Summary
Quantification des cellules dérivées de donateurs est nécessaire pour contrôler la prise de greffe après greffe de cellules souches chez les patients atteints d’hémoglobinopathies. Une combinaison de tri de cellule axée sur la cytométrie en flux, analyse de la formation de colonie et analyse subséquente du tandem courte répétitions peuvent être employées pour évaluer la prolifération et la différenciation des cellules souches dans le compartiment érythroïde.
Abstract
La présence de chimérisme incomplète est notée dans une grande proportion de patients après greffe de moelle osseuse pour la thalassémie ou la drépanocytose. Cette observation a des implications énormes, comme stratégies d’immunomodulation thérapeutique ultérieure peuvent améliorer les résultats cliniques. Conventionnellement, analyse axée sur la réaction en chaîne de la polymérase de séquences répétées en tandem courtes sert à identifier chimérisme dans les cellules de sang provenant de donneurs. Toutefois, cette méthode est limitée aux cellules nucléées et ne peut pas distinguer entre deux lignées unicellulaires dissociées. Nous avons appliqué l’analyse de séquences répétées en tandem courtes à l’écoulement des cellules progénitrices hématopoïétiques triée par cytométrie en flux et comparé cela avec l’analyse de séquences répétées en tandem courte provenant d’unité formant des rafale sélectionnée - colonies érythroïdes, tous deux prélevés dans l’OS moelle osseuse. Avec cette méthode, nous sommes en mesure de démontrer les différente prolifération et la différenciation des cellules du donneur dans le compartiment érythroïde. Cette technique a le droit de compléter la surveillance actuelle de chimérisme dans la greffe de cellules souches définissant et ainsi peut être appliquée à l’avenir les études, de recherche sur les cellules souches et de conception des essais de thérapie génique.
Introduction
La transplantation allogénique de cellules souches hématopoïétiques (CSH) est l’approche curative disponible uniquement pour une variété de désordres génétiques innées du système hématopoïétique, atteindre des taux de survie sans maladie de plus de 90 % d’ailleurs fortement compromise et durée de vie limitée patients1. L’efficacité de cet outil thérapeutique important a été optimisée en limitant la toxicité de pré- et post transplantation schémas2, mais aussi par des interventions vise à soutenir la fonction du greffon stable, qui est quantifié par un suivi étroit des cellules dérivées donneur3,4,5.
En général, chimérisme complet (CC) implique le remplacement total du compartiment lymphohématopoïétiques de cellules dérivées de donateurs, alors que les expressions diverses de chimérisme (MC) sont utilisée lorsque le donneur et receveur-cellules sont présents simultanément dans divers proportions. Chimérisme Split (SC) désigne la coexistence de chimérisme mixte observée dans des lignées de cellules individuelles, comme dans le compartiment érythroïde. Détermination rapide du statut de chimérisme suite tcsh est critique, car elle peut aider à identifier les patients susceptibles de rechute de la maladie et les stratégies d’initier immunomodulatrices ultérieures, comme donneur lymphocytaire infusions ou réduction des immunosuppresseurs 6de thérapies.
