Summary
Inheemse polyacrylamide gelelektroforese is een fundamenteel hulpmiddel voor het analyseren van RNA-eiwitinteracties. Traditioneel hebben de meeste experimenten verticale gels gebruikt. Horizontale gels verschaffen echter verschillende voordelen, zoals de mogelijkheid om complexen te monitoren tijdens elektroforese. Wij bieden een gedetailleerd protocol voor het genereren en gebruiken van horizontale inheemse gelelektroforese.
Abstract
Inheemse polyacrylamide gelelektroforese is een fundamenteel instrument van moleculaire biologie die extensief is gebruikt voor de biochemische analyse van RNA-eiwitinteracties. Deze interacties zijn traditioneel geanalyseerd met polyacrylamidegels die worden gegenereerd tussen twee glazen platen en monsters die verticaal worden geforoteerd. Polyacrylamide gels die in bakken worden gegoten en elektroforeseer horizontaal bieden echter verschillende voordelen. Bijvoorbeeld, horizontale gels die gebruikt worden om complexen te analyseren tussen fluorescerende RNA-substraten en specifieke eiwitten kunnen meerdere malen worden weergegeven als elektroforese vordert. Dit biedt de unieke mogelijkheid om RNA-eiwitcomplexen op verschillende punten tijdens het experiment te volgen. Daarnaast maakt horizontale gelelektroforese het mogelijk om veel monsters parallel te analyseren. Dit kan de tijdcursusproeven aanzienlijk vergemakkelijken en meerdere reacties tegelijk analyseren om verschillende componenten en condities te vergelijken. Hier prOvide een gedetailleerd protocol voor het genereren en gebruiken van horizontale inheemse gelelektroforese voor het analyseren van RNA-eiwitinteracties.
Introduction
Elektroforetische mobiliteitsverschuivingsbepalingen (EMSA's) blijken een waardevol biochemisch instrument te zijn om specifieke eiwit-nucleïnezuurinteracties 1 , 2 , 3 te analyseren. Deze analyses kunnen belangrijke informatie verschaffen over de bindingsaffiniteit van eiwitten aan RNA of DNA 3 , de componentstochiometrie van nucleïnezuur-eiwitcomplexen 1 en verschaffen belangrijke nieuwe inzichten over de bindingsspecificiteit van RNA bindende eiwitten via substraatconcurrentie experimenten 1 .
De traditionele experimentele opstelling voor deze analyses bestaat uit het mengen van gezuiverd eiwit met een radioactief gemerkt RNA-substraat. De resulterende complexen worden vervolgens geanalyseerd met niet-denaturerende (inheemse) polyacrylamidegelen die tussen twee glazen platen worden gegoten, gevolgd door monsterelektroforese in een verticaal apparaat 3. Hoewel deze benadering extensief is gebruikt om belangrijke inzichten te verschaffen in de biochemische mechanismen die de binding van eiwitten tot nucleïnezuren onderbouwen, heeft het ook verschillende beperkingen. Deze basisstrategie heeft bijvoorbeeld een relatief lage doorvoer en het is niet gemakkelijk aan te passen voor toepassingen waarbij parallel bindende reacties nodig zijn. Bovendien is het bij het traditionele verticale apparaat uitdagend om meerdere keren complexen mogelijk te houden tijdens elektroforese 3 , 4 .
Hier presenteren we een aanpassing van de EMSA-analyse die gebruik maakt van inheemse polyacrylamidegels die worden gegoten in een flatbed apparaat, horizontale elektroforese en fluorescent gelabelde RNA substraten 4 , 5 , 6 , 7 . De opneming van deze relatief eenvoudige wijzigingen van de basis straTegy biedt een aantal sterke voordelen. In het bijzonder leent het horizontale platform formaat zich gemakkelijk om tientallen monsters tegelijkertijd 4 te analyseren. Ook voor sommige RNA-eiwitcomplexen, zoals die gevormd tussen het Bicaudal-C-eiwit en zijn RNA-substraatelektroforese in een horizontale gel, verschaft een verhoogd vermogen om afzonderlijke RNA-eiwitcomplexen op te lossen en deze te onderscheiden van het niet-gebonden RNA-substraat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereiding van de Horizontale Native Polyacrylamide Gel 4 .
- Voorbereiding van de benodigde materialen.
