Probenvorbereitung für Masse Spektrometrie-basierte Identifikation der RNA-bindende Regionen

Der RBR-ID-Methode soll neuen RNA-bindende Proteine (RBPs) zu identifizieren und ordnen Sie ihre RNA-bindende Regionen (RBRs) mit Peptid-Ebene Auflösung ermöglichen die Gestaltung von RNA-bindende Mutanten und die Untersuchung der biologischen und biochemischen Funktionen von Protein-RNA-Interaktionen.

RNA ist einzigartig unter den Biomolekülen, denn es kann sowohl fungieren als ein Bote die genetischen Informationen und auch in komplexe dreidimensionale Strukturen mit biochemischen Funktionen eher derjenigen Proteine^1,2Falten. Eine wachsende Zahl von Beweisen zufolge forensisches RNAs (NcRNAs) spielen eine wichtige Rolle in verschiedenen gen Regulierungs- und epigenetische Wege^3,4,5 , und in der Regel werden diese regulatorischen Funktionen im Konzert vermittelt mit Proteinen, die speziell mit einem bestimmten RNA interagieren. Von besonderer Bedeutung wurde eine Reihe von interagierenden Proteine für die intensiv studierte lange NcRNA (LncRNA) Xist, wertvolle Einblicke in wie diese LncRNA X-Chromosom Inaktivierung in weiblichen Zellen^{6,7 vermittelt kürzlich identifiziert. ,8}. Bemerkenswert ist, könnte mehrere dieser Xist-Interaktion Proteine enthalten keine kanonischen RNA-bindende Domänen⁹, und daher ihre RNA-bindende Aktivität nicht vorhergesagt in Silico basierend auf ihre primäre Sequenz allein. Wenn man bedenkt, dass Tausende von LncRNAs in einer bestimmten Zelle¹⁰ausgedrückt werden, ist es vernünftig anzunehmen, dass viele von ihnen über Interaktionen mit handeln könnte, doch sein RNA-bindende Proteine (RBPs) entdeckt. Eine experimentelle Strategie, um diese neuartige RBPs identifizieren würde daher die Aufgabe die biologische Funktion von NcRNAs sezieren erheblich erleichtern.

Frühere Versuche, RBPs empirisch ermitteln Vertrauen auf PolyA + RNA Auswahl gekoppelt mit Massenspektrometrie (MS)^{11,12,13,14,15}. Obwohl diese Experimente viele Proteine in die Liste der vermeintlichen RBPs hinzugefügt, könnte sie standardmäßig nur Proteine gebunden, Polyadenylated Abschriften erkennen. Die meisten kleinen RNAs und viele LncRNAs sind jedoch nicht Polyadenylated. ^{16 , 17} und ihre interagierenden Proteine hätte wahrscheinlich in diesen Experimenten verpasst worden. Eine aktuelle Studie angewendet Computerlernen Proteinprotein Interaktom-Datenbanken, um Proteine zu identifizieren, die gemeinsam mit mehreren bekannten RBPs gereinigt und zeigte, dass diese wiederkehrende RBP-Partner eher RNA-bindende Aktivitäten¹⁸zu besitzen. Doch dieser Ansatz stützt sich auf Bergbau große Interaktion Datenbanken und erkennen nur Proteine, die Co gereinigten nicht denaturierenden Bedingungen mit bekannten RBPs, also ohne aus der Analyse unlöslich, Membran eingebettet und knapp sein kann Proteine.