Plusieurs méthodes ont été développées pour le suivi de greffe après tcsh. Isotyping des immunoglobulines et des analyses de cytogénétique ont une sensibilité médiocre et sont limités dans leur capacité à détecter le polymorphisme7,8. L’introduction d’hybridation fluorescente in situ (FISH) peut augmenter la sensibilité à la surveillance de chimérisme après tcsh, mais se limite aux allogreffes sexe-incompatibles,9. Actuellement, réaction en chaîne par polymérase (PCR) est la méthode la plus répandue, utilisée pour détecter le chimérisme et repose classiques d’agarose-acrylamide par électrophorèse sur gel de séquences répétées en tandem nombre variable (SRTNV) ou en tandem courte répétitions (DoD). Régulièrement utilisée PCR quantitative est capable de détecter une proportion très faible de cellules de donneur résiduelle après tcsh. La limitation majeure des études jusqu'à présent est que MC détection est presque exclusivement limitée à la présence de cellules nucléées, plutôt que d’érythrocytes matures, à savoir les cellules qu’est fonctionnellement crucial pour les patients affecté par des hémoglobinopathies. Chez les patients avec différents groupes sanguins, il faut se rappeler que l’analyse donnée est capable d’identifier chimérisme dans les globules rouges en utilisant des anticorps monoclonaux dirigés vers les antigènes érythrocytaires ABO et C, c, D, E et e10 , 11. un moyen différent, mais très intéressant d’évaluer chimérisme dans la lignée érythroïde est la combinaison de flux par cytométrie en flux, tri des progéniteurs érythroïdes et sélection des divers types de progéniteurs érythroïdes en cultivant dans des essais clonogéniques, suivi par analyse de STR12. Cette approche est en mesure de quantifier les proportions relatives des donateurs-versus-bénéficiaires chimérisme dans le compartiment érythroïde et peut-être être utilisée dans la stratégie pour préserver la greffe de moelle osseuse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. isolement des cellules de moelle osseuse hématopoïétique en triant les cellule activée par Fluorescence multiparamétrique
- échantillon coloration
- avant de commencer le processus, les éléments suivants doivent être collectées et préparé :
- médias de Gradient pour la préparation de mononucléaires cellules tubes (GM), 50 mL conique
- 12 x 75 mm tubes de flux pour la coloration des cellules
- coloration tampon : tampon phosphate salin (PBS) + 3 % de sérum de veau foetal (FCS)
- Pipettes < / l J’ai >
- FC bloc et coloration des anticorps (CD34 APC, CD36 FITC, CD45 V450, BD Biosciences). Avec cette combinaison de fluorochrome il y a empiétement négligeable dans d’autres chaines, mais toute autre combinaison de fluorochrome adapté est également possible.
- Perles de compensation (le cas échéant)
- Tampon de suspension : Hank ' s Balanced Salt Solution (HBSS) + 25 mM HEPES + 3 % FCS
- Le bleu trypan et hémocytomètre
- Tubes de prélèvement : n’importe quel milieu riche avec des tubes de sérique élevé (contenant 1 mL de FCS + 25 mM HEPES) peut être utilisé pour la collecte des cellules triées. Échantillon
- de la moelle osseuse : consentement éclairé pour la biopsie de moelle osseuse de la crête iliaque de l’arrière de l’os de la hanche est habituellement requis. L’échantillon de moelle osseuse est conservé dans des seringues héparinées à ta jusqu'à coloration. Les étapes suivantes du protocole sont effectués conformément aux directives de l’institution ' Comité d’éthique de la recherche humaine s pour le bien-être humain.
- Génèrent une suspension monocellulaire de l’échantillon de moelle osseuse. Ajouter 3 mL de GM dans le tube à centrifuger. La couche soigneusement le 4 mL de la suspension monocellulaire sur la solution de GM. Centrifuger à 550 g pour 30 min à 20 ° Celsius (C) (frein est éteint). Tirage au sort de la couche supérieure contenant du plasma et plaquettes à l’aide d’une pipette stérile, en laissant la couche de cellules mononucléaires non perturbé à l’interface. Dans un tube à centrifuger stérile à l’aide d’une pipette stérile de transfert la couche de cellules mononucléées.
- Après un lavage avec 5 mL de tampon de coloration, remettre en suspension les cellules dans 2 mL de tampon de suspension et déterminer la concentration en cellules. Déposer 5 µL de la suspension de cellules dans une éprouvette à bouchon à vis. Ajouter 95 µL de tache bleu Trypan 0,2 %. Mélanger soigneusement. Laisser pour reposer pendant 5 min à température ambiante. Remplir un hémocytomètre en ce qui concerne la cellule de comptage. Sous un microscope, observer si non viables sont colorées et de compter les cellules viables.
- Centrifuger les cellules à 250 g pendant 10 min à 20 ° C, éliminer le surnageant et remettre en suspension les cellules en souillant la mémoire tampon à une concentration de 1 x 10 6 par 100 µL.
- Bloc de FcR par l’utilisation de 2,5 µg Fc bloc par 1 x 10 6 cellules sur la glace pendant 10-15 min.