- Voor het horizontale gelapparaat gebruik een gelendoos (37 cm x 24 cm) met een 27 cm x 21 cm lade en een capaciteit voor twee combinaties met 24 putjes. Deze installatie biedt in totaal 48 monsters die tegelijkertijd kunnen worden geanalyseerd.
- Bereid de volgende reagentia voor: 40% Acrylamide-Bis 19: 1, 5x TBE (Tris-Borate-EDTA pH 8,0), TEMED en 10% APS (ammoniumpersulfaat).
- Generatie van een 10% native acrylamide gel.
- Voeg in een 500 ml fles 80 ml 5x TBE, 100 ml 40% acrylamide en water toe aan een eindvolume van 400 ml.
- Voeg 4 ml 10% APS en 400 μL TEMED toe. Goed mengen.
- Giet de mix in de horizontale gietbak en laat de gel 30 minuten polymeriseren. De gel zal ongeveer 2 cm dik zijn.
OPMERKING: Gelegels kunnen snel in een dampkap werpenUp polymerisatie. Na polymerisatie blijft een dunne laag vloeistof boven op de gel. - Giet de vloeistof af en spoel met rennende buffer. Verwijder de kam (en) zorgvuldig en spoel de putjes met rennende buffer met een spuit.
- Bereiding van loopbuffer.
- Bereid 2 L van 1x TBE loopbuffer voor de gelkast. Verdun 400 ml 5XTBE met 1600 ml en meng. Plaats 1x TBE buffer in de koude kamer om af te koelen.
- Voorloop van de gel
- Voeg 2 liter koudloopbuffer aan de gelkastoos toe en plaats de gel.
- Pre-run de gel bij 120 V gedurende 1 uur bij 4 ° C in een koude kamer. Bereid tijdens deze tijd de bindingsreactie.
2. Bindende reactie 8
- 2.1.Perpareer de volgende reactiekomponenten.
20 mM DTT
10 mM BSA
10 mM gist tRNAs
5x bindingsbuffer (50 mM HEPES pH 8,0, 5 mM EDTA, 250 mM KCl, 0,2% Tween-20)
100 nM fluoresceïne gelabelde RNA commercieel gekocht
Geconcentreerd Bicaudal-C eiwit
50% glycerol in met DEPC behandeld H2O
DEPC behandeld H2O - Monteer de bindingsreactiekomponenten in een RNase-vrije microcentrifugebuis.
- Voeg bij de buis 5 μl 10 mM BSA, 5 μl 20 mM DTT, 5 μl 10 mM gist tRNAs, 10 μl 5x bindende buffer.
- Voeg eiwit toe aan een eindconcentratie van 250 nM in 50 μl. Voeg water toe aan een eindvolume van 45 μl.
- Voeg 5 μl fluorescent gemerkt RNA substraat toe. Gebruik een in de handel verkochte 3 'fluoresceïne gelabelde 32-nucleotide substraat.
- Meng en incubeer in het donker gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
3. Analyse van monsters op de natuurlijke horizontale polyacrylamide gel
- Voeg bij elke reactie 15 μL 50% glycerol toe en meng zachtjes.
- CarefuVoeg 30 μl van elke reactie op de gel toe. De hoeveelheid monster die in een enkele put kan worden geladen, varieert afhankelijk van de dikte van de gel en de grootte van de putten. We hebben geladen volumes tot 15 μL en zo veel als 45 μL in een enkele bron van gels gecreëerd met een 24-brons kam en gegoten tot een dikte van 2 cm.
- Nadat u de stroomtoevoer aan de gelapparatuurschakelaar aan het stopcontact hebt aangesloten en de spanning aanpast. Run de gel in 4 ° C op 120 V.
OPMERKING: Voor het horizontale gelapparaat komt dit overeen met ongeveer 5 V / cm. Voor het verticale gelapparaat is dit 16 V / cm.- Om schade of bleken van het fluorescent gelabelde RNA te voorkomen, voer elektroforese in het donker.
- Variërende elektroforese tijden afhankelijk van de specifieke kenmerken van het RNA-eiwit complex dat wordt geanalyseerd.
OPMERKING: Een belangrijk voordeel van de horizontale EMSA analyse is dat elektroforese kan worden gestopt, de gel afgebeeld en vervolgens de geIk kan terug in het apparaat worden geplaatst en elektroforese kan langer worden voortgezet.
4. Imaging de Gel
- Analyse uitvoeren met elk instrument dat is ontworpen voor het detecteren en imaging van fluorescerende substraten.
