: Jedes Mikro-Brunnen auf dem Microstencil Chip befüllbar mit Vorläufer-Lösung durch ihre hydrophile Natur nach Plasmabehandlung.
    6. Sofort platzieren Sie den Vorläufer-Lösung gefüllt Array-Chip in einem Gefrierschrank-20 ° C für 16 h für Cryogelation.
    7. Anpassen der Gefriertrockner bis-40 ° C für 30 min. die Array-Chips nach Cryogelation in den Gefriertrockner und die Array-Chips für 2 h im Vakuum lyophilize.
      Hinweis: Gelatine Microcryogels mit vernetzten Makroporen werden gebildet, weil Eis während Cryogelation defilieren in den Gefriertrockner gebildet.
    8. Fahren Sie mit Abschnitt 2 für die Behandlung von kritischen Extremität Ischämie (CLI) und Abschnitt 3 für Hochdurchsatz-Drogentest.

2. Individuelle Microcryogels, injizierbare Form 3D Microtissues für Behandlung der CLI Ernte

  1. Ernte einzelner Microcryogels
    1. Design arrays (75 mm × 25 mm) 600 Kreise, mit 400 µm Durchmesser, jeweils kommerzielle Software für injizierbare 3D Microtissue Bau. Verwenden PMMA 300 µm Dicke für die Herstellung von Microstencil Array Chip als detaillierte in Abschnitt 1.1.
    2. Fabrizieren Microcryogel Array Chips wie in Abschnitt 1.2.
    3. Fabrizieren eine Auswerferstift PDMS-Array mit dem gleichen Design wie in Schritt 2.1.1 standard weichen Lithographie 16 , 17.
    4. Overlay Microcryogel Array Chip auf das PDMS Auswerferstift Array, jedes Microcryogel mit einem Auswerferstift auf dem Array ausrichten. Drücken Sie den Microcryogel Array Chip gegenüber dem Auswerfer Stift Array, drücken Sie die Microcryogels aus Mikrovertiefungen mit hervorstehenden Pins auf dem PDMS Auswerfer Stift Array, individuelle Microcryogels zu ernten.
    5. Die Microcryogel ins Wasser zu ernten und sammeln sie mit Hilfe der Zelle Siebe. Verwenden Sie ein Sieb, um Microcryogels von einem Chip (d. h. 600 Microcryogels) zu sammeln.
    6. Wash Microcryogels mit 0,1 M NaBH 4 auf Eis für 20 min uncross-verknüpften Aldehyd Rückstände zu stillen. Verwenden Sie 5 mL 0,1 M NaBH 4 pro Chip. NaBH 4 zu verwerfen und mit 5 mL entionisiertem Wasser für 3 bis 5 mal 15 min jedes Mal waschen.
    7. Entsorgen Sie Wasser aus der Zelle Sieb und Microcryogels in einem Cluster pro Zelle Sieb zu sammeln und ein Cluster in einer 35-mm-Petrischale mit einer gebogenen Pinzette. Fügen Sie 50-70 µL deionisiertes Wasser zu jedem Cluster und den Deckel der Petrischale zu decken. Klopfen Sie leicht die Petrischale auf der Tischplatte zu nivellieren alle Microcryogels, so dass keine Microcryogels auf eine andere Microcryogel zu einer Monoschicht von Microcryogels auf der Oberfläche der Petrischale bilden liegen.
    8. Fixieren die geernteten Microcryogels bei-20 ° C für 4 bis 16 h vor lyophilizing sie für 2 h (siehe Punkt 1.2.7). Microcryogels bis zur Weiterverwendung in einem Vakuum bei Raumtemperatur lagern.
  2. Charakterisierung von Microcryogels
    1. die Poren der Microcryogels durch das Scannen Rasterelektronenmikroskopie (SEM) Bildgebung zu bewerten.
      1. Fixieren die geernteten und gefriergetrockneten Microcryogels auf einem Probenhalter durch doppelseitige Klebeband und Mantel mit Gold mit einem Sputter Coater für 90 s, vor Bildgebung durch SEM 11. Auswerten und analysieren die Verteilung der Durchmesser der Poren in der Microcryogel von sieben verschiedenen SEM-Bilder mit Bildanalysesoftware.