- Ajouter un ensemble approprié de 10 µg mAb pour souiller 1 x 10 6 cellules et incuber pendant 20 min à 4 ° C dans l’obscurité, suivie d’une étape de lavage avec 3 mL de tampon de coloration. D’indemnisation correcte, petites parties aliquotes de cellules (ou préférence de perles de compensation) sont colorées avec des anticorps unique chacun ; une aliquote restant non-colorées.
- Ajuster la concentration de 20 x 10 6 cellules/mL.
- Set up et optimiser la trieuse. Le processus de mise en place d’un cytomètre en flux et le logiciel est normalisé avec une instruction détaillée fournie par l’entreprise et doit être effectuée par un personnel convenablement formé.
- avant de commencer le processus, les éléments suivants doivent être collectées et préparé :
- Tri dans le trieur de cellules
- préparer les tubes de prélèvement de l’étape 1.1.1.9.
- Mis en place un modèle qui comprend un terrain de deux variables pour afficher forward scatter (FSC) et la diffusion latérale (SSC).
- Exécutent les cellules et ajuster les FSC/SSC pour placer la population d’intérêt à l’échelle
- Enregistrer le tube témoin négatif.
- Exécuter les tubes de contrôle positif unique ; enregistrement les données pour chaque tube.
- Calculer les compensations manuellement ou automatiquement avec la fonction fournie par le logiciel d’acquisition.
- Acquérir l’échantillon expérimental et les porte sur un bivariée FSC/SSC dot terrain ( Figure 1 a) pour inclure les cellules fois lymphoïde et myéloïdes. Exclure les doublets et agrégats en comparant les différents signaux de FSC (c.-à-d., hauteur, largeur et superficie) ( Figure 1 b). Visualiser les cellules singulet sur un terrain de deux variables dot affichage CD45 et CD36 ( Figure 1). Événements positifs pour CD45 sont des leucocytes (y compris leurs progéniteurs), ceux négatifs pour CD45 et positives pour CD36 sont progéniteurs érythroïdes. Utiliser des outils blocage pour définir CD36 + (si vous le souhaitez, ces cellules peuvent être encore divisés en CD36 haute et faible exprimant des cellules) et cellules CD45 +. Visualiser les événements CD45 + dans une autre parcelle de dot affichage paramètres CD34 et SSC. Utilisation porte outils pour définir des cellules CD34 + (progéniteurs de leucocytes) et SSC haute (cellules myéloïdes à différents stades de différenciation).
- Une fois qu’ont a déterminé les portes, les portes peuvent être sélectionnés pour trier dans des tubes pour prélèvements externes.
- Procédez au tri à 4 ° C jusqu'à ce que le nombre requis de cellules a été obtenu
- Faire une analyse post-tri pour déterminer la pureté des populations de cellules triées ( Figure 1E, 1F).
2. Clonogéniques dosage
- préparation des réactifs
avant de commencer le processus, les éléments suivants doivent être recueillis et préparé :- Pipettes, plaques de 100 mm
- bleu Trypan et hémocytomètre
- reconstituer l’érythropoïétine recombinante humaine (OEB) à 500 U/mL dans du PBS stérile contenant moins de 0,1 % l’albumine sérique humaine. Diviser cette solution en petites parties aliquotes et conserver à-20 ° C pour éviter le gel-dégel répété. Toutes les
- Prepare Iscove ' s mise à jour le Dulbecco ' s moyen (IMDM) avec la concentration finale de 5 % FCS, 2 mM de Glutamine, 100 unités/mL de pénicilline/streptomycine (PS). Ajouter l’érythropoïétine recombinante humaine (OEB) à différentes concentrations en puits séparés pour le milieu IMDM complet : 3 unités EPO/puits, 6 unités EPO/puits et 12 OEB unités/puits (1 x, x 2, 4 x EPO respectivement).
- Préparation des cellules de la moelle osseuse
- 10 mL de l’échantillon de moelle diluée avec 20 mL de PBS sont lentement en couches sur le dessus de milieu de gradient de densité 15 mL dans un tube conique de 50 mL, maintenir une interface claire entre les deux phases et vous en vertu des conditions stériles. Centrifuger les tubes coniques 15 mL à 550 x g pendant 30 min à température ambiante (RT) avec comme 9 l’accélération et de décélération la valeur 0 (ou frein OFF).