- Plaats de gel op de imager.
- Beeldinstellingen aanpassen. Voor fluoresceine-gelabelde RNA liganden, gebruik de volgende instellingen: FAM (golflengte 473 nm), 750 fotomultiplierspanning (PMT), 100 μm pixelgrootte.
- Scan de gel om de afbeelding vast te leggen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om de kracht en de veelzijdigheid van de horizontale inheemse gelelektroforese te demonstreren hebben we de binding van het Xenopus Bicaudal-C (Bicc1) eiwit geanalyseerd aan een fluorescent gemerkt RNA dat een Bicc1 bindingsplaats bevat. Bicc1-eiwitten functioneren als mRNA-specifieke translatie-repressors om de beslissingen van het celfeest tijdens de moederstadia van dierlijke ontwikkeling 9 , 10 , 11 , 12 te controleren , evenals de functies van specifieke organen in volwassenen 13 , 14 . Ons werk in Xenopus identificeerde de eerste bindingsplaats voor een Bicc1 eiwit 8 : een 32-nucleotide regio uit de 3'UTR van het Cripto-1 mRNA 8 , 12 . Deze bindingsplaats werd gedefinieerd onder toepassing van een combinatie van technieken: RNase-beschermingIonen- en voetafdrukassays, in vivo bindingsexperimenten en in vitro EMSA assays 8 .
Gezuiverd Xenopus Bicc1 eiwit werd gemengd met een fluorescent gelabelde 32 nucleotide RNA; De Bicc-bindingsplaats van het Cripto-1 mRNA 8 . In een aparte reactie werd Bicc1-eiwit gemengd met een fluorescent gemerkt 32 nucleotide RNA afgeleid van de 3'UTR van het cyclin B1 mRNA. Bicc1 bindt niet aan het cyclin B1 mRNA 8 , 12 en dit RNA dient als een negatieve controle. De helft van elke reactie werd geanalyseerd op een verticale inheemse polyacrylamidegel ( Figuur 1A ) terwijl het andere gedeelte parallel werd geanalyseerd met behulp van horizontale inheemse gel ( Figuur 1B ). Het is gemakkelijk zichtbaar met behulp van een van beide methoden die Bicc1 bindt aan het RNA Cripto-1 RNA en vormt een specifiek complex aEn bindt het cyclin B1 negatieve controle RNA niet. Echter, de Bicc1-Cripto-1 complexen zijn significant meer duidelijk wanneer ze geanalyseerd worden met de horizontale gel, die beide hun detectie vergemakkelijken en de discriminatie van eiwit-RNA complexen van ongebonden RNA mogelijk maken. Na afbeelden werd de gel teruggebracht in het gelapparaat en gedurende een verdere drie en een half uur elektroforeseerbaar gemaakt. Na het opnieuw imaging van de gel hadden de complexen verder gemigreerd en waren ze nog steeds gemakkelijk te detecteren, wat hun stabiliteit aangeeft ( Figuur 1C ). Deze mogelijkheid om elektroforese en analyse na de eerste beeldvorming door te gaan zou uitdagend zijn, indien niet onmogelijk, met het verticale gelformaat.
Figuur 1: Een vergelijking van de verticale en de horizontale natieve gels voor het analyseren van de binding van Bicc1 tot Cripto1 RNA. BiCc1 bindende experimenten werden uitgevoerd met een 32-nucleotide fluorescerende CyclinB1 RNA negatieve controle of een fluorescerende Crypto1 RNA positieve controle van 32 nucleotiden. Elke reactie bevatte 0 nM of 250 nM SUMO-Bicc1 N-terminale en geanalyseerd op ofwel een ( A ) verticale polyacrylamide native gel run gedurende 30 minuten bij 120 V bij 4 ° C of als duplicaatmonsters in de horizontale polyacrylamide native gel voor ( B ) 2 uur bij 120 V bij 4 ° C of ( C ) 5,5 uur bij 120 V bij 4 ° C. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Inheemse polyacrylamidegelen zijn een waardevol hulpmiddel om eiwit-RNA-interacties te onderzoeken en traditioneel worden deze gels verticaal 2 , 3 elektroforeseert. Wij hebben een wijziging van het protocol gebruikt dat de inheemse polyacrylamide gels creëert en horizontaal 1 , 4 , 6 , 7 , 15 elektroforeseert. Deze veranderingen die worden gebruikt in combinatie met fluorescent gelabelde RNA substraten verschaffen talrijke voordelen voor de biochemische analyse van eiwit-RNA bindende interacties. Deze voordelen omvatten het volgende: het mengen van buffers wordt vereenvoudigd in vergelijking met een verticaal apparaat dat een pomp nodig heeft om buffer van de onderste kamer naar de bovenkant over te brengen, horizontale gels kunnen worden gegenereerd met grotere putjes die een verhoogde capaciteit voor het analyseren van larvenGer monsters, elektroforese op horizontale gels zorgen vaak voor verbeterde resolutie van RNA-eiwit complexen in vergelijking met verticale gels, en horizontale gelelektroforese biedt de mogelijkheid om beeld experimenten op meerdere tijdspunten tijdens analyse.
