Methodenartikel

Isolierung der endothelialen Vorläuferzellen aus menschlichen Nabelschnurblut

DOI:

10.3791/56021

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14. September 2017

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Arkansas

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Das Ziel dieses Protokolls ist, endotheliale Vorläuferzellen aus Nabelschnurblut zu isolieren. Einige der Anwendungen sind mit diesen Zellen als Biomarker für die Identifizierung von Patienten mit Herz-Kreislauf-Risiko, Behandlung von ischämischen Erkrankungen und Erstellen von Tissue-Engineering Gefäß- und Herz-Ventil konstruiert.

Zusammenfassung

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Die Existenz von endothelialen Progenitorzellen (EPC) im peripheren Blut und seine Einbindung in Vaskulogenese wurde zuerst von Ashara und Kollegen1berichtet. Später, dokumentiert andere die Existenz von ähnlichen Arten von EPC aus dem Knochenmark2,3. Vor kurzem hatte Yoder und Ingram zeigte, dass Nabelschnurblut EPCs abgeleitet ein höheres proliferative Potential im Vergleich zu denen von Erwachsenen peripheren isoliert Blut-4,5,6. Neben der postnatalen Vaskulogenese beteiligt zu sein, haben EPC auch Versprechen als eine Zelle Quelle für die Erstellung von Tissue-Engineering Gefäß- und Herz-Ventil Konstrukte7,8gezeigt. Verschiedenen Isolierung Protokolle sind vorhanden, von denen einige beinhalten Zellsortierung mononukleären Zellen (MNU) abgeleitet aus den Quellen erwähnt mit Hilfe von Endothelzellen und hämatopoetischen Marker oder Kultivierung dieser multinationalen Unternehmen mit spezialisierten endothelial Wachstum Medium, oder eine Kombination dieser Techniken-9. Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die Isolierung und Kultur des EPC mit spezialisierten Endothelzellen Medium ergänzt mit Wachstumsfaktoren, ohne den Einsatz von Immunosorting, gefolgt von der Charakterisierung von der isolierten Zellen mittels Western blotting und Immunostaining.

Einleitung

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Mehrere Forscher untersuchten die Eigenschaften und das Potential der menschlichen EPCs5,10,11,12,13. EPC können beschrieben werden als Zellen, die Fähigkeit zur Einhaltung endothelial Gewebe an Standorten von Hypoxie, Ischämie, Verletzungen oder Tumorbildung und tragen zur Bildung von neuen vaskulären Strukturen4,14in Umlauf. Ihre beobachteten Beteiligung an Neovaskularisation, in Form von postnatale Vaskulogenese, führte zu einem Verständnis der P....

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Protokoll

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dieser Forschung wurde mit Zustimmung der University of Arkansas Institutional Review Board (Zulassungsnummer 16-04-722) durchgeführt. Nabelschnur Blut Einheiten wurden in Citrat Phosphat Traubenzucker (CPD) Lösung in Arkansas Nabelschnurblutbank und Einheiten, die nicht die Voraussetzung für die Lagerung für die Forschung gespendet wurden. Cord Blood Einheiten waren couriered im Labor innerhalb von 24 h Kollektion bei Umgebungstemperaturen.

1. Isolation der endothelialen Vorläuferzellen aus Nabelschnurblut

  1. Vorbereitung der Reagenzien.
    1. Ergänzt bereiten EGM durch Zugabe von endothelialen basal Medium (EB....

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Ergebnisse

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Isolation und Ausbau der endothelialen Vorläuferzellen:
Ein Schaltplan (Abbildung 1) steht zur Verfügung, zeigt das gesamte Protokoll. Die verschiedenen Blut Komponentenschichten wurden nach Dichte Gradienten Zentrifugieren der menschlichen Nabelschnurblut mit Dichte Gradienten Medium beobachtet. Bei der Aussaat MNCs auf die Kollagen-behandelten Platten, wurde erstmals Auswuchs von Kolonien zwischen 5 Tagen und 7 (Abb........