Die Identifizierung eines Proteins als Bona Fide RBP oft nicht automatisch Informationen zur biologischen und/oder biochemische Funktion der Protein-RNA-Interaktion Ausbeute. Um diesen Punkt zu begegnen, ist es in der Regel wünschenswert, die Domäne und Aminosäure Proteinreste an der Interaktion Beteiligten zu identifizieren, so dass bestimmte Mutanten gestaltet werden können, testen Sie die Funktion des RNA-bindende im Zusammenhang mit jeder Roman RBP^{19, 20}. frühere Bemühungen von unserer Fraktion und anderen haben zum rekombinantes Proteinfragmente und Löschung Mutanten RNA bindenden Regionen (RBRs)^19,20,21,22; identifizieren solche Ansätze sind jedoch arbeitsintensiv und unvereinbar mit Hochdurchsatz-Analysen. Vor kurzem beschrieben eine Studie eine experimentelle Strategie zur RNA-bindende Aktivitäten in einer Hochdurchsatz-Mode mit Massenspektrometrie²³Karte; jedoch dieser Ansatz stützte sich auf eine doppelte PolyA + RNA-Auswahl, und so trug die gleichen Einschränkungen wie die RBP Identifikation Ansätze beschrieben.

Wir entwickelten eine Technik, genannt RNA bindenden Region Identifikation (RBR-ID), die Protein-RNA-Photocrosslinking und quantitative Massenspektrometrie, Proteine und Eiweiß Regionen mit RNA in lebenden Zellen ohne Interaktion identifizieren nutzt Annahme auf der RNA Polyadenylation Status, also auch RBPs verpflichtet PolyA-RNAs²⁴. Darüber hinaus diese Methode stützt sich ausschließlich auf Vernetzung und hat keine Anforderungen an Protein Löslichkeit oder Zugänglichkeit und eignet sich somit zur RNA-bindende Aktivitäten innerhalb von Membranen (z.B. die Kernhülle) oder schwerlösliche Fächer (Karte z.B. die Kernmatrix). Wir beschreiben die experimentellen Schritte ausführen RBR-ID für die Kerne der embryonalen Stammzellen der Maus (mESCs) sollte mit geringfügigen Änderungen dieses Protokolls jedoch geeignet für eine Vielzahl von Zelltypen, vorausgesetzt, dass sie effizient 4SU aus der Kultur integrieren können Medium.

1. Kultur und den Ausbau der mESCs

Hinweis: embryonale Stammzellen der Maus sind leicht zu Kultur und für die große Zahl erforderlich durch biochemische Experimente dank ihrer schnellen Fahrzeit schnell erweitert werden kann. Gesunde mESCs verdoppeln jeden 12 h.

1. Expand-mESCs auf die gewünschte Anzahl auf gelierenden Platten in mESC Medium (siehe unten) in einer Gewebekultur Inkubator bei 37 ° C, 5 % CO ₂, gehalten und > 95 % Luftfeuchte.
   Hinweis: Genug Platten sollte bereit sein, für 3-5 biologischen Wiederholungen für die + 4SU Probe und Kontrolle - 4SU. Eine 10-cm-Platte (d.h. 5 Millionen Zellen) ist mehr als ausreichend für jede biologische replizieren.
2. Das Medium für mESCs setzt sich zusammen aus Dulbecco ' s geändert Eagle ' s Medium (DMEM) ergänzt mit 15 % fetalen bovine Serum (FBS), 2 mM L-Glutamin, 0,5 x Penicillin/Streptomycin, 1 X nicht-essentiellen Aminosäuren, 100 µM Beta-Mercaptoethanol, 1.000 U /mL Leukämie hemmenden Faktor (LIF), 3 µM CHIR99021, 1 µM PD0325901.
3. Vor mESCs Passagierung, bereiten die gewünschte Anzahl von Platten 10 cm.
   1. Fügen Sie 4 mL 0,1 % Gelatine in Wasser dafür sorgen, dass die gesamte Oberfläche der Platte bedeckt ist; 10 min bei Raumtemperatur (RT) inkubieren; entfernen Gelatinelösung.
4. Passage Zellen, wenn sie 10 Millionen Zellen pro Platte, in der Regel ~ 48 h nach Impfung erreicht.
   Hinweis: Wenn mESCs in dichten Kolonien wachsen, Platten nie darf 100 % Konfluenz zu erreichen, wie für Zell-Linien beobachtet, die in Monolayer (z.B. HEK293 oder 3 t 3 Zellen) wachsen. Eine mESC Platte sollte passagiert werden, wenn ca. 50 % konfluierende und auf jeden Fall vor dem Medium gelb wird.
   1. Zellen, trennen waschen Platten mit dichten mESC Kulturen einmal in 1 x Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit 2 mM EDTA, ergänzt dann hinzufügen 0,05 % Trypsin in DMEM aufgelöst und Platte in Inkubator für 5 min zurück (37 ° C, 5 % CO ₂, und > 95 % (feuchte).
   2. Platte aus Inkubator und Zellen in gleicher Lautstärke von DMEM durch Pipettieren nach oben und unten kräftig mehrmals Aufschwemmen.
   3. Zählen Zellen unter Verwendung von Hemocytometer und sorgen dafür, dass Zellen eine einzellige Suspension bilden (d. h. keine Cluster), anschließend Zentrifugieren Zelle Mischung 500 X g für 5 min bei Raumtemperatur. Entfernen Sie überstand und Aufschwemmen Zelle Pellet in 1-2 mL DMEM.
   4. Zellen bei einer Dichte von 10.000 Zellen/cm ² mESC Medium (d.h. ~ 800.000 Zellen pro 10 cm Platte) zu impfen mit der Gelatine-beschichteten Platten in Schritt 1.3.1 vorbereitet.