- Après centrifugation, enlever l’interface dans un nouveau tube de 50 mL et ajouter des PBS pour un volume final de 50 mL.
- Après centrifugation avec 250 g pendant 10 min à 10 ° C, retirez le surnageant et remettre en suspension les cellules dans un milieu IMDM complet à environ 0,5 x 10 6 cellules/mL. Prendre 10 µL de la suspension cellulaire dans un microtube, de mélanger avec le même volume de solution de bleu de Trypan (0,4 %) et de compter à l’aide d’un hémocytomètre.
- Oacultatif : cellules CD34 + sont enrichis par cellule magnétique tri avec perles Milteny CD34 conformément aux instructions fournies par le fabricant. Le principal avantage de cette étape de l’enrichissement est de détecter la qualité des cellules souches hématopoïétiques, qui sont cultivés sur une matrice semi solide additionnée de 50 ng/mL cellules souches le facteur (SCF), 20 ng/mL granulocyte-macrophage colony-stimulating (GM-CSF), 20 ng/mL interleukine-3 (IL-3), 20 ng/mL interleukine-6 (IL-6), facteur de stimulation des colonies de granulocytes 20 ng/mL (G-CSF) et 3 concentrations différentes d’EPO comme 1.4.
- Diluer les cellules à 0,1 - 0,15 x 10 6 cellules mononucléaires/mL ou 2 x 10 3 CD34 + cellules/mL en ajoutant le milieu IMDM complet additionné d’EPO et transfert de 300 µL à 3 mL Methocult H4434 moyen. Après agitation et une incubation courte pour plaque 5 min trois fois 1,1 mL sur un plat de 35 mm. Deux de ces récipients de culture ainsi que d’un tiers - rempli d’eau - sont placés dans des plats de 100 mm.
- Cellules sont cultivées dans un incubateur humidifié 37 ° C avec 5 % de CO 2 pendant 14 jours.
- Analyse des colonies
- Colonies sont notés selon leur morphologie avec un microscope inversé à un grossissement de X 40 dans une boîte de Petri marquée avec une grille de notation. Aux fins de notre analyse, les unités formant colonies (UFC) sont classées en 4 catégories : des cellules progénitrices multipotentielle (CFU-GEMM), cellules progénitrices de granulocyte-macrophage (CFU-GM), éclatent formant unité-érythroïdes (BFU-E) et formant des colonies unité-érythroïdes (CFU-E). Voir le fabricant ' s directives pour plus amples subclassification de colonie.
- Pour une analyse ultérieure, les cellules de la plaque de test UFC sont récupérés séparément selon les 4 catégories en suspendant à température de la pièce 4 mL PBS contenant 2 % FCS/IMDM. Après centrifugation à 400 g pendant 10 min à 4 ° C, les cellules sont remises en suspension dans du PBS, comptés et traitées pour l’extraction de l’ADN.
3. Analyse de chimérisme
- Isolement d’ADN
- les cellules par centrifugation à 400 g pendant 10 min. de granule
- Isoler l’ADN à l’aide d’un kit d’extraction d’ADN (kit d’extraction avez ADN sang) du sang. Préchauffer le tampon d’élution (AE) à 37 ° C afin d’améliorer le rendement de l’ADN éluée.
- Mesurer la concentration d’ADN avec photomètre de spectres Nanodrop ND-1000. Échantillons avec OD 260/280 entre 1,8 et 2,0 sont utilisées pour une analyse ultérieure.
- ADN diluer avec DNAase gratuit H 2 O à 0,1 ng/µL dans un volume total de 50 µL.
- STR-analyse
- mis en place la réaction PCR en mélangeant mélange réactionnel, AmplTaq or ADN polymérase et Profiler Plus Primer sertie de 20 µL ADN génomique (0,1 ng/µL) selon le manuel (l’ensemble d’amorçage contient les amorces non étiquetées dans un tampon pour amplifier les loci STR D3S1358, vWA, FGA, D8S1179, D21S11, D18S51, D5S818, D13S317 et D7S820 et l’amélogénine de marqueur de genre). Inclure une eau exempte de nucléase comme contrôle négatif et 9947A comme témoin positif. Pré-transplantatoire ADN du donneur et du receveur sont également inclus.