    2. Wiegen ein Cluster von 600 lyophilisierten Microcryogels in einer 35-mm-Petrischale für das Gewicht des getrockneten Gelatine Microcryogels (GMs). Die Ansammlung von lyophilisierten Microcryogels 60 µL deionisiertes Wasser hinzu und warten Sie 30 s für Microcryogels voll Wasser aufsaugen und aufquellen. Wiegen Sie das geschwollene Microcryogels.
      1. Bestimmen das Gleichgewicht Schwellung Verhältnis und Porosität des Microcryogels, als das Verhältnis des Gewichts des geschwollenen Microcryogels, getrocknete Gelatine Microcryogels und das Verhältnis von Gewicht statt Wasser in Microcryogels mit der hydratisierten microcryogels jeweils 13.
    3. Maßnahme Injectability des Microcryogels über eine programmierbare Spritzenpumpe integriert mit einer digitalen Kraft messen 14.
      1. Stain 600 Stück des Microcryogels von Trypan blau und hängen Sie in 600 µL 15 % Gelatine-Lösung, eine homogene Verteilung zu erreichen. 1 mL Microcryogel Aufhängung in 1 mL Spritze zu laden. Die Mischung durch ein 27-Gauge Nadel eine programmierbare Spritzenpumpe bei Durchfluss von 1 mL/min mit 1 mL-Spritze injizieren
      2. Monitor in Echtzeit Injektion Gewalt durch digitale Kraft messen, testen und Plotten die Kraft-Zeit-Kurve. Nach der Injektion, die Integrität des Microcryogels unter dem Mikroskop beobachten.
        Hinweis: GMs in 15 % (wt/Vol) Gelatine-Lösung suspendiert können reibungslos injiziert und nach der Injektion intakt geblieben.
    4. Charakterisieren die Abbaubarkeit des Microcryogels.
      1. Zuerst messen das Gewicht von einem Cluster von 600 lyophilisierten Microcryogels in einer 35-mm-Petrischale als das Trockengewicht. Dann tauchen 600 lyophilisierten Microcryogels in 2 mL 0,025 % (Vol/Vol) Trypsin/EDTA.
      2. Sammeln Microcryogels aus der Lösung mit einer Zelle Sieb zu verschiedenen Zeitpunkten (d.h., 10, 20, 30, 40, 50, 60 und 70 min.). Docht entfernt überschüssige Lösung mit einem Tuch ab. Das Gewicht des Microcryogels zu verschiedenen Zeitpunkten messen und berechnen den Abbau Grad als das Verhältnis des Gewichts des Microcryogel an einem bestimmten Zeitpunkt, dass Microcryogel zum Zeitpunkt Null.
  3. Autoloading von Zellen in Microcryogels, Form 3D Microtissues
    1. Microcryogels aus Schritt 2.1.8 durch Ethylen Oxid Sterilisationssystem mit 12 h Gas Exposition gefolgt von 12 h Entgasung unter Vac zu sterilisierenUum.
    2. Wählen Sie menschliche Fettgewebe abgeleitet mesenchymale Stromazellen Zellen (hMSCs) für die Behandlung von ischämischen Megalosauridae Maus. Isolieren Zellen durch folgende Verfahren wie bereits berichtet 18.
    3. Kultur hMSCs im Wachstum 10 -8 M Dexamethason, 10, 10 ng/mL epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), 2 % fetalen bovine Serum (FBS) und 10 ng/mL Wachstumsfaktor Platelet-derived bb (PDGF-bb), 1 X Insulin Transferrin Selen (ITS)-haltigem Medium -4 M Ascorbinsäure 2-Phosphat, 100 U/mL Penicillin und 100 µg/mL Streptomycin in DMEM/F12. Die Zellen im Verhältnis von 1:3 Wenn konfluierende Durchgang. Zellen der Passage 3 bis 5 in den folgenden Experimenten benutzen.
    4. HMSCs mit Trypsin zu ernten und die Anzahl von Zellen mit einem Fuchs-Rosenthal-Zählkammer quantifizieren und eine Dichte von 8 x 10 6 Zellen/mL in hMSCs Wachstumsmedium Aufschwemmen.