2. Crosslink Protein – RNA-Interaktionen in Zellen Leben

Hinweis: RNS-Protein-Vernetzung ist vermittelt durch die Foto-aktivierbare Ribonucleoside analoge 4-Thiouridine (4SU). 4SU hat eine längere Absorption Maximum als endogene Nukleotide werden und kann nur in RNA; Mittelstufe-Wellenlänge UVB ist deshalb zu selektiv Crosslink RNA, Proteine ^{25 , 26} einsetzbar. UVB-Behandlung von 4SU-behandelten Zellen führt zu kovalenten Querverbindungen zwischen 4SU enthaltende RNA und Aminosäuren, mit einer gemeldeten Vorliebe für Tyr, Trp, Met, Lys und Cys ²⁷.

1. Expand-mESCs auf die gewünschte Anzahl der 10-cm-Platten wie beschrieben in Schritt 1.
   Hinweis: Genug Platten sollte bereit sein, für 3-5 biologischen Wiederholungen für die + 4SU Probe und Kontrolle - 4SU. Eine 10-cm-Platte (d.h. 5 Millionen Zellen) ist ausreichend für jede biologische replizieren.
2. Bevor die Platten Konfluenz erreichen, fügen Sie 4SU direkt in Medium, eine Endkonzentration von 500 µM. verlassen - 4SU Kontrolle Geschirr unbehandelt.
3. Shake Platten sanft um die 4SU homogen in das Medium zu verteilen. Zurück in den gleichen Gewebekultur-Inkubator für 2 h (37 ° C, 5 % CO ₂, und > 95 % Luftfeuchtigkeit).
4. Platten auf einem Eiskübel übertragen und verwerfen Medium.
5. Spülen die Platte vorsichtig mit 5 mL eiskaltem PBS.
   Hinweis: Spülen Sie sanft oder Zellen trennen könnte.
6. Fügen Sie 2 mL eiskaltem PBS und Ort Platten ohne Deckel in einem Vernetzer mit UVB-emittierenden Leuchtmitteln ausgestattet (312 nm). Bestrahlen Platten bei einer Energie von 1 J/cm ².
   Hinweis: Es ist wichtig, dass Kunststoff-Deckel entfernt werden oder sie schützen die Zellen vor UV-Licht und Vernetzung zu verhindern.
7. Zellen unter Verwendung von Zelle Heber zu sammeln und übertragen auf eiskaltem PBS in konischen Rohren. Zentrifuge bei 2.000 x g für 5 min, 4 ° c
8. Entfernen den Überstand und Aufschwemmen Zelle Pellet in 5 mL eiskaltem PBS mit 2 mM EDTA und 0,2 mM Phenylmethylsulfonyl Fluorid (PMSF).
9. Graf Zellen unter Verwendung einer Hemocytometer. Erwarten Sie 5-10 und 10 Millionen Zellen von 10 cm und 15 cm Platten bzw..
10. -Zentrifuge bei 2.000 x g für 5 min, 4 ° c
    Hinweis: Gebeizte Zellen sofort einsetzbar für Schritt 3 oder Blitz in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei-80 ° C auf unbestimmte Zeit gespeichert werden. Dies ist ein Haltepunkt Potenzial.

