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Methodenartikel

Semi-automatische Analyse von Maus Skelettmuskulatur Morphologie und Fasertyp Zusammensetzung

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DOI:

10.3791/56024

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31. August 2017

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1Department of Medicine-Cardiology Division, University of Colorado School of Medicine, 2Department of Molecular Physiology and Biophysics, Baylor College of Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Immunhistochemische Färbung des Myosin schwere Kette Isoformen als State-of-the-Art-Diskriminator des skelettartigen Muskels Fasertyp entstanden (d.h., Typ I, Typ IIA, Typ IIX, Typ IIB). Hier präsentieren wir Ihnen eine Färbung Protokoll sowie eine neuartige semi-automatischen Algorithmus, der erleichtert die schnelle Beurteilung der Fasertyp und Faser Morphologie.

Zusammenfassung

Jahrelang wurden Unterschiede zwischen skelettartigen Muskel Fasertypen am besten durch Myosin-ATPase Färbung sichtbar gemacht. Immunhistochemische Färbung des Myosin heavy Chain (MyHC) Isoformen hat vor kurzem eine feinere Diskriminator Fasertyp entwickelt. Typ I, Typ IIA, Typ IIX und Typ IIB Fasern jetzt mit Präzision, basierend auf ihrem MyHC Profil identifiziert werden können; manuelle Auswertung dieser Daten kann jedoch langsam und unten-rechts langweilig. Schnelle, präzise Bewertung der Fasertyp Zusammensetzung und Morphologie ist in dieser Hinsicht ein sehr wünschenswert Werkzeug. Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für State-of-the-Art immunhistochemische Färbung des MyHCs in Gefrierschnitte gewonnenen Maus Megalosauridae Muskel im Konzert mit einem neuartigen semi-automatischen Algorithmus, der Analyse der Fasertyp und Faser Morphologie beschleunigt. Wie erwartet, Musculus soleus angezeigt Färbung für Typ I und Typ IIA Fasern, aber nicht für Typ IIX oder Typ IIB Fasern. Auf der anderen Seite der Tibialis anterior-Muskel setzte sich überwiegend aus Typ IIX und Typ IIB Fasern, ein kleiner Bruchteil der Typ IIA Fasern und wenig oder gar keine Typ-I-Fasern. Mehrere Bildtransformationen wurden verwendet, um die Wahrscheinlichkeit Karten zum Zwecke der Messung der verschiedenen Aspekte der Faser Morphologie (d.h.Querschnittsfläche (CSA), maximale und minimale Feret Durchmesser) zu generieren. Die Werte für diese Parameter dann mit manuell erhaltenen Werten verglichen wurden. Keine signifikanten Unterschiede zwischen beiden Modi der Analyse im Hinblick auf CSA, maximal- bzw. Minimalwert Feret Durchmesser beobachtet wurden (alle p > 0,05), die Genauigkeit unserer Methode angibt. So kann unser Immunostaining Analyse Protokoll zur Untersuchung der Auswirkungen auf die Muskelmasse Zusammensetzung in vielen Modellen des Alterns und Myopathie angewendet werden.

Einleitung

Es hat seit einiger Zeit bekannt, die Skelettmuskulatur aus Einzelfasern von vielen Arten1besteht. Zunächst wurden zwei Gruppen von Fasern anhand ihrer kontraktilen Eigenschaften charakterisiert und benannt, entsprechend langsam zuckenden (Typ I) und Fast-Twitch (Typ II). Diese Kategorien wurden auf der Grundlage der Faser Stoffwechsel weiter unterschieden. Da Typ-I-Fasern sind reich an Mitochondrien und angewiesen auf oxidativen Stoffwechsel, wurden sie aufgeklärt durch robust positiven Nicotinamid-Adenin-Dinucleotide-Tetrazolium-Reduktase (NADH-TR) Diaphorase2 oder Succinat Dehydrogenase (SDH)3 Färbung. Im Gegensatz dazu, Typ-II-Fasern weniger ausgestellt und Variablen Grad von NADH-TR Diaphorase oder SDH Färbung und wurden in zwei Fast-Twitch-Untergruppen unterteilt (Typ IIA und IIB Typ) etwas grob anhand ihrer relativen oxidativen Kapazitäten. Diese Unterscheidungen zwischen Fasern haben effektiver durch Myosin-ATPase Färbung visualisiert worden wo Typ I Fasern färben dunkel nach einer Vorinkubation bei pH 4.0 und Typ IIB Fasern absorbieren überstürzten folgende Vorinkubation bei pH 10,0 mit Typ IIA Fasern Färbung immer4.