    5. Pipette 60 µL hMSCs Suspension auf der Monolage von 600 Microcryogels mit Durchmesser von 400 µm in einer 35-mm-Schale aus Abschnitt 2.1. Zellen werden automatisch aufgenommen, in die poröse Mikro-Strukturen der Microcryogels.
    6. Pflegen in eine feuchte Kammer und Inkubation bei 37 ° C für 2 h damit Zellen befestigen. Fügen Sie nach 2 h Inkubation 2 mL Kulturmedium. Verändern Sie alle 2 Tage das Medium. Kultur hMSCs geladen Microcryogels für 2 Tage zu 3D Microtissues.
    7. Nach 2 Tagen Kultivierung, pipette 100 hMSCs geladen Microcryogels pro Bohrloch auf einer 96-Well-Platte, fügen Sie 120 µL Arbeitslösung Resazurin nach Angaben des Herstellers vorbereitet ' s Einweisung in jede Vertiefung. 2 h bei 37 ° c inkubieren
      1. Detect Fluoreszenz von Resazurin metabolisiert entwicklungsfähigen Zellen in einem Mikrotestplatte Reader mit einer Anregung Licht Wellenlänge von 560 nm und Emission Lichtwellenlänge von 590 nm. Etablieren eine Standardkurve Zellzahl vs. Fluoreszenz mit hMSCs Handynummer von Fluoreszenzintensität für zukünftige Experiment nach Kit Protokoll 13 interpolieren.
    8. Anzahl der hMSCs in Microcryogels vom Tag 0, Tag wie unter 4 mit Resazurin 2.3.7 von Tag 0, Tag 4 Schritt.
    9. Beflecken Zellen in Microcryogels mit Calcein AM Verdünnung 1: 500 und 1: 250 Verdünnung der Propidium Jodid (bekannt als lebenden/Toten Färbung) in Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) und unter Fluoreszenzmikroskop oder konfokale Fluoreszenzmikroskop beobachten.
  4. Injektion von 3D Microtissues in Vivo für die Behandlung von CLI im Mausmodell
    1. kritische Megalosauridae Ischämie des weiblichen BALB/c nackten Mäusen als gemeldete 11 , etablieren 19 zu bestimmen, die therapeutische Wirkung von 3D Therapie auf der Basis von Microtissue.
    2. Die Microtissues von Schritt 2.3.6 mit einer 5-mL-Pipette in eine Zelle Sieb übertragen und Filtern entfernt das Kulturmedium.
    3. Die hMSCs geladen 3D Microtissues in 15 % Gelatine-Lösung, bei einer Dichte von 100 Microcryogels pro 100 µL Lösung Aufschwemmen.
    4. Vor der Operation, chirurgische Instrumente von Autoklaven sterilisieren und operieren in einem Tier OP-Saal in einem Tier Anlage Center.
    5. Platzieren Sie den Mauszeiger in die Anästhesie-Induktion-Kammer mit 1-3 % Isofluran in 100 % Sauerstoff mit einer Durchflussrate von 1 L/min. anwenden Erythromycin auf die Augen der Maus, um Austrocknen zu verhindern. Durch einen 1 cm langen Hautschnitt verbinden die Femoral Arterie und seine Niederlassungen mit seidenen Fäden ca. 5-10 und Verbrauchsteuern 19.
    6. Inject Indocyanine grün (ICG) (0,1 mL 100 µg/mL) durch den Schweif Vene Injektion Blutfluss zu überwachen. ICG-Fluoreszenz-Bildgebung mit einer Fluoreszenz-imaging-System durchführen (hier hausgemachte System) in der Reflexion Geometrie 11.
    7. Intramuskulär injizieren Microtissues in drei Standorten des Muskels um die Arterie Schnitt mit einer 1 mL Spritze mit einer 23-Gauge-Nadel Gracilis.
    8. Nach der Operation, die Maus warm halten mit einem beheizten Pad in den Recovery-Käfig. Injektion subkutan Meloxicam um die Schmerzen zu lindern und überwachen kontinuierlich, bis Sie wach.
    9. Nach 28 Tagen, überwachen die therapeutische Wirksamkeit der 3D Microtissue behandelten Extremität durch Fluoreszenz imaging 11.