3. Isolierung der Kerne

Hinweis: Kerne sind isolierte zytoplasmatischen Proteine zu entfernen und Abdeckung von nuklearen Proteinen zu erhöhen. Dieser Schritt kann mit anderen Formen der zellulären Fraktionierung RBPs in verschiedenen zellulären Kompartimenten studieren ersetzt werden.

1. Bereiten Sie eiskalt Puffern einen (10 mM Tris-HCl pH 7,9, 4 ° C, 1,5 mM MgCl ₂, 10 mM KCl). Verwenden Sie mindestens 2,5 mL pro 10 Millionen Zellen (wie in Schritt 2,9 gezählt) für die Extraktion.
   Hinweis: Bestände des Puffers A (z. B. eine 500 mL Flasche) können im Voraus vorbereitet und bei 4 ° C für 6 Monate gespeichert.
   1. Vor dem Einsatz 0,5 mM Dithiothreitol (DTT) und 0,2 mM PMSF auf den gewünschten Wert (2,5 mL pro 10 Millionen Zellen) der eiskalten Puffer A. hinzufügen
2. Zellen mit 2 mL Puffer A pro 10 Millionen Zellen zu waschen. Mit 2.500 x g für 5 min bei 4 ° c drehen,
3. Verwerfen überstand hinzufügen Puffer A mit 0,2 % nichtionische, nicht Denaturierung Reinigungsmittel, wie Octyl-phen--Polyethoxy-Ethanol ergänzt (siehe die Tabelle der Materialien), 500 µL pro 10 Millionen Zellen. Für 5 min bei 4 ° c drehen
4. Zentrifuge bei 2.500 x g für 5 min.
5. Entfernen des Überstands, das Pellet umfasst intakt Kerne frei von Zytoplasma.
   Hinweis: Kerne können sofort verwendet für Schritt 4 oder Blitz in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei-80 ° C gelagert auf unbestimmte Zeit. Dies ist ein Haltepunkt Potenzial.

4. Lyse der Kerne

Hinweis: vernetzte Kerne sind in einem mass Spectrometry-kompatible Puffer, Proteinen und Protein-RNA-komplexe freizugeben lysiert.

1. Add Lyse Puffer (9 M Harnstoff, 100 mM Tris-HCl pH 8.0, 24 ° C), 200 µL pro 10 Millionen Zellen. Um mit einem 1/8 Chromatin Scheren beschallen " Sonde bei 50 % Amplitude Einstellung für 5-10 s
2. Spin bei 12.000 x g für 5 min und sammeln 175 µL überstand das Pellet zu vermeiden.
   Hinweis: 100 µL wird für die nächsten Schritte der RBR-ID verwendet werden und die restlichen 75 µL lysate bei-80 ° C für spätere Verwendung und/oder western-Blot Analyse gespeichert werden können.
3. Maßnahme Proteinkonzentration via Bradford-Test oder ähnliche Technik ²⁸. Proteinkonzentration in den verschiedenen Proben bis 1 mg/mL oder die niedrigsten Probenkonzentration mit entsprechenden Mengen von Lyse Puffer verdünnen.
   Hinweis: Aus den Kernen der 10 Millionen mESCs erwarten 100-200 µg Protein.

5. Trypsin-Verdauung

Hinweis: Proteine sind verdaut Peptide s generierenUitable für Bottom-Up-Massenspektrometrie (MS) Analyse.