- Réaction PCR à effectuer à l’aide de Eppendorf mastercycler dégradé dans les conditions suivantes : 95 ° C pendant 11 min, 28 cycles d’amplification de 95 ° C pendant 1 min, 59 ° C pendant 1 min et 72 ° C pendant 1 min, suivie de 60° C pendant 45 min. Réaction de
- set up fragment analyse en ajoutant 12 µL Hi-Di formamide et 0,5 µL GeneScan 500 ROX taille Standard (tous Applied Biosystems) à 1 µL du produit PCR. À la première et la dernière position il faut une échelle allélique (Amp Genotyper Fl STR bleu, II vert et jaune, Applied Biosystems).
- Commencer à l’électrophorèse et l’acquisition avec l’appareil d’électrophorèse.
- Analyser Loci, les allèles et les hauteurs des pics des échantillons et des contrôles avec le logiciel 13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Séparation des progéniteurs lymphohématopoïétiques en triant les cellules FACS
Nous démontrons ici résultats du tri des populations de cellules nécessaires pour l’analyse en aval de STR. Les cellules de la moelle osseuse ont été colorées avec V450 conjugué anti-CD45, conjugué FITC anti-CD36 et APC conjugué anti-CD34. La population visée est les mégacaryocyte progéniteurs (MEP), nucléées les cellules érythroïdes responsables du développement des érythrocytes. Ces cellules expriment CD36, mais sont négatifs pour l’antigène commun CD45 (Figure 1). Si nécessaire, ces cellules peuvent être davantage différenciés selon leur niveau d’expression CD36. Plusieurs populations additionnelles peuvent être triées pour servir en tant que contrôles. Nous avons trié CD45 + CD34 + précurseurs lymphoïdes/myéloïde comme une autre population de cellules souches et de cellules CD45 + avec signal SSC élevé comme des cellules myéloïdes matures (Figure 1). Tri a été effectué avec un BD FACSAria I instrument de. Après le tri, la pureté de cellules progénitrices érythroïdes était > 85 % (Figure 1E) et pureté du cellulaire myéloïde > 95 % (Figure 1F).
Figure 1 . Tri des cellules progénitrices érythroïdes et cellules myéloïdes progénitrices après FACS. Figure 1 a/1 b affiche sur FSC-A vs SSC-A, FSC-H vs FSC-A et l’utilisation d’un outil de portail de polygone pour sélectionner la population d’intérêt. C 1 indique MEP sur CD45 vs CD36 ; 1 D affiche des cellules myéloïdes matures. Le pourcentage de cellules positives en 1E et 1F est indiqué. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Génération rafale formant des unités - colonies érythroïdes
Certaines cellules de la moelle osseuse et séparées par des billes magnétiques CD34 spécifiques semblent proliférer et se différencier. Après une période d’incubation de 14 jours sur les colonies de milieu semi-solide se forment. Stimulation avec différentes concentrations d’EPO augmente grandement la formation de colonies rouges proéminent (érythroïdes) (Figure 2).
La figure 2. Génération d’un éclatement formant unité-érythroïdes (BFU-E). Montré est une microphotographie de faible puissance représentative d’une colonie de BFU-E. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| RNM : | |||
| 1 X OEB | 2 X OEB | 4 X OEB | |
| CFU-E | 2 | 2 | 2 |
| BFU-E | 9 | 10 | 8 |
| CFU-GM | 30 | 30 | 29 |
| CFU-GEMM | 1 | 1 | 2 |
| CD34+ cellules : | |||
| 1 X OEB | 2 X OEB | 4 X OEB | |
| CFU-E | 1 | 1 | 0 |
| BFU-E | 5 | 11 | 6 |
| CFU-GM | 25 | 26 | 32 |
| CFU-GEMM | 0 | 2 | 3 |
Tableau 1. Analyse des Colonies dans les cellules de la moelle épinière non triés et CD34 + des cellules sélectionnées. Colonies sont notés selon leur morphologie avec un microscope inversé à un grossissement de X 40 dans une boîte de Petri marquée avec une grille de notation. Aux fins de notre analyse, les colonies sont classés en quatre catégories : formatrices unité-érythroïdes (CFU-E), formant des rafale unité-érythroïdes (BFU-E), cellules progénitrices de granulocyte-macrophage (CFU-GM) et les cellules progénitrices multipotentielle (CFU-GEMM).