      Hinweis: Spritzen subkutan Meloxicam, die Schmerzen zu lindern, wenn die Maus spontan Gliedmaße Amputation zeigte.
    10. Einschläfern Mäuse mit Kohlendioxid nach Abschluss der Experimente.
      Hinweis: Hier, Euthanasie mit Kohlendioxid durchgeführt wurde nach strengen Protokoll genehmigt von der Tier-Ethik-Kommission auf Zentrum Biomedizinische Analytik, Tsinghua University.

3. Montage von Microtissue Array Chip für Hochdurchsatz-Screening-Medikament

  1. Montage der Microcryogel Array für die Zellkultur - Chip
    1. ändern das Design in Abschnitt 1.1 nach herkömmlichen Multi-well-Platte Abmessungen, d. h., für 384-Multi-Well-Format, entwerfen ein Array von 16 × 24 Brunnen (Zeile spaltenweise), jeweils 2 mm Durchmesser und 4,5 mm Abstand von Mitte zu Mitte.
    2. Laser Gravieren auf ein 500 µm dicken PMMA Blatt wie in Abschnitt 1.1 beschrieben.
    3. Fabricate Microcryogels wie beschrieben in Abschnitt 1.2 mit 384-Multi-Well-Array Chip entnommen Schritt 3.1.2. Dieses Microcryogel-haltigen Array bezeichnet man als Microcryogel Array Chip.
    4. Waschen Microcryogel Array Chip mit 50 mL 0,1 M NaBH 4 uncross-um jede verbleibende Aldehyd zu stillen verbunden, dann wiederholt Spülen mit 50 mL entionisiertem Wasser für 2 h 3 Mal, jedes Mal.
    5. Das Wasser wegschütten, Einfrieren den Microcryogel Array Chip bei-20 ° C für 4 bis 16 h vor Lyophilisation gemäß Schritt 1.2.7.
    6. Ändern die 384-Multi-Well Array Design im Schritt 3.1.1 bis 16 × 24 enthalten Brunnen, jeweils 3 mm Durchmesser und 4,5 mm Abstand von Mitte zu Mitte.
    7. Einseitig die Unterstützung aus einem Blatt von ultra-dünnen (10 µm) biokompatible doppelseitiges Klebeband zu entfernen und fügen Sie ihn auf der einen Seite von einem Stück von 3 mm Dicke PMMA Blatt. Laser Gravieren Design aus Schritt 3.1.4 auf dieser 3 mm Dicke PMMA Blatt nach Abschnitt 1.1. Dieses Array ist als das Reservoir Array bezeichnet.
    8. Ausrichten das Microcryogel-Array mit dem Reservoir Array Chip chip und zusammen halten fest an den 3D Microcryogel Array Chip für die Zellkultur-Chip montieren. Sterilisieren durch ultraviolette Strahlung für 1 h
    9. Store 3D Microcryogel Array chips im Vakuum bei Raumtemperatur für weitere Experimente.
  2. Drug screening am 3D Microtissue Arrays
    1. füllen Sie einen nassen Feld mit 25 mL sterilem deionisiertes Wasser als eine feuchte Kammer für die Zellkultur dienen. Pre-Wärme in einem befeuchteten 5 % CO 2 Inkubator auf 37 ° c
    2. Nicht-kleinzelligem Lungenkrebs Krebszellen (NCI-H460) und hepatozellulären Karzinomzellen (HepG2) aus der Gewebekultur Platten nach Standardprotokoll zu ernten und neu in Kulturmedien zu einer endgültigen Dichte von 1,0 x 10 6 Zellen/mL aussetzen. Gründlich mischen.
      Hinweis: RPM1640 mit 10 % FBS, 100 U/mL Penicillin und 100 µg/mL Streptomycin wird für NCI-H460 verwendet. Verwenden Sie DMEM mit 10 % FBS, 100 U/mL Penicillin und 100 µg/mL Streptomycin für HepG2.
    3. Entfernen Sie die feuchte Kammer aus Inkubator. Benutzen Sie eine Pinzette sorgfältig Ort montierten 3D Microcryogel Array Chip aus Schritt 3.1.9 in die feuchte Kammer. Vorsicht nicht zu den Microcryogels mit Wasser in der Kammer nass.