1. Fügen Sie DVB-t-Lösung für nukleare lysate (5 mM letzte); für 1 h bei RT inkubieren
2. Iodoacetamide aus frischer Vorrat (14 mM final) hinzufügen; 30 min bei RT im Dunkeln inkubieren.
3. Verdünnt mit 5 Mal Volumen von 50 mM NH ₄ HCO ₃ lysate
4. Hinzufügen Trypsin (µg Protein: Trypsin µg = 200:1); über Nacht bei 37 ° C inkubieren.

6. Entsalzung von Peptiden

1. bereiten Sie ein maßgeschneidertes Bühne Tipp pro Probe.
   1. 6.1.1. Legen Sie eine CD der Festphase Extraktionsgut C18 in den unteren Teil einer Pipettenspitze 200 µL.
   2. Fügen Sie 50 µL Oligo R3 umgekehrt Phase Harz auf C18-Festplatte. Platzieren Sie Bühne Spitze innen Zentrifugation Adapter und der Ort Spitze mit Adapter in einem 1,5 mL Microfuge Rohr.
   3. Hinzufügen 100 µL 100 % Acetonitril, Tipps zu waschen. Zentrifuge bei 1000 X g für 1 min um das Lösungsmittel zu entfernen.
   4. Äquilibriert mit 50 µL 0.1 % Trifluoroacetic Säure (TFA). Zentrifuge bei 1000 X g für 1 min.
2. 100 % Ameisensäure hinzufügen verdauten Protein Probe zu verringern Sie den pH-Wert auf ca. 2-3.
   Hinweis: Dies sollte ~ 5 µL pro 1 mL der verdünnten Peptid Probe erfordern, aber pH-Wert gemessen und mehr Ameisensäure Säure hinzugefügt werden sollte ggf..
3. Last Probe auf maßgeschneiderte Bühne Tipp, Zentrifuge bei 1000 X g für 1 min bis alle Probe durch die Spitze geht.
4. Waschen gebunden Peptide mit 50 µL 0.1 % TFA. Zentrifuge bei 1000 X g für 1 min.
5. Peptide durch Zugabe von 50 µL Elution Buffer eluieren (75 % Acetonitril, 0,025 % TFA) Bühne Tipp und Zentrifuge bei 1000 X g für 1 min der Elution Buffer aus der Spitze zwingen.
6. Trocknen Sie die Probe mit einem Vakuum Zentrifuge gesetzt bei 150 X g und 1-3 kPa für 1 h
   Hinweis: Getrocknete Peptide können bei-80 ° C auf unbestimmte Zeit gespeichert werden. Dies ist ein Haltepunkt Potenzial.

7. Entfernung von querverbunden RNA

Hinweis: Behandlung von Peptiden mit Nuklease querverbunden RNA entfernen.

1. Aufschwemmen das Pellet in 50 µL 2 x Nuklease Puffer (100 mM NH ₄ HCO ₃, 4 mM MgCl ₂).
2. Maßnahme Peptid-Konzentration mit Absorption bei 280 nm vorausgesetzt, 1 mg/mL von Peptiden für eine A-₂₈₀ von 1.
   Hinweis: Die erwartete Konzentration beträgt 1 mg/mL.
3. Passen Sie alle Proben um 1 mg/mL oder die niedrigste Konzentration mit 2 x Nuklease Puffer.
4. Bereiten Sie einen master-Mix von 50 µL H ₂ O + 1 µL hochreine Nuklease (≥ 250 U) (siehe die Tabelle der Materialien) pro Probe.
5. 50 µL Peptid Probe nehmen und fügen Sie 50 µL H ₂ O + Nuklease master Mix.
6. Inkubation bei 37 ° C für 1 h zur Massenspektrometrie durchführen gehen.
   Hinweis: Die Peptide sind nun bereit für die Massenspektrometrie. Sie können sofort analysiert oder auf unbestimmte Zeit bei-80 ° C gelagert werden. Dies ist ein Haltepunkt Potenzial.