Analyse du chimérisme
Analyse de chimérisme est réalisée à l’aide de l’AmpFlSTR Profiler Plus Kit (Applied Biosystems, Californie) selon le protocole du fabricant sur ABI Prism 310 analyseur génétique (Applied Biosystems, Californie). L’analyse est effectuée avec le logiciel GeneMapper (Applied Biosystems, Californie). Locus D21S11, D7S820, FGA et vWA ont été utilisés pour calculer les résultats (pourcentage ADN de receveur et donneur spécifiques).
| Échantillon | ADN destinataire | Donneur de l’ADN |
| CD45 | 25 % | 75 % |
| CD36hi | 25 % | 75 % |
| CD36lo | 55 % | 45 % |
| CD34 | 25 % | 75 % |
Le tableau 2. Pourcentage ADN receveur et donneur de cellules obtenues à partir de Fluorescence-lancée de cellules tri des cellules de moelle osseuse. Chimérisme de cellules du donneur dans les lignées cellulaires spécifiques du compartiment lymphohématopoïétiques est donné.
| Échantillon | ADN destinataire | Donneur de l’ADN |
| BM-MNC | 24,71 % | 75.29 % |
| BM-CD34 |
Tableau 3. ADN pourcentage receveur et donneur de cellules obtenues à partir du dosage clonogéniques. Chimérisme de cellules du donneur dans les lignées cellulaires spécifiques du compartiment lymphohématopoïétiques est donné.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
L’objectif de la présente étude est de fournir au public une combinaison des deux approches pour analyser chimérisme donneur/receveur en progéniteurs érythroïdes suite tcsh chez les patients traités pour hémoglobinopathies : 1.) activés par fluorescence cellulaire tri des cellules souches hématopoïétiques dans des échantillons de moelle osseuse suivies d’analyse de séquences répétées en tandem courtes et 2.) unité formant colonie de plus en plus de cellules de moelle osseuse, classification des colonies dans divers types de souches suivie d’analyse de séquences répétées en tandem courtes. La nouveauté de cette approche réside en combinant les techniques dans un protocole pour évaluer chimérisme donneur/receveur dans les colonies individuelles.
L’importance particulière de cette approche se trouvent dans le contexte du chimérisme mixte après que tcsh pour les patients traités pour des hémoglobinopathies. Plusieurs études ont démontré qu’une proportion importante de patients expriment un faible pourcentage de cellules myéloïdes donneur qui est en corrélation avec que des érythroïdes précurseur cellules und résultats de longue durée Ecurie mixte chimérisme hématopoïétique3, 11; en revanche, chez les patients mêmes un pourcentage élevé de globules rouges provenant de donateurs (2 à 5 fois supérieur à celui des leucocytes matures) est remarqué et suggère que l’érythropoïèse inefficace se produit à un stade ultérieur du développement érythroïde. Ces observations ont été attribuées à la propension à l’apoptose accélérée dans les érythroblastes de donateurs et de la persistance de lymphocytes résiduels T et B responsables permettant une allogreffe mixte14,15. Dans le contexte d’immunomodulation après transplantation de cellules souches hématopoïétiques, nous avons récemment démontré cette modification du traitement immunosuppresseur après transplantation hématopoïétique sur les résultats de la ß-thalassémie dans un avantage sélectif pour la compartiment érythroïde génétiquement corrigées, donnant une amplification de 2 à 2,5 fois de la tige résiduelle donneur de cellules12. Cette observation supporte l’utilité de la détermination des progéniteurs érythroïdes donneur-versus-résiduel, car il permet de comprendre ce phénomène et prend en charge les futurs essais cliniques étudiant la thérapie génique pour le traitement des hémoglobinopathies. En fait, la proportion de cellules nucléées modifiées génétiquement pour atteindre un niveau thérapeutique des globules rouges en circulation pourrait être similaire à celle observée chez les patients traités par greffe de cellules souches pour les hémoglobinopathies.