    4. Mischen die Zellsuspension gründlich, dann aliquoten 3 µL Zellsuspension direkt auf der Microcryogel in jede Vertiefung.
      Hinweis: Die Pipettenspitze sollte die Oberfläche der Microcryogel berühren Sie leicht vor Ausweisung Zellsuspension. Zellen sind in der Microcryogel durch Absorption Auto geladen. Zellen in den peripheren Schächten nicht Samen.
    5. Fügen Sie 10 μL der Medien in jede Vertiefung nach Zellen in Microcryogel mit Multi-Kanal-Pipette, wie z. B. einen 96-Kanal liquid Handler ausgesät werden. Medium wird auch periphere Brunnen hinzugefügt.
      Hinweis: Verwenden RPM1640 Medien mit 10 % FBS, 100 U/mL Penicillin und 100 µg/mL streptomycin für H460 Zellen. Verwenden Sie Medien DMEM mit 10 % FBS, 100 U/mL Penicillin und 100 µg/mL Streptomycin für HepaG2 Zellen.
    6. Kultur der Zelle geladen Microcryogel Array chip in die feuchte Kammer für 24 h in einer befeuchteten 5 % CO 2 Inkubator bei 37 ° C in Form 3D Microtissue Array.
    7. Auflösen Doxorubicin und IMMLG-8439- 9 in Dimethyl Sulfoxid (DMSO), eine Stammlösung von 10 mM zu bilden. Verdünnen Sie Drogen mit Nährmedium zu bilden ein Konzentrationsgradient 10-divisibel Verdünnung von 2 nM bis 200 µM.
    8. Fügen Sie 10 µL der Droge Lösungen in jedem gut. Verwenden Sie 0,1 % DMSO (in Medium verdünnt) als das Steuerelement. Inkubieren Sie das Medikament geladen 3D Microtissue Array in eine befeuchtete 5 % CO 2 Inkubator bei 37 ° C für 24 h
    9. Fügen Sie 4 µL der Stammlösung Resazurin in jede Vertiefung. Inkubation bei 37 ° C für 2 h. Ort der 3D Microtissue Array in der Mikrotestplatte Leser und erkennen Fluoreszenz von Resazurin metabolisiert lebensfähige Zellen bei einer Anregung Licht Wellenlänge von 560 nm und Emission Lichtwellenlänge von 590 nm.
    10. Subtrahieren Resazurin Baseline Signal aus allen Brunnen vor der Weiterverarbeitung der Daten. Zelle Lebensfähigkeit Teil jedes gut zu berechnen, indem man seine Fluoreszenzsignal durch das durchschnittliche Fluoreszenzsignal von der Kontroll-Vertiefungen.
    11. Plotten die Dosis-Wirkungs-Kurve Plotten Software mit der Zelle Lebensfähigkeit Bruch als die Y-Achse und die Basis 10 Logarithmus der Wirkstoffkonzentration als der X-Achse. 50 % Hemmung Konzentration (IC50) zu der Zelle Lebensfähigkeit Bruchteil von 0,5 zu interpolieren.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Herstellung und Charakterisierung von Microcryogels für 3D Microtissue Bildung.

Nach diesem Protokoll Microcryogels Form der 3D Microtissues und individuellen Microcryogels oder Microcryogel Arrays hergestellt wurden, und wurden in regenerative Therapie und Drogen-screening bzw. (Abbildung 1) angewendet. Microstencil Array Chips aus PMMA hergestellt wurden als Micromolds für Microcr...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Regenerative Medizin und in-vitro- Modelle für Drogen-Screening sind zwei wichtige Anwendungen für Tissue engineering5,6,7,8,9. Während diese beiden Anwendungen sehr unterschiedliche Bedürfnisse haben, liegt eine Gemeinsamkeit zwischen ihnen in der Notwendigkeit für eine weitere biomimetische Kultivierung Zustand Zelle Funktionen19

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde finanziell unterstützt von der National Natural Science Foundation of China (Stipendien: 81522022, 51461165302). Die Autoren möchten alle Du Lab-Mitglieder für allgemeine Unterstützung zu erkennen.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
GelatinesigmaG7041Alle anderen Reagenzien wurden, sofern nicht anders angegeben, von Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) gekauft.