Immunhistochemische Färbung des Myosin heavy Chain (MyHC) Isoformen hat vor kurzem eine feinere Diskriminator Fasertyp5entwickelt. Typ I, Typ IIA und Typ IIB Fasern können alle identifiziert werden mit Präzision, basierend auf ihrem MyHC Profil. Darüber hinaus eine weitere Fast-Twitch-metabolisch-Intermediate Fasertyp, Typ IIX, identifizierten6wurde. Hybrid-Fasern mit dem Ausdruck mehrere MyHC wurden auch bestätigten5,7,8. Einige Arten wie die Katze und der Pavian sind keine ausdrückliche Typ IIB MyHCs6bekannt. Obwohl MyHC Immunostaining derzeit die State-of-the-Art-Beurteilung der Muskel Zusammensetzung ist, ist die Analyse der Daten über diese Technik umständlich und zeitaufwändig ohne automatisierte Unterstützung. Zu diesem Zweck wurden eine Handvoll semi-automatischen Methoden, um diese Daten zu analysieren entwickelten5,9,10. Hier präsentieren wir Ihnen ein relativ Standardprotokoll für immunhistochemische Identifizierung der Muskelfaser-Typ5,7,8,10, zusammen mit einer teilautomatisierten Roman Algorithmus, der Analyse der Fasertyp und Faser Morphologie mit Genauigkeit beschleunigt.

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Protokoll

alle Verfahren, die Mäuse wurden von der University of Colorado-Anschutz Medical Campus institutionelle Animal Care und Use Committee genehmigt (91813(05)1D).

1. Tag1: primäre (1°) Immunostaining mit Bovine Serum Albumin (BSA) Blockierung

  1. an der Luft trocknen Gefrierschnitte Maus Megalosauridae Muskel (z. B. m. Tibialis anterior, Soleus) montiert auf aufgeladene Folien für ~ 30 min 11. zeichnen Sie einen Rahmen um die Abschnitte, die mit einem Stift hydrophobe Barriere PAP.
  2. Ort ~ 250 µL 5 % BSA/Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (BSA/PBS) auf jeder Folie, unspezifische Antikörperbindung zu blockieren. Inkubieren Sie Folien bei Raumtemperatur für 1 h
  3. Beim Blocken, bereiten 01:50 Verdünnungen des 1° Antikörpers Überstand in 5 % BSA/PBS (alle Maus monoklonale Antikörper sind; siehe Tabelle 1- 6 ,- 12) 250 µL vorbereiten Lösung pro Folie. ICE 1° Antikörper Aktien und Verdünnungen behalten

figure-protocol-1
Tabelle 1: Primärantikörper verwendet, um zu unterscheiden MyHCs.

  1. nach Aspiration von 5 % BSA/PBS blockierende Lösung hinzufügen 250 µL 1° Antikörper Verdünnung auf die entsprechenden Folien. Fügen Sie 250 µL 5 % BSA/PBS, sekundäre (2°) Antikörper nur negative Kontrolle gleitet.
  2. Inkubation bei 4 ° C für 24-48 h in einer feuchten Umgebung.
    Hinweis: Eine Petrischale in Alufolie mit angefeuchtetes Filterpapier bedeckt als eine geeignete Inkubationszeit Kammer dienen können.

2. Tag 2:2 ° Immunostaining mit fluoreszierenden Antikörpern

  1. Aspirieren 1° Antikörperlösung oder 5 % BSA/PBS Kontrolllösung. Waschen alle Folien drei Mal 10 min mit 5 % BSA.
  2. Beim Waschen, vorbereiten 1: 200 Verdünnungen der gereinigten, Fluorophor konjugiert 2° Antikörper in 5 % BSA/PBS (siehe Tabelle 2, alle sind Ziege Anti-Maus). Bereiten Sie 250 µL Lösung pro Folie. Halten Sie 2° Fluorophor-konjugierten Antikörpern im Dunkeln auf Ice

figure-protocol-2
Tabelle 2: Fluorophor-konjugierten Sekundärantikörper verwendet, um zu visualisieren primären Antikörper Anerkennung von MyHCs.