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Diskussion

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Wie bereits erwähnt, anhaftende EPCs besitzen eine Kopfsteinpflaster-Morphologie. Unsere isolierten MNCs entwickelte sich von einer spindelförmigen Zelle Kolonie (Abbildung 2A-2D) in den frühen Stadien zu einer gepflasterten Kolonie (Abbildung 2E-2F) über einen Zeitraum von zehn Tagen in Kultur. EPC haben unterschiedlich von verschiedenen Forschungsgruppen, nämlich als späten endothelial Progenitor Zellen10

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

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Dieses Material basiert auf Arbeit, unterstützt von der National Science Foundation Grant No. CMMI-1452943 und von der University of Arkansas Ehrenhochschule. Wir möchten auch die Arkansas Nabelschnurblutbank für die uns mit Schnur Blut Einheiten zu erkennen.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
A) Zur Isolierung und Kultivierung
EGM-2 BulletKitLonzaCC-3162Dieses Produkt enthält alle Wachstumsfaktoren, die zur Herstellung des endothelialen Wachstumsmediums
fetales Rinderserumbenötigt werden Thermofisher Scientific26140079
Pencillin-Streptomycin-Glutamin (100x)Thermofisher Scientific10378016
Ficoll-PaqueGE Heatlhcare17-1440-02
Hank's Balanced Salt SolutionThermofisher Scientific14170-112
Ammoniumchlorid-Stammzelltechnologien7850
1x Phosphatpuffer KochsalzlösungThermofisher Scientific14190250
Rattenschwanz I KollagenCorning354236
EisessigsäureAmresco0714-500ML
0,05 % Trypsin-EDTAThermofisher Scientific25300054
HEPES-PufferThermofisherScientific 15630080
Dulbecco's Modified Eagle's MediumThermofisherScientific 10566-016
strong>B) Antikörper und Zelllysate
CD31 Abcamab283641:250 Verdünnung  für Western Blotting
CD34Santa Cruz Biotechnologysc-70451:100 Verdünnung für Western Blotting
α-SMAabcamab56941:100 Verdünnung für Western Blotting
α-Tubulinabcamab72911:2.500 Verdünnung für Western Blotting
VEGFR2abcamsc5041:100 Verdünnung für Western Blot
Endothelzelllysat für menschliche NabelvenenSanta Cruz Biotechnologysc24709 
PrimäreZelllinie, die aus dem eigenen Labor kultiviert und mit RIPA-Puffer lysiert
C) Western Blot und Immunfärbung
Biorad161-0772Wird als laufender Puffer
verwendet 10x Tris/Glycin-PufferBiorad161-0771Wird als Transferpuffer verwendet
Immobilon-FL TransfermembranMerck MilliporeIPFL0010Hierbei handelt es sich um eine PVDF-Transfermembran mit 45 &; Mikro; m Porengröße und wird im Protokoll als Western Blot Membran
erwähnt 4x Laemmli ProbenpufferBiorad161-0747
2-MercaptoethanolBiorad161-0710
10% Kriterium TGX FertigteilgelBiorad5671033
Prolong Gold AntifadeThermofisher ScientificP36930Wird zur Montage von immungefärbten Deckgläsern für die Langzeitlagerung
MethanolVWR AnalyticalBDH1135-4LP
für < wurde10x Tris/Glycin/SDS-Puffer verwendet

Referenzen

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  1. Asahara, T., et al. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis. Science. 275 (5302), 964-967 (1997).
  2. Lin, Y., Weisdorf, D. J., Solovey, A., Hebbel, R. P. Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood. J ....

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Schlagwörter

ZellisolationDichtegradientenzentrifugationEndothelial Growth MediumWestern Blot AnalyseImmunf rbecharakterisierungCollagen BeschichtungZellkulturinkubationKoloniebildung

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