Een ander belangrijk voordeel is dat het horizontale formaat leent zich op het creëren van gels met een groot aantal putten die de mogelijkheid bieden om meerdere monsters in parallel 1 te analyseren. Deze functie vergroot hun gebruik aanzienlijk als een biochemisch hulpmiddel voor het analyseren van RNA-eiwitinteracties. Het vermogen om meerdere monsters te analyseren, vergemakkelijkt bijvoorbeeld het onderzoeken van de kwantitatieve parameters van eiwit-RNA complexvorming door het gebruik van mededingingsexperimenten 15 , k uit analyse 15 en experimenten die zijn ontworpen om de stoichiometrie van de bindcomplexcomponenten 15 te definiëren. Daarnaast is het gebruik van aFluorescerende RNA-substraten maakt het mogelijk om meerdere analyses uit te voeren, zoals fluorescentie polarisatie bindingsbepalingen uit een enkele reactie en verkrijgen zowel kwantitatieve als kwalitatieve bindingsgegevens 5 , 15 .
Om optimale resultaten te verkrijgen van de horizontale gel setup, zijn er verschillende parameters die kunnen worden aangepast om de kwaliteit van de complexen voor beeldvorming te verbeteren. Dit omvat onder meer het acrylamide percentage van de gel om het gemakkelijker te maken om de scheiding van eiwit-RNA complexen van vrij RNA meer te verwerken en te verbeteren. Het kan echter moeilijk zijn om een laag percentage acrylamide gels te hanteren vanwege de grootte. We vinden het makkelijkst om gels te gebruiken die een acrylamide-concentratie hebben van 7,5 of meer. Ook indien nodig kunnen de elektroforese condities worden veranderd om de stabiliteit van eiwit-RNA complexen te verbeteren; De elektroforese spanning aanpassen, de gel laten lopen bij kamertemperatuur insteAdvertentie van 4 ° C en aanpassing van de voorlopige condities.
Ondanks de vele voordelen zijn er ook enkele beperkingen van horizontale inheemse gelelektroforese-analyses. Bijvoorbeeld, het nut ervan wordt gemaximaliseerd door gebruik te maken van een fluorescerende RNA substraten. Afhankelijk van de gekozen fluorofoor en de grootte van RNA kan het verkrijgen van dergelijke substraten duur zijn. Bovendien zijn horizontale gels over het algemeen veel groter dan verticale gels en vereisen daarom grotere hoeveelheden materiaal zoals polyacrylamide- en DEPC-behandelde oplossingen.