  1. nach Aspiration der dritten Anwendung von 5 % BSA/PBS blockierende Lösung, 250 µL 2° Antikörper Verdünnung auf alle Folien hinzufügen. 90 min bei Raumtemperatur in einem dunklen, feuchten Umgebung inkubieren.
  2. Aspirat 2° Antikörperlösung. Waschen alle Folien drei Mal 10 min mit 5 % BSA/PBS.
  3. Spülen mit PBS. Für 10 min. trocken
  4. Montieren das Deckglas mit eine befristete, niedrigviskose wässrige Eindeckmedium.
  5. Nach dem Trocknen die Folie Schnittflächen mit Nagellack versiegeln. Trocknen und bewahren Sie in einem dunklen Slidebox.

3. Folien mit Epifluoreszenz Microscopy Imaging

  1. reinigen Sie die Folien mit einem kleinen, 70 % Ethanol getränkten Lab-abwischen.
  2. Erhalten digitale Bilder von Immunostained Muskel Abschnitte mit einem Epifluoreszenz-Mikroskop mit einem fotografischen Apparat (siehe die Tabelle der Materialien) ausgestattet.
    1. Wählen Sie einen Bereich von ungefähr 1 mm 2 (10 X Objektiv, 1,4 NA).
    2. Ansicht Alexa 488 konjugiert 2° Antikörper Fluoreszenz über eine 505 nm lang-Pass-Filter. Anzeigen der Fluoreszenz durch Anregung von Alexa 594 konjugiert 2° Antikörper über einen 595 nm lang-Pass-Filter erzeugt. Digitalisieren von Bildern mit einem PC-Computer mit einem kompatiblen imaging-Software ausgestattet. Gehören die Maßstabsleiste von imaging-Software für die spätere Analyse.

4. Analyse von Bildern mit Fidschi

Hinweis: bevor Sie mit der Analyse, Fidschi (frei von den National Institutes of Health, Bethesda, MD erhältlich) über https://imagej.net/Fiji/Downloads installiert werden muss. Auch, wird das Makro in diesem Prozess verwendet in der Ergänzenden Datei bereitgestellt. Legen Sie die Makrodatei in einem leicht zugänglichen Verzeichnis.

  1. Last ein Hellfeld Bild eines ausgewählten Bereichs in Fidschi. Navigieren Sie zu Plugins → Segmentierung → trainierbar Weka Segmentierung.
  2. Um die zelluläre Bereiche des Abschnitts, vorschreiben zeichnen Sie eine Linie auf einer Faser, und klicken Sie auf " Klasse 1 hinzufügen ". Dann zeichnen Sie eine Linie auf den Raum zwischen den Fasern, und klicken Sie auf " Klasse 2 hinzufügen " anlässlich der extrazellulären Domänen. Wiederholen Sie, bis in jeder Klasse gibt es 5-10 Etiketten.
    1. Klick Zug Sichter. Auf die daraus resultierenden roten und grünen Overlay mehr Beschriftungen manuell hinzufügen (siehe Punkt 4.2), nicht falsch segmentierte Stücke des Bildes, wenn nötig. Wiederholen Sie, bis die Fasern (rot) aus dem Raum zwischen den Fasern (grün) entsprechend getrennt werden.
  3. Klicken Sie " erhalten Wahrscheinlichkeit " und speichern Sie das Bild in einem neu beschrifteten Ordner.
  4. Wiederholen Sie das oben beschriebene Verfahren (Schritte 4.2 4.3) mit dem fluoreszierenden Bild vom gleichen Feld übernommen. Beschriften Immunostained Fasern als " Klasse 1 " und alle nicht-fluoreszierende Regionen als " Klasse 2 ". Speichern Sie die resultierende Wahrscheinlichkeit Karte im selben Ordner wo das verarbeitete Hellfeld-Bild gespeichert.
  5. Öffnen Sie eine der zuvor gespeicherten Wahrscheinlichkeit Karten in Fidschi. Zeichnen einer geraden Linie auf der Skala von der imaging-Software zur Verfügung gestellt. Gehe zu analysieren → Maßstab festlegen. Ändern Sie die Parameter (d.h., bekannten Abstand und Einheit der Länge) auf ihre entsprechenden Werte als von der Maßstabsleiste gegeben, dann überprüfen Sie die " Global " Feld, um den Maßstab für jedes Bild zu standardisieren.
  6. Navigieren zu Plugins → Makros → laufen → Tyagi Et Al. Faser Quantifizierung macro.ijm (siehe die Zusätzliche Datei). Sofort erscheint ein Navigationsbereich. Öffnen Sie das Bild ' s Host Ordner; ein Dialogfeld wird angezeigt. Für jedes Dialogfeld ändern Sie die " Hintergrund " Dropdown-Wert zu " Licht. "
    Hinweis: der Ordner wird nun mit Bildern der Faser Umrisse und Tabellenkalkulationsdateien Software der Ergebnisse (CSA und Feret Durchmesser sind am relevantesten, gefüllt Quantifizierung der Faser Morphologie; gemessenen Parameter gesetzt Messungen analysieren einstellbar). Faser Morphologie Daten generiert durch die Pore-Analysefunktion von Fidschi Tabellenkalkulation Software-Dateien für beide Leuchtstoff- und hellen Bereich Bilder automatisch übertragen werden.
  7. Berechnet den Anteil der Fasern mit dem Ausdruck einer bestimmten MyHC in einem Feld dividiert die Anzahl der Fluoreszierende Fasern im Feld durch die Anzahl der insgesamt Fasern in das entsprechende Hellfeld Bild.