Glutaraldehyd J& K902042Wird als Vernetzer bei der Aufbereitung von Material verwendet.
Deckglas (24 x 50 mm)CITOGLASS, China10212450CZum Schaben von Cursorlösung auf Mikroschablonen-Array-Chips.
Natrium  Borhydrid, NaBH4Beijing Chemical Works116-8Zum Wegwaschen von restlichem Glutaraldehyd nach der Gelierung.
VakuumbehälterChinaVC8130Zur Konservierung von Mikrogelen unter Vakuum.
Polymethylmethacrylat (PMMA) Platten Sunjin Electronics Co., Ltd, ChinaGewöhnliche PMMA-Bleche.
Rayjet LasersystemRayjet, AustralienRayjet 50 C30Zum Gravieren von PMMA-Platten zur Formung von Vertiefungen.
PlasmareinigerMycro Technologies, USAPDC-32GUm PMMA hyphophil zu machen.
LyophilisiererBoyikang, ChinaSC21CLZum Lyophilisieren von Materialien.
Trypanblaue Lösung (0,4%)Zhongkekeao, ChinaDA0065Zum Färben von Mikrogelen.
DoxorubicinhydrochloridENERGY CHEMICAL, ChinaA01E0801360010Zur Prüfung der Arzneimittelresistenz von Zellen in 2D- oder 3D-Mikrogel.
Lebend/tot-AssayDojindo Molecular Technologies (Kumamoto, Japan)CS01-10Zur Unterscheidung von lebenden und toten Zellen.
Zelltiter-BlauPromega (Wisconsin, USA).G8080Zur Prüfung der Lebensfähigkeit von Zellen.
ZellsiebBD Biosciences, USA352360Zum Sammeln von Mikrogelen.
D-LuciferinSYNCHEM (Germany)s039Zum Heften von Zellen.
RasterelektronenmikroskopFEI, USAQuanta 200Zur Charakterisierung der Mikrogelmorphologie.
  Mechanische PrüfmaschineBose, USA3230Zur Messung mechanischer Merkmale.
Programmierbare Spritzenpumpe World Precision Instruments, USAALADINI 1000Zur Prüfung der Injaktabilität.
Digitales KraftmessgerätHBO, Yueqing Haibao Instrument Co., Ltd., ChinaH-50 Um die Injactabiliy zu testen.
Ethylenoxid-SterilisationssystemAnprolene, Anderson Sterilization, Inc., Haw River, NCAN74iZur Sterilisation von Mikrogelen mit Ethylenoxidgas.
Mikroplatten-ReaderMolecular Devices, USAM5Zur Messung der Fluoreszenzintensität in Microarrays.
KonfokalmikroskopNikon, JapanA1RsiZur Beobachtung der Zellverteilung in 3D.
Xenogen  Lumina II BildgebungssystemCaliper Life Sciences, USAIVISZur Verfolgung von Zellen bei Tieren.
Flüssige ArbeitsstataionAprikosen-Design, USAS-PipetteZum Laden von Medium oder Zellsuspension mit hohem Durchsatz.
,

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).
  2. Abbott, A. Cell culture: biology's new dimension. Nature. 424 (6951), 870-872 (2003).
  3. Loessner, D., et al. Bioengineered 3D platform to explore cell-ECM interactions and drug resistance of epithelial ovarian cancer cells. Biomaterials. 31 (32), 8494-8506 (2010).
  4. Fischbach, M. A., Bluestone, J. A., Lim, W. A. Cell-based therapeutics: the next pillar of medicine. Sci Transl Med. 5 (179), 179(2013).
  5. Kuraitis, D., Giordano, C., Ruel, M., Musaro, A., Suuronen, E. J. Exploiting extracellular matrix-stem cell interactions: a review of natural materials for therapeutic muscle regeneration. Biomaterials. 33 (2), 428-443 (2012).
  6. Breslin, S., O'Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discov Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).
  7. Lovitt, C. J., Shelper, T. B., Avery, V. M. Miniaturized three-dimensional cancer model for drug evaluation. Assay Drug Dev Technol. 11 (7), 435-448 (2013).