Afin de déterminer le tableau complet de l’érythropoïèse de donateurs, nous avons modifié le protocole et fournir une approche expérimentale détaillée, étape par étape. L’étape critique dans le présent protocole est le processus de mise en place d’un cytomètre de flux et de logiciel, qui est standardisé avec des instructions détaillées et doit être effectué par personnel qualifié. Présentation de notre protocole au format visualisées permet au public de suivre notre protocole facilement. Nous avons comparé nos résultats PCR à l’aide de l’ADN génomique de progéniteurs érythroïdes obtenus à partir de formatrices unités dans des échantillons de la BM contre l’ADN provenant de FACS-tri érythroïdes médullaires progéniteurs. Les données de prise de greffe de donneur de ces deux approches sont fondamentalement compatibles. Cependant, généralement moins de variation a été trouvé dans des échantillons provenant de formatrices unités. Ceci est probablement dû à l’amélioration de la survie des précurseurs de globules rouges du donneur dans l’essai in vitro par rapport à des homologues de donneur non traités et triés. Dans cette optique, le présent protocole peut être étendu en créant artificiellement des combinaisons chimériques mixtes avec des proportions connues des progéniteurs sains et des progéniteurs parmi un éventail de patients atteints de diverses hémoglobinopathies. Le clonogéniques test et évaluation de chimérisme devraient refléter dans-mettre des proportions.
Bien qu’une compréhension fine des mécanismes impliqués dans cette configuration particulière vient à manquer, la méthode présentée ici est d’une importance primordiale pour fournir les informations pertinentes pour la surveillance de routine du greffe et des informations pronostiques dans pratique clinique. Tentatives de sauvetage de fonction du greffon sont limités par le risque d’apparition de graft - versus - host disease et peuvent être guidés par greffe série suivi. Enfin, cette méthode pourrait également fournir une base utile pour les domaines de la recherche s’est engagés à améliorer les soins des patients atteints de hémoglobinopathies, particulièrement ceux touchés par aiguë graft - versus - host disease et les maladies auto-immunes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le Kinderkrebshilfe Regenbogen Südtirol.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | GE17-1440-02 | Remove RBC |
| 50 mL conical tubes | Falcon | 14-432-22 | Sample preparation |
| 12 x 75 mm flow tubes | Falcon | 352002 | FACS sorting |
| Phosphate buffered saline | Gibco | 10010023 | PBS |
| Fetal calf serum | Invitrogen Inc. | 16000-044 | FCS (heat-inactivated) |
| CD34 APC | BD Bioscience | 561209 | FACS-Ab |
| CD36 FITC | BD Bioscience | 555454 | FACS-Ab |
| CD45 V450 | BD Bioscience | 642275 | FACS-Ab |
| Trypan blue | Gibco | 15250061 | |
| Hemocytometer | Invitrogen Inc. | C10227 | Automatic cell counting |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Gibco | 14025092 | Suspension buffer in FACS analysis |
| HEPES | Gibco | 15630080 | Component of suspension buffer |
| FcR | BD Bioscience | 564220 | Block FCR |
| FACS Aria I | BD Bioscience | 23-11539-00 | FACS Sorter |
| Recombinant human erythropoietin | Affimetrix eBioscience | 14-8992-80 | EPO |
| Isocove’s Modified Dulbecco’s Medium | Gibco | 12440053 | IMDM |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-081 | Component of Culture Medium |
| CD34+ magnetic beads | Milteny Biotech | 130-046-702 | CD34+ purification |
| Recombinant human G-CSF | Gibco | PHC2031 | CFU-Assay |
| Recombinant human SCF | Gibco | CTP2113 | CFU-Assay |
