Eine Kultur Zellmodell der Widerstand Arterien wird beschrieben, so dass für die Zerlegung der Signalwege im Endothel, glatte Muskulatur, oder zwischen Endothel und glatte Muskulatur (der Myoendothelial-Kreuzung). Die selektive Anwendung des Agonisten oder Protein isoliert, Elektronenmikroskopie oder Immunfluoreszenz kann mit diesem Handy-Kultur-Modell genutzt werden.
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Methodenartikel
Eine Kultur Zellmodell der Widerstand Arterien
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Myoendothelial Kreuzung (MEJ), eine eindeutige Signalisierung Microdomain in kleinem Durchmesser Widerstand Arterien, Exponate Lokalisierung von spezifischen Proteinen und Signalisierung Prozesse, die Gefäßtonus und Blutdruck steuern können. Es ist eine Projektion von entweder der Endothelzellen und glatten Muskelzellen Zelle, und aufgrund seiner geringen Größe (durchschnittlich eine Fläche von ~ 1 µm2), die MEJ ist schwierig, isoliert zu studieren. Jedoch entwickelten wir ein Zelle-Kultur-Modell namens die vaskulären Co Zellkultur (VCCC), die für in-vitro- MEJ Bildung, Endothelzellen Polarisation und Dissektion der Signalisierung Proteine und Prozesse in der Gefäßwand der Widerstand ermöglicht Arterien. Die VCCC hat eine Vielzahl von Anwendungen und kann verschiedene Zelltypen angepasst werden. Das Modell besteht aus zwei Zelltypen gewachsen auf gegenüberliegenden Seiten eines Filters mit 0,4 µm-Poren, in denen die in-vitro- MEJs bilden können. Hier beschreiben wir, wie erstelle ich die VCCC über Beschichtung von Zellen und Isolierung von Endothelzellen, MEJ, und glatte Muskulatur Brüche, die dann für Protein isoliert oder Aktivität verwendet werden können Assays. Der Filter mit intakten Zellschichten kann eingebettete und geschnittenen immunofluorescent Analyse fixiert werden. Wichtiger ist, wurden viele der Entdeckungen von diesem Modell bestätigt, mit intakten Widerstand Arterien, unterstreicht seine physiologische Bedeutung.
Einleitung
In kleinem Durchmesser Widerstand Arterien trennt eine dünne internen elastischen Lamina (IEL) Endothelzellen (EG) und glatten Muskelzellen (SMC). Die Zellen können durch Löcher in dieser elastischen Matrix Projekt und zytoplasmatischen Direktverbindungen über Gap Junction Kanäle1,2. Diese einzigartige Struktur ist die Myoendothelial-Kreuzung (MEJ) bezeichnet. Die MEJ ist eine kleine (ca. 0,5 µm x 0,5 µm, je nach dem vaskulären Bett), zelluläre Projektion besteht überwiegend aus Endothelzellen aber möglicherweise stammen aus glatten Muskulatur sowie3,4....
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Protokoll
1. galvanischen Zellen für die VCCC
- großen 225 cm 2 Kulturflaschen der EG und SMC unter sterilen Bedingungen bei 37 ° C, bis zum Zusammenfluss von 70-90 %. Sicherstellen Sie, dass mehr EG als SMC verwendet werden; Wenn primäre menschlichen EG und SMC, in der Regel 3 große Fläschchen der EG, 1 große Flasche mit SMC.
- Primärzellen im unteren Passagen verwenden und verwenden Sie nicht vorbei Durchgang 10. Wählen Sie die Kultur Medien basierend auf Zellen, Co kultiviert werden. Verwenden Sie für primäre menschliche Koronararterie EG EBM-2 EG basale Medien mit EGM2 MV Wachstumsfaktoren. Verwenden Sie für primäre menschlichen k....