Horizontale inheemse gelelektroforese heeft het potentieel om te worden gebruikt als een validatie tool voor moleculaire schermen die proberen te identificeren verbindingen die klinisch relevante RNA-eiwitinteracties targeten 16 . Dergelijke schermen gebruiken gewoonlijk biochemische analyses voor het oplossen van relevante verbindingen voor verdere studie. Het hogere doorvoercapaciteit van het horizontale formaat in vergelijking met het verticale formaatEen kans om inheemse gelelektroforese toe te passen als hulpmiddel voor secundaire validatie van potentiële kandidaten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We danken Laura Vanderploeg voor het voorbereiden van cijfers. Werk in het laboratorium Sheets wordt ondersteund door NSF grant 1050395 en NIH grant (R21HD076828). Werk in het Ryder lab wordt ondersteund door NIH subsidies R01GM117237 en R01GM117008. Megan Dowdle wordt ondersteund door een SciMed GRS Advanced Opportunity Fellowship door het University of Wisconsin-Madison Graduate School en Biotechnology Training Programma door het Nationaal Instituut voor Algemene Medische Wetenschappen van de National Institutes of Health (T32GM008349).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Horizontal Gel Box | OWL | N/A | Product no longer made. Similar gel boxes can be found at Thermo Scientific, A-series gel boxes. Catalog Number: A2-BP |
| 24-well large large horizontal gel electrophoresis combs | OWL | N/A | Product no longer made. Similar gel boxes can be found at Thermo Scientific, A-series gel box combs. Catalog Number: A2-24C |
| Powerpac 300 | Bio-Rad | 1655050 | |
| Mini-Protean II Electrophoresis Cell | Bio-Rad | 165-2940 | |
| InstaPAGE-19 40% 19:1 Acrylamide/Bis | IBI | IB70015 | |
| TEMED | IBI | IB70120 | |
| APS | IBI | IB70080 | |
| Yeast tRNAs | Ambion | AM7119 | |
| Fluorescein labeled RNA | IDT | N/A | Order can be made custom to length and desired sequence |
| EDTA tetrasodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | E5391-1KG | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-500G | |
| Tris Base Ultrapure | US Biological | T8600 | |
| Boric Acid | Fisher Scientific | BP168-500 | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-1 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| DEPC | Sigma-Aldrich | 1609-47-8 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 3483 12 3 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 9048-46-8 |
References
- Ryder, S. P., Recht, M. I., Williamson, J. R. Quantitative analysis of protein-RNA interactions by gel mobility shift. Methods Mol Biol. 488, 99-115 (2008).
- Dahlberg, A. E., Dingman, C. W., Peacock, A. C. Electrophoretic characterization of bacterial polyribosomes in agarose-acrylamide composite gels. J Mol Biol. 41 (1), 139-147 (1969).
- Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nat Protoc. 2 (8), 1849-1861 (2007).
- Pagano, J. M., Farley, B. M., Essien, K. I., Ryder, S. P. RNA recognition by the embryonic cell fate determinant and germline totipotency factor MEX-3. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (48), 20252-20257 (2009).
- Royer, C. A., Scarlata, S. F. Fluorescence approaches to quantifying biomolecular interactions. Meth Enzymol. 450, 79-106 (2008).
- Su, C., Wang, F., Ciolek, D., Pan, Y. C. Electrophoresis of proteins and protein-protein complexes in native polyacrylamide gels using a horizontal gel apparatus. Anal Biochem. 223, 93-98 (1994).
- Buczek, P., Horvath, M. P. Thermodynamic Characterization of Binding Oxytricha nova Single Strand Telomere DNA with the Alpha Protein N-terminal Domain. J Mol Biol. 359 (5), 1217-1234 (2006).
- Zhang, Y., Park, S., Blaser, S., Sheets, M. D. Determinants of RNA binding and translational repression by the Bicaudal-C regulatory protein. J Biol Chem. 289 (11), 7497-7504 (2014).
- Gamberi, C., Lasko, P. The Bic-C family of developmental translational regulators. Comp Funct Genomics. , 141386 (2012).
- Saffman, E. E., et al. Premature translation of oskar in oocytes lacking the RNA-binding protein bicaudal-C. Mol Cell Biol. 18 (8), 4855-4862 (1998).
- Chicoine, J., et al. Bicaudal-C recruits CCR4-NOT deadenylase to target mRNAs and regulates oogenesis, cytoskeletal organization, and its own expression. Dev Cell. 13 (5), 691-704 (2007).
- Zhang, Y., et al. Bicaudal-C spatially controls translation of vertebrate maternal mRNAs. RNA. 19 (11), 1575-1582 (2013).
- Maisonneuve, C., et al. Bicaudal C, a novel regulator of Dvl signaling abutting RNA-processing bodies, controls cilia orientation and leftward flow. Development. 136 (17), 3019-3030 (2009).
- Tran, U., et al. The RNA-binding protein bicaudal C regulates polycystin 2 in the kidney by antagonizing miR-17 activity. Development. 137 (7), 1107-1116 (2010).
- Pagano, J. M., Clingman, C. C., Ryder, S. P. Quantitative approaches to monitor protein-nucleic acid interactions using fluorescent probes. RNA. 17 (1), 14-20 (2011).
- Foley, T. L., et al. Platform to Enable the Pharmacological Profiling of Small Molecules in Gel-Based Electrophoretic Mobility Shift Assays. J Biomol Screen. 21 (10), 1125-1131 (2016).