  8. Yoshii, Y., et al. High-throughput screening with nanoimprinting 3D culture for efficient drug development by mimicking the tumor environment. Biomaterials. 51, 278-289 (2015).
  9. Li, X., et al. Micro-scaffold array chip for upgrading cell-based high-throughput drug testing to 3D using benchtop equipment. Lab Chip. 14 (3), 471-481 (2014).
  10. Qi, C., Yan, X., Huang, C., Melerzanov, A., Du, Y. Biomaterials as carrier, barrier and reactor for cell-based regenerative medicine. Protein Cell. 6 (9), 638-653 (2015).
  11. Li, Y., et al. Primed 3D injectable microniches enabling low-dosage cell therapy for critical limb ischemia. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (37), 13511-13516 (2014).
  12. Liu, W., et al. Magnetically controllable 3D microtissues based on magnetic microcryogels. Lab Chip. 14 (15), 2614-2625 (2014).
  13. Zhao, S., Zhao, H., Zhang, X., Li, Y., Du, Y. Off-the-shelf microsponge arrays for facile and efficient construction of miniaturized 3D cellular microenvironments for versatile cell-based assays. Lab Chip. 13 (12), 2350-2358 (2013).
  14. Liu, W., et al. Microcryogels as injectable 3-D cellular microniches for site-directed and augmented cell delivery. Acta Biomater. 10 (5), 1864-1875 (2014).
  15. Hakanson, M., et al. Controlled breast cancer microarrays for the deconvolution of cellular multilayering and density effects upon drug responses. PLoS One. 7 (6), e40141(2012).
  16. Du, Y., et al. Rapid generation of spatially and temporally controllable long-range concentration gradients in a microfluidic device. Lab Chip. 9 (6), 761-767 (2009).
  17. He, J., et al. Microfluidic synthesis of composite cross-gradient materials for investigating cell-biomaterial interactions. Biotechnol Bioeng. 108 (1), 175-185 (2011).
  18. Zeng, Y., et al. Preformed gelatin microcryogels as injectable cell carriers for enhanced skin wound healing. Acta Biomater. 25, 291-303 (2015).
  19. Yang, F., et al. Genetic engineering of human stem cells for enhanced angiogenesis using biodegradable polymeric nanoparticles. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (8), 3317-3322 (2010).
  20. Zhang, L., et al. Delayed administration of human umbilical tissue-derived cells improved neurological functional recovery in a rodent model of focal ischemia. Stroke. 42 (5), 1437-1444 (2011).
  21. Kinnaird, T., et al. Local delivery of marrow-derived stromal cells augments collateral perfusion through paracrine mechanisms. Circulation. 109 (12), 1543-1549 (2004).
  22. Fischbach, C., et al. Engineering tumors with 3D scaffolds. Nat Methods. 4 (10), 855-860 (2007).
  23. Dhiman, H. K., Ray, A. R., Panda, A. K. Three-dimensional chitosan scaffold-based MCF-7 cell culture for the determination of the cytotoxicity of tamoxifen. Biomaterials. 26 (9), 979-986 (2005).
  24. Gimble, J. M., Guilak, F., Bunnell, B. A. Clinical and preclinical translation of cell-based therapies using adipose tissue-derived cells. Stem Cell Res Ther. 1 (2), (2010).
  25. Thai, H. M., et al. Implantation of a three-dimensional fibroblast matrix improves left ventricular function and blood flow after acute myocardial infarction. Cell Transplant. 18 (3), 283-295 (2009).
  26. Moreira Teixeira, L. S., et al. High throughput generated micro-aggregates of chondrocytes stimulate cartilage formation in vitro and in vivo. Eur Cell Mater. 23, 387-399 (2012).
  27. Ifkovits, J. L., et al. Injectable hydrogel properties influence infarct expansion and extent of postinfarction left ventricular remodeling in an ovine model. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (25), 11507-11512 (2010).
  28. Murphy, A. R., Laslett, A., O'Brien, C. M., Cameron, N. R. Scaffolds for 3D in vitro culture of neural lineage cells. Acta Biomater. , (2017).
  29. Cheng, V., et al. High-content analysis of tumour cell invasion in three-dimensional spheroid assays. Oncoscience. 2 (6), 596-606 (2015).