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Ergebnisse
Die Filtereinsätze für die VCCC verwendet haben kleine, 0,4 µm Löcher. Abbildung 1A, ein En Flächenansicht des VCCC Filter Einschub zeigt die Poren, in denen die MEJ in Vitrobilden kann. Der Schaltplan zeigt die glatten Muskelzellen vergoldet auf der unteren Seite des Filters einen Tag vor der Endothelzellen auf der gegenüberliegenden Seite (Abbildung 1 b) überzogen sind. Sobald die Zellen überzogen sind, kann d.......
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Diskussion
Die VCCC hat eine Reihe von Vorteilen in Bezug auf die Rekapitulation MEJs in Vitro, aber es gibt Punkte der Diskussion beim festlegen, ob die VCCC für spezifische Anwendung genutzt werden kann. Beispielsweise, wenn verschiedene Zelltypen sind bei diesem Modell verwendet werden, es müssen optimiert werden. Wir haben primären humanen Zellen verwendet, aber es ist möglich, Zellen aus bovine Hauptschlagadern24oder Wildtyp oder Knockout-Mäusen zu isolieren, und verwenden sie in der VCCC
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Danksagungen
Diese Arbeit von National Heart unterstützt wurde, Lung and Blood Institute gewährt R01088554, der T32HL007284 und der American Heart Association predoctoral Gemeinschaft 14PRE20420024. Wir danken vor allem die St. Jude Cellular Imaging geteilt Forschung Core, einschließlich Randall Wakefield und Linda Horner für die Elektronenmikroskopie Bilder, Adam Straub für die Unterstützung bei repräsentativen Immunfluoreszenz Bilder und Pooneh Bagher für Sie wertvolles Feedback über das Manuskript-Protokoll.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 24 mm Durchmesser, 0,4 &Mikro; m Transwell Polyester-Membranfiltereinsatz | Corning | 3450 | Dies ist eine 6-Well-Platte mit Einsätzen |
| 225 cm Kolben | Corning | 431082 | |
| 6-Well-Platten (ohne Filtereinsätze) | Corning | 3506 | |
| Primäre menschliche Endothelzellen der Koronararterien | Lonza | CC-2585 | |
| Primäre glatte Muskelzellen der menschlichen Koronararterien | Lonza | CC-2583 | |
| EBM-2 EC Basalmedien | Lonza | CC-3156 | |
| EC Wachstumsfaktoren (EGM2 MV Single Quots) | Lonza | CC-4147 | Vor Gebrauch zu Basalmedien hinzufügen |
| SmBM SMC Basalmedien | Lonza | CC-3181 | |
| SMC Wachstumsfaktoren (SmGM-2 SingleQuot) | Lonza | CC-4149 | Vor Gebrauch zu Basalmedien hinzufügen |
| 0.5% Trypsin-EDTA 10X | Gibco | 15400-054 | Mit sterilem dPBS-Hämozytometer auf 2X verdünnen |
| VWR | 15170-208 | ||
| große Petrischalen für die SMC-Beschichtung (150 mm) | Corning | 353025 | |
| Rindergelatine | Sigma | G-9382 | |
| Humanes Fibronektin | Corning | 356008 | 5µ g/ml Fibronektin und bei -20 lagern |
| 10x Hanks' gepufferte Salzlösung (HBSS) | Gibco | 14065-056 | 1x mit sterilem Wasser verdünnen |
| 10x Dulbecco's Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (dPBS) | Gibco | 14200-075 | 1x mit sterilem Wasser verdünnen |
| Einweg-Gebogenes Skalpell (30 mm Schneide) mit Griff | Amazon | MDS15210 | |
| Pinzette | Fisher | 17-467-201 | |