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Ergebnisse

Megalosauridae Muskeln (d.h., m. Tibialis anterior und Soleus) von einer männlichen C57BL/6-Maus des unbekannten Alters seziert wurden Flash-durch das Versenken eines Kunststoff-Formenbau, enthalten die Muskeln im OAT Verbindung in flüssigem Stickstoff gekühlt Isopentane eingefroren. Dann, mit einem Cryotome, 8-10 µm Schnittserien wurden schneiden bei-20 ° C und anderen positiv geladenen Glas-Folien-12übertragen.

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Diskussion

Hier haben wir nützliche Richtung für die Identifizierung des skelettartigen Muskels Fasertypen bereitgestellt. Dabei beschreiben wir einen neuartigen Algorithmus zur Analyse der Daten.

Da unsere Ergebnisse frühere Berichte5,8,10 bestätigen weitgehend und spiegeln unsere eigenen manuellen Messungen, erscheint der Algorithmus um genau zu sein. Allerdings stießen wir auf einige seltene experimentelle Fa...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine widerstreitenden Interessen offenzulegen.

Danksagungen

Wir sind dankbar die Boettcher-Stiftung und die Amyotrophe Lateralsklerose Association (#17-II-344) für ihre Unterstützung dieser Forschung.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
RinderserumalbuminSigma AldrichA9418-100G5% in PBS
Hydrophobe Barriere Pap PenScientific Gerät Labor9804-02
ObjektträgerGlobe Scientific1358W
DeckglasFisher Scientific12-544-E
ImmumountThermo Scientific9990402
NagellackL'Oréal
Nikon Eclipse TE-200 Inverses Fluoreszenz- und HellfeldmikroskopEingestellt SPOT
RT/KESPOT Imaging SolutionsRT940
Dell Optiplex
BA-F8 Primary AntikörperDevelopmental Studies Hybridom Bank an der University of Iowamonoklonale Maus IgG2b; 1:50
SC-71 PrimäreAntikörper-Entwicklungsstudien Hybridoma Bank an der University of Iowamonklonale Maus IgG1; 1:50
BF-F3 PrimäreAntikörper-Entwicklungsstudien Hybridoma Bank an der University of Iowamonoklonale Maus IgGM; 1:50
6H1 PrimäreAntikörper-Entwicklungsstudien Hybridoma Bank an der University of Iowamonoklonale Maus IgGM; 1:50
Alexa Fluor 594 Anti-IgG2bInvitrogenA21145Anti-Maus für Ziegen; 1:200
Alexa Fluor 488 gegen IgG1InvitrogenA21121Anti-Maus für Ziegen; 1:200
Alexa Fluor 594 Anti-IgGMInvitrogenA21044Ziege Anti-Maus; 1:200
OCTSakura Finetek4583
IsopentanFisher ScientificO3551-4kühl mit flüssigem Stickstoff
PBSFisher BioreagentsBP665-110x, verdünnen auf 1x
Kim-TücherKimberly-Clark06-666A

Referenzen

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