| Recombinant human GM-CSF | Gibco | PHC2015 | CFU-Assay |
| Recombinant human IL-3 | BD Bioscience | 554604 | CFU-Assay |
| Recombinant human IL-6 | BD Bioscience | 550071 | CFU-Assay |
| Methocult H4434 Medium | Stemcell Technologies | 4444 | CFU-Assay |
| QiAmp DNA Blood extraction kit | Qiagen | 51306 | DNA Isolation |
| Nanodrop ND-1000 spectra photometer | Thermo Scientific | ND 1000 | DNA Quantification |
| DNAase free H2O | Thermo Scientific | FEREN0521 | DNA Preparation |
| AmplTaq Gold DNA Polymerase | Applied Bioscience | N8080240 | PCR |
| Eppendorf mastercycler gradient | Eppendorf | 6321000019 | PCR |
| Hi-Di Formamid | Applied Bioscience | 4311320 | PCR |
| GeneScan 500 ROX Size Standard | Applied Bioscience | 4310361 | PCR |
| 3130 Genetic Analyzer | Applied Bioscience | 313001R | PCR |
References
- Angelucci, E., et al. Hematopoietic stem cell transplantation in thalassemia major and sickle cell disease: indications and management recommendations from an international expert panel. Haematologica. 99, 811-820 (2014).
- Lucarelli, G., Isgro, A., Sodani, P., Gaziev, J. Hematopoietic stem cell transplantation in thalassemia and sickle cell anemia. Cold Spring Harb Perspect Med. 2, a011825 (2012).
- Andreani, M., Testi, M., Lucarelli, G. Mixed chimerism in haemoglobinopathies: from risk of graft rejection to immune tolerance. Tissue Antigens. 83, 137-146 (2014).
- Andreani, M., et al. Persistence of mixed chimerism in patients transplanted for the treatment of thalassemia. Blood. 87, 3494-3499 (1996).
- Andreani, M., et al. Long-term survival of ex-thalassemic patients with persistent mixed chimerism after bone marrow transplantation. Bone Marrow Transplant. 25, 401-404 (2000).
- Kumar, A. J., et al. Pilot study of prophylactic ex vivo costimulated donor leukocyte infusion after reduced-intensity conditioned allogeneic stem cell transplantation. Biol Blood Marrow Transplant. 19, 1094-1101 (2013).
- Lawler, S. D., Harris, H., Millar, J., Barrett, A., Powles, R. L. Cytogenetic follow-up studies of recipients of T-cell depleted allogeneic bone marrow. Br J Haematol. 65, 143-150 (1987).
- McCann, S. R., Crampe, M., Molloy, K., Lawler, M. Hemopoietic chimerism following stem cell transplantation. Transfus Apher Sci. 32, 55-61 (2005).
- Dewald, G., et al. A multicenter investigation with interphase fluorescence in situ hybridization using X- and Y-chromosome probes. Am J Med Genet. 76, 318-326 (1998).
- Andreani, M., et al. Quantitatively different red cell/nucleated cell chimerism in patients with long-term, persistent hematopoietic mixed chimerism after bone marrow transplantation for thalassemia major or sickle cell disease. Haematologica. 96, 128-133 (2011).
- Andreani, M., Testi, M., Battarra, M., Lucarelli, G. Split chimerism between nucleated and red blood cells after bone marrow transplantation for haemoglobinopathies. Chimerism. 2, 21-22 (2011).
- Kropshofer, G., Sopper, S., Steurer, M., Schwinger, W., Crazzolara, R. Successful management of mixed chimerism after bone marrow transplant in beta-thalassemia major. Am J Hematol. 91, E357-E358 (2016).
- Kimpton, C. P., et al. Automated DNA profiling employing multiplex amplification of short tandem repeat loci. PCR Methods Appl. 3, 13-22 (1993).
- Centis, F., et al. The importance of erythroid expansion in determining the extent of apoptosis in erythroid precursors in patients with beta-thalassemia major. Blood. 96, 3624-3629 (2000).
- Miccio, A., et al. In vivo selection of genetically modified erythroblastic progenitors leads to long-term correction of beta-thalassemia. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 105, 10547-10552 (2008).