| Zellheber | Corning | 3008 | |
| Zellschaber | BD Falcon | 353085 | |
| 50 mL konisches Röhrchen | Corning | 352070 | |
| 10 mm Petrischalen | Falcon | 35-1008 | |
| Rneasy Mini-Kit | Qiagen | 74104 | |
| RNA-Lysereagenz | Qiagen | 79306 | |
| Paraformaldehyd | Sigma | 158127 | Herstellung einer 4%igen Lösung mit dPBS |
| 70%igem Ethanol | Fisher | 04-355-305 | |
| Kavizid-Desinfektionsmittel | Fisher | 131000 | |
| RIPA-Proteinlysepuffer | Sigma | R0278 | |
| Schalldismembranator | Fisher | Modell 50 | |
| 1x PBS für die Ernte von EC/SMC und Immunzytochemie | Gibco | 10010023 | muss nicht steril sein |
| Name | Company< | strong>Katalognummer | <>Kommentare |
| >Einbetten/Schneiden/Färben | |||
| Paraffin | Fisher | P31-500 | |
| Automatisierter Gewebeverarbeiter | Excelsior | ES | |
| Einbettstation + Kühlplatte | Leica | HistoCore Arcadia | |
| Tissue Tek Accu-Edge Mikrotomklinge | VWR | 25608-961 oder 25608-964 | |
| Objektträger | Thermo Fisher | 22-230-900 | |
| Deckgläser | Thermo Fisher | 12-548-5E | |
| Prolong Gold Eindeckmittel | Thermo Fisher | P36931 | |
| Name | Company | Katalognummer | Kommentare |
| Andere Lösungen< | strong>**Führen Sie alle Schritte unter sterilen Bedingungen durch, wenn Sie die Lösung auf lebenden Zellen verwenden | ||
| Steriles dPBS-Autoklavierwasser | zum Sterilisieren. Mit dem sterilen Wasser DPBS (450 ml steriles Wasser: 50 ml 10X DPBS) herstellen, mischen und filtrieren, sterilisieren (0,2 &; Mikro; m Filter). Endkonzentration: 1X | ||
| steriles HBSS-Autoklavenwasser | zum Sterilisieren. Mit dem sterilen Wasser HBSS (450 ml steriles Wasser: 50 ml 10X HBSS) herstellen, mischen und filtrieren, sterilisieren (0,2 & Mikro; m Filter). Endkonzentration: 1X | ||
| Fibronektin-Stammlösung | Verwenden Sie 50 ml steriles Wasser zu Fibronektin, um 1 ml Aliquote herzustellen, und frieren Sie dann ein, bis es benötigt wird Endkonzentration: 100 μm; g/mL | ||
| Fibronektin zur Beschichtung der SMC-Seite von VCCC, | tauen Sie ein Aliquot auf und fügen Sie 1 ml Fibronektin hinzu (100 μm; g/mL) auf 19 ml 1X HBSS, um eine Endkonzentration von 5µ zu erreichen; g/mL. Endkonzentration: 5µ g/mL | ||
| 2x Trypsin EDTA-Lösung | Verdünnen Sie das 10X 0,5% Trypsin-EDTA auf 2X mit 1X dPBS (40mL DPBS: 10mL 10X Trypsin) . Endkonzentration: 2X | ||
| Blocking/Antikörperlösung | (9mL 1X PBS, 25mL Triton X100, 50mg Rinderserumalbumin, 500ml normales Serum) | ||
| Rindergelatine zur Beschichtung EC VCCC | Mischen Sie 0,5 g Rindergelatine in 100 ml destilliertes Wasser. Vor dem ersten Gebrauch autoklavieren und bei Raumtemperatur lagern. Steril aufbewahren. Endkonzentration: 0,50% | ||
| 1x PBS für die Entnahme von Zellen | muss nicht steril sein |
Referenzen
- Isakson, B. E., Duling, B. R. Heterocellular contact at the myoendothelial junction influences gap junction organization. Circ Res. 97 (1), 44-51 (2005).
- Little, T. L., Xia, J., Duling, B. R. Dye tracers define differential endot....
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Nachdrucke und Genehmigungen
