Horizontale Gel-Elektrophorese zur verbesserten Nachweis von Protein-RNA-Komplexen

Zusammenfassung

Native Polyacrylamid-Gelelektrophorese ist ein grundlegendes Instrument zur Analyse von RNA-Protein-Wechselwirkungen. Traditionell haben die meisten Experimente vertikale Gele verwendet. Jedoch bieten horizontale Gele mehrere Vorteile, wie die Möglichkeit, Komplexe während der Elektrophorese zu überwachen. Wir stellen ein detailliertes Protokoll für die Erzeugung und Verwendung von horizontalen nativen Gelelektrophorese zur Verfügung.

Zusammenfassung

Die native Polyacrylamid-Gelelektrophorese ist ein grundlegendes Werkzeug der Molekularbiologie, das ausgiebig für die biochemische Analyse von RNA-Protein-Wechselwirkungen verwendet wurde. Diese Wechselwirkungen wurden traditionell mit Polyacrylamidgelen analysiert, die zwischen zwei Glasplatten und Proben hergestellt wurden, die vertikal elektrophoretisch wurden. Allerdings bieten Polyacrylamidgele, die in Tabletts gegossen und horizontal elektrophoresiert werden, mehrere Vorteile. Zum Beispiel können horizontale Gele, die verwendet werden, um Komplexe zwischen fluoreszierenden RNA-Substraten und spezifischen Proteinen zu analysieren, mehrfach abgebildet werden, wenn die Elektrophorese fortschreitet. Dies bietet die einzigartige Möglichkeit, RNA-Protein-Komplexe an mehreren Punkten während des Experiments zu überwachen. Darüber hinaus ermöglicht die horizontale Gelelektrophorese, mehrere Proben parallel zu analysieren. Dies erleichtert die zeitlichen Verlaufsexperimente und analysiert gleichzeitig mehrere Reaktionen, um verschiedene Komponenten und Bedingungen miteinander zu vergleichen. Hier sind wir prOvide ein detailliertes Protokoll zur Erzeugung und Verwendung von horizontalen nativen Gelelektrophorese zur Analyse von RNA-Protein-Wechselwirkungen.

Einleitung

Elektrophoretische Mobilitätsverschiebungsassays (EMSAs) haben sich als ein unschätzbares biochemisches Instrument erwiesen, um spezifische Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen ^{1 , 2 , 3} zu analysieren. Diese Assays können wichtige Informationen in Bezug auf die Bindungsaffinität von Proteinen an RNA oder DNA ^3, die Komponente Stöchiometrie von Nukleinsäure-Protein - Komplexe ¹ und liefern wichtige neue Erkenntnisse über die Bindungsspezifität der RNA - Bindeproteine via Substrat Kompetitionsexperimente ^1.

Protokoll

1. Herstellung des horizontalen nativen Polyacrylamidgels ⁴ .

1. Vorbereitung der benötigten Materialien.
   1. Für die horizontale Gel-Apparatur verwenden Sie eine Gel-Box (37 cm x 24 cm) mit einem 27 cm x 21 cm Tablett und eine Kapazität für zwei 24-Well-Kämme. Dieses Setup bietet insgesamt 48 Samples, die gleichzeitig analysiert werden können.
   2. Bereiten Sie die folgenden Reagenzien vor: 40% Acrylamid-Bis 19: 1, 5x TBE (Tris-Borat-EDTA pH 8,0), TEMED und 10% APS (Ammoniumpersulfat).
2. Erzeugung eines 10% nativen Acrylamidgels
   1. In einem 500 ml-Kolben werden 80 ml ....

Ergebnisse

Um die Leistungsfähigkeit und Vielseitigkeit der horizontalen nativen Gelelektrophorese zu demonstrieren, analysierten wir die Bindung des Xenopus Bicaudal-C (Bicc1) Proteins an eine fluoreszenzmarkierte RNA, die eine Bicc1-Bindungsstelle enthielt. Bicc1-Proteine ​​fungieren als mRNA-spezifische Translationsrepressoren zur Kontrolle der Zellschicksalentscheidungen während der mütterlichen Stadien der Tierentwicklung ^{9 , 10}

Diskussion

Native Polyacrylamidgele sind ein unschätzbares Hilfsmittel zur Untersuchung von Protein-RNA-Wechselwirkungen und traditionell werden diese Gele vertikal ^{2 , 3} elektrophoresiert. Wir haben eine Modifikation des Protokolls verwendet, das native Polyacrylamidgele ersetzt, die horizontal hergestellt und elektrophoresiert werden ^{1 , 4 , 6 , 7}

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Horizontale Gelbox	OWL	N/A	Produkt wird nicht mehr hergestellt. Ähnliche Gelboxen finden Sie bei Thermo Scientific, Gelboxen der A-Serie. Katalognummer: A2-BP
24-Well große große große horizontale Gelelektrophoresekämme	OWL	N/A	Produkt wird nicht mehr hergestellt. Ähnliche Gelboxen finden Sie bei Thermo Scientific, Gelboxkämme der A-Serie. Katalognummer: A2-24C
Powerpac 300	Bio-Rad	1655050
Mini-Protean II Elektrophoresezelle	Bio-Rad	165-2940
InstaPAGE-19 40% 19:1 Acrylamid/Bis	IBI	IB70015
TEMED	IBI	IB70120
APS	IBI	IB70080
Hefe-tRNAs	Ambion	AM7119
Fluorescein markiert RNA	IDT	N/A	Bestellung kann individuell auf Länge und gewünschte Sequenz zugeschnitten werden
EDTA Tetranatriumsalzhydrat	Sigma-Aldrich	E5391-1KG
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034-500G
Tris Base Ultrapure	US Biological	T8600
Borsäure	Fisher Scientific	BP168-500
Kaliumchlorid	Fisher Scientific	BP366-1
Tween-20	Fisher Scientific	BP337-500
DEPC	Sigma-Aldrich	1609-47-8
Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	3483 12 3
Rinderserumalbumin (BSA)	Sigma-Aldrich	9048-46-8