  30. Huber, J. M., et al. Evaluation of assays for drug efficacy in a three-dimensional model of the lung. J Cancer Res Clin Oncol. 142 (9), 1955-1966 (2016).
  31. Lamichhane, S. P., et al. Recapitulating epithelial tumor microenvironment in vitro using three dimensional tri-culture of human epithelial, endothelial, and mesenchymal cells. BMC Cancer. 16, 581(2016).
  32. Ware, M. J., et al. Generation of an in vitro 3D PDAC stroma rich spheroid model. Biomaterials. 108, 129-142 (2016).
  33. Monjaret, F., et al. Fully Automated One-Step Production of Functional 3D Tumor Spheroids for High-Content Screening. J Lab Autom. 21 (2), 268-280 (2016).
  34. Shologu, N., et al. Recreating complex pathophysiologies in vitro with extracellular matrix surrogates for anticancer therapeutics screening. Drug Discov Today. 21 (9), 1521-1531 (2016).
  35. Ho, W. J., et al. Incorporation of multicellular spheroids into 3-D polymeric scaffolds provides an improved tumor model for screening anticancer drugs. Cancer Sci. 101 (12), 2637-2643 (2010).
  36. Pathak, A., Kumar, S. Independent regulation of tumor cell migration by matrix stiffness and confinement. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (26), 10334-10339 (2012).
  37. Wei, S. C., et al. Matrix stiffness drives epithelial-mesenchymal transition and tumour metastasis through a TWIST1-G3BP2 mechanotransduction pathway. Nat Cell Biol. 17 (5), 678-688 (2015).
  38. Romero-Lopez, M., et al. Recapitulating the human tumor microenvironment: Colon tumor-derived extracellular matrix promotes angiogenesis and tumor cell growth. Biomaterials. 116, 118-129 (2017).
  39. Xu, X., Sabanayagam, C. R., Harrington, D. A., Farach-Carson, M. C., Jia, X. A hydrogel-based tumor model for the evaluation of nanoparticle-based cancer therapeutics. Biomaterials. 35 (10), 3319-3330 (2014).
  40. Xu, X., et al. Recreating the tumor microenvironment in a bilayer, hyaluronic acid hydrogel construct for the growth of prostate cancer spheroids. Biomaterials. 33 (35), 9049-9060 (2012).
  41. Nyga, A., Loizidou, M., Emberton, M., Cheema, U. A novel tissue engineered three-dimensional in vitro colorectal cancer model. Acta Biomater. 9 (8), 7917-7926 (2013).
  42. Yip, D., Cho, C. H. A multicellular 3D heterospheroid model of liver tumor and stromal cells in collagen gel for anti-cancer drug testing. Biochem Biophys Res Commun. 433 (3), 327-332 (2013).
  43. Hoare, T. R., Kohane, D. S. Hydrogels in drug delivery: Progress and challenges. Polymer. 49 (8), 1993-2007 (2008).
  44. Delgado, L. M., Bayon, Y., Pandit, A., Zeugolis, D. I. To cross-link or not to cross-link? Cross-linking associated foreign body response of collagen-based devices. Tissue Eng Part B Rev. 21 (3), 298-313 (2015).
  45. Florczyk, S. J., et al. Porous chitosan-hyaluronic acid scaffolds as a mimic of glioblastoma microenvironment ECM. Biomaterials. 34 (38), 10143-10150 (2013).
  46. Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. In vitro three-dimensional (3D) models in cancer research: an update. Mol Carcinog. 52 (3), 167-182 (2013).
  47. Zhang, M., Boughton, P., Rose, B., Lee, C. S., Hong, A. M. The use of porous scaffold as a tumor model. Int J Biomater. 2013, 396056(2013).
  48. Wang, J., et al. Engineering EMT using 3D micro-scaffold to promote hepatic functions for drug hepatotoxicity evaluation. Biomaterials. 91, 11-22 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

3D MicrotissuesMicrocryogel FabricationInjectable Regenerative TherapyHigh throughput Drug ScreeningCryogelation TechnologyGelatin MicrocryogelsCell loaded CarriersOn chip AssemblyMouse Limb IschemiaResazurin Assay

Related Articles