8. Nano Flüssigchromatographie, Mass Spectrometry und Rohdatenverarbeitung

Hinweis: da 4SU-Vernetzung die Masse des Peptids ändert, deren Ionen zählen nicht in Richtung der Intensität des Peptids unvernetzten während LC-MS/MS, Daher scheint die durch die Vernetzung verringert werden. Der Grad und die Konsistenz von diesem Rückgang spiegelt den Grad der Protein-RNA-Vernetzung für jedes Peptid ²⁴.

1. Bereiten HPLC puffert wie folgt: 0,1 % Ameisensäure in HPLC-Grade Wasser (Puffer A); 0,1 % Ameisensäure in Acetonitril HPLC-Grade (Puffer B).
2. Wenn ein Nano-HPLC vorhanden ist, schließen Sie eine Nano-Spalte mit den folgenden Spezifikationen: Innendurchmesser 75 µm; mit C18-AQ Partikel; verpackt Länge 20-25 cm.
   Hinweis: Wenn der HPLC erhältlich bei höheren Strömungsgeschwindigkeiten ausgeführt wird, verwenden Sie eine ordnungsgemäße Spaltengröße für die angegebenen Volumenstrom. Höherer Durchfluss Chromatographie verringert Empfindlichkeit.
3. Programm der HPLC-Methode wie folgt: Flow Rate 250-300 nL/min, Steigung von 2 bis 28 % Puffer B in 120 min, 28 bis 80 % B für die nächsten 5 min und isokratischen 80 % B für 10 min.
   Hinweis: Wenn der HPLC keine automatisierte Spalte Gleichgewichtherstellung vorherige Probenbeladung haben, starten Sie das Programm mit 10 min bei 0 % B vor dem Einlegen der Probenmaterials.
4. Programm der MS Erwerbsmethode datenabhängiges Erwerb (DDA) als standard Schrotflinte Proteomics Experimente durchführen. Das Tastverhältnis Instrument sollte vollständige MS-Scans mit Tandem MS Scans (oder MS/MS) der intensivsten Signale wechseln. Verwenden Sie die optimalen Einstellungen für Proteomics MS läuft.
   Hinweis: Für zuversichtlich Ergebnisse Scannen verwenden Instrumente, die mindestens die vollständige MS durchführen können im Modus "hohe Auflösung" (z.B. Orbitrap, Time-of-Flight). Für genaue Quantifizierung, stellen sicher, dass die Intervalle zwischen den vollständige MS-Scans sind nicht mehr als 3 S. längere Arbeitszyklen genaue Definition der extrahierten Ion Chromatogramme verhindern könnte.
5. Laden 1-2 µg der Probe auf der HPLC-Säule und die HPLC-MS/MS-Methode ausführen, wie programmiert. Für jede biologische replizieren führen Sie mindestens zwei unabhängigen Läufe und behandeln sie als technische Wiederholungen.
6. Nach MS, importieren Sie die raw-Dateien in ein Proteomik-Software-Paket für MS/MS Spektren Identifizierung und Quantifizierung der Peptid über extrahierten Ionenchromatographie. Wir empfehlen Software-Pakete, die chromatographische Ausrichtung mehrerer ausführen kann MS ausgeführt wird (siehe die Tabelle der Materialien) ^{29 , 30}.
7. Wenn die Option in der Softwaresuite verfügbar ist, aktivieren Sie " Match zwischen läuft " vor Beginn der Datenverarbeitung.
8. Sobald die Analyse abgeschlossen ist, exportieren Sie die Peptid-Liste zusammen mit den Werten der Quantifizierung.

Abbildung 1 zeigt die RBR-ID-Workflow. Aufgrund der relativ geringen Vernetzungseffizienz dieser Technik ist es sehr wichtig, die Erschöpfung Ebene und die Konsistenz des beobachteten Effekts (P -Wert) biologischer Replikate zu beachten. Abbildung 2 zeigt ein Vulkan-Grundstück von RBR-ID Ergebnis. Peptide, die RNA Anerkennung Motiv (RRM) Domäne überlappt zeigen sehr konsistent Erschöpfung. RRM Domänen können als Positivkontrolle für RBR-ID Analyse verwendet werden.

RBR-ID kann verwendet werden, um RBRs in lebenden Zellen zuzuordnen. Ein RBR-ID errechnet kann für jedes Peptid, RNA-bindende Potenzial zu schätzen: RBR-ID-Score = - log2(normalisierte + 4SU Intensität/normalisiert-4SU Intensität) x (Log10(P -Wert))2. Abbildung 3 zeigt eine Heatmap RBR-ID Partituren projiziert auf der Oberfläche des Spliceosomal Untereinheit U1 - 70 k. Die leuchtende rote Farbe im Bereich der RNA-Kontakt, zeigt wie aus der Kristallstruktur ermittelt korrekte Identifizierung der Protein-RNA-Interaktion.

Bei der Identifizierung von Roman RBPs und ihre RBRs ist es dringend empfohlen, dass ihre RNA-bindende Aktivität durch eine unabhängige Methode bestätigt werden. In unserem vorherigen Studie24wir TET2 als einen Roman RBP identifiziert und die RNA-bindende Aktivität auf einer C-terminalen Region abgebildet, wie in Abbildung 4A dargestellt durch Auftragen der RBR-ID Partitur entlang der primären Sequenz des Proteins. Abbildung 4 b zeigt, dass die Voraussetzung für diesen Roman RBR konnte überprüft werden, indem Sie durchführen PAR-CLIP26 mit der WT-Sequenz und vergleichen das Signal, dass eine Mutante fehlt die vorhergesagten RBR. Zusätzliche Kontrolle und detailliertere Beschreibung des Experimentes Validierung stehen in He Et al. 201624.

Abbildung 1: Übersicht der RBR-ID. Maus-WSR mit 4SU behandelt werden, oder nicht (1-2) und bestrahlt mit 312 nm UV (3). Kerne sind isoliert (4) und Extrakte mit Protease und Nuklease nachgeben vernetzt und Uncrosslinked Peptide (5) verdaut. Kovalente RNA Addukte bei Crosslink Websites verändern die Peptid-Masse, führt zu einem entsprechenden Rückgang der Intensität der das Uncrosslinked Peptid Massenspektrum (6, Pfeil). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 2: Proteom-weite RBR-ID in mESCs. Vulkan Grundstücke zeigt Log-Fach Änderungen im Peptid Intensitäten auf der x-Achse und der Student t-test P -Werte auf der y-Achse ± 4SU Behandlungen (312 nm). Peptide, die überlappende kommentierter RRM Domänen sind blau. Eine RNA-bindende Peptid aus HNRNPC ist rot hervorgehoben. Zuvor veröffentlicht in He Et Al. 201624. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 3: RBR-ID ordnet die Seiten von Protein-RNA-Interaktionen. Vergrößerten Regionen der Kristallstruktur von U1 SnRNP (PDB ID: 4PJO31) zeigt Protein Oberflächen farblich nach ihren RBR-ID-Score und Interaktion RNAs für U1 - 70 K. Zuvor veröffentlicht in He Et Al. 201624. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 4: Validierung von RBR von TET2. (A) primäre Sequenz und bekannten Domains für TET2; geglättete Rückstandsgehalt RBR-ID Partitur geplottet entlang der primären Sequenz (Mitte); und Regelung der katalytische Domäne Epitop-markierte Fragment (CD) und RBR gelöscht (CDΔRBR) Konstrukte verwendet für die Validierung (unten). (B) PAR-CLIP der vorübergehend zum Ausdruck gebrachten TET2 CD und ΔCDΔRBR in HEK293 Zellen. Autoradiographie für 32P-Label RNA (oben) und Kontrolle-western-Blot (unten). Zuvor veröffentlicht in He Et Al. 201624. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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