Summary
יליד polyacrylamide ג'ל אלקטרופורזה היא כלי בסיסי לניתוח אינטראקציות רנ"א חלבון. באופן מסורתי רוב הניסויים השתמשו בג'לים אנכיים. עם זאת, ג 'לים אופקית לספק מספר יתרונות, כגון הזדמנות לפקח מתחמי במהלך אלקטרופורזה. אנו מספקים פרוטוקול מפורט להפקת ושימוש אופקי גלוקל אלקטרופורזה הילידים.
Abstract
יליד polyacrylamide ג'ל אלקטרופורזה היא כלי בסיסי של ביולוגיה מולקולרית אשר שימש בהרחבה לניתוח ביוכימי של אינטראקציות רנ"א חלבון. אינטראקציות אלה ניתחו באופן מסורתי עם ג'ל polyacrylamide שנוצר בין שתי צלחות זכוכית דגימות electrophoresed אנכית. עם זאת, ג 'ל polyacrylamide יצוק מגשים electrophoresed אופקית מציעה מספר יתרונות. לדוגמה, ג 'לים אופקי המשמש כדי לנתח מתחמי בין מצעים RNA פלואורסצנטי חלבונים ספציפיים ניתן הדמיה מספר פעמים כמו אלקטרופורזה מתקדמת. זה מספק הזדמנות ייחודית לפקח על מתחמי RNA חלבונים בכמה נקודות במהלך הניסוי. בנוסף, אלקטרופורזה ג'ל אופקית מאפשרת לנתח דוגמאות רבות במקביל. זה יכול מאוד להקל על הניסויים כמובן כמובן, כמו גם ניתוח של מספר רב של תגובות בו זמנית להשוות רכיבים שונים ותנאים. הנה אנחנו יחסי ציבורOvide פרוטוקול מפורט להפקת ושימוש אופקית אלקטרופורזה הילידים אופקי לניתוח אינטראקציות RNA-Protein.
Introduction
מבחני מעבר ניידות אלקטרופורטית (EMSAs) הוכיחו להיות כלי ביוכימי שלא יסולא בפז לנתח אינטראקציות ספציפיות לחלבון-חומצה גרעינית 1 , 2 , 3 . מבחני אלה יכולים לספק מידע חשוב לגבי זיקה מחייב של חלבונים ל- RNA או DNA 3 , stoichiometry מרכיב של מתחמי חומצה גרעין 1 ולספק תובנות חדשות חשובות על הייחודיות מחייב של חלבונים RNA מחייב באמצעות ניסויים בתחרות המצע 1 .
ההגדרה הניסויית המסורתית עבור מבחני אלה מורכב ערבוב חלבון מטוהרים עם המצע RNA radiolabeled. מתחמי שהתקבלו לאחר מכן מנותחים עם הלא denaturing (יליד) ג 'ל polyacrylamide שפכו בין שתי צלחות זכוכית ואחריו electrophoresis מדגם במנגנון אנכי 3. בעוד גישה זו שימשה באופן ממצה כדי לספק תובנות חשובות במנגנונים הביוכימיים שבבסיס מחייב של חלבונים לחומצות גרעין, יש לה גם מספר מגבלות. לדוגמה, לאסטרטגיה בסיסית זו יש תפוקה נמוכה יחסית והיא אינה ניתנת להתאמה בקלות עבור יישומים הדורשים ניתוח של תגובות מחייבות רבות במקביל. בנוסף, עם המנגנון האנכי המסורתי זה מאתגר פוטנציאלי לפקח מתחמים במספר פעמים במהלך אלקטרופורזה 3 , 4 .
כאן אנו מציגים הסתגלות של assay EMSA המשתמשת ג 'ל polyacrylamide יליד יצוק מכשיר שטוח, אלקטרופורזה אופקית ו fluorescently שכותרתו RNA מצעים 4 , 5 , 6 , 7 . שילובם של שינויים פשוטים יחסית אלהTegy מספק כמה יתרונות חזקים. בפרט, פורמט שטוח אופקי בקלות משאיל את עצמו לנתח עשרות דגימות בו זמנית 4 . כמו כן, עבור כמה מתחמי RNA חלבונים, כגון אלה שנוצרו בין החלבון Bicaudal-C ו אלקטרופורזה המצע RNA שלה בג'ל אופקי מספק יכולת מוגברת כדי לפתור שונים RNA חלבונים מתחמי להפלות אלה ממצע רנ"א מאוגד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת ג 'ל אופקי הילידים Polyacrylamide ג'ל 4 .
- הכנת החומרים הדרושים.
- עבור מכשיר ג'ל אופקי, השתמש בתיבת ג'ל (37 ס"מ x 24 ס"מ) עם מגש 27 ס"מ x 21 ס"מ ויכולת עבור שתי מסרקים 24 היטב. התקנה זו מספקת סך של 48 דגימות שניתן לנתח בו זמנית.
- הכן את ריאגנטים הבאים: 40% Acrylamide-Bis 19: 1, 5x TBE (Tris-Borate-EDTA pH 8.0), TEMED, ו 10% APS (persulfate אמוניום).
- דור של 10% יליד אקרילמיד היל.
- בתוך בקבוק 500 מ"ל, מוסיפים 80 מ"ל של TBE 5x, 100 מ"ל של 40% acrylamide, ו מים נפח סופי של 400 מ"ל.
- הוסף 4 מ"ל של APS 10% ו 400 μL של TEMED. לערבב היטב.
- יוצקים את התערובת לתוך מגש הליהוק האופקי ומאפשרים את הג'ל לפלמור במשך 30 דקות. הג'ל יהיה בערך 2 ס"מ עובי.
הערה: ג 'לים יכול להטיל על מכסה המנוע קטר כדי להאיץ- פילמור. לאחר פילמור, שכבה דקה של נוזל יישאר על גבי הג'ל. - יוצקים את הנוזל ואת לשטוף עם חיץ פועל. הסר את המסרק (ים) בזהירות ולשטוף את הבארות עם חיץ פועל באמצעות מזרק.
- הכנת מאגר חיץ.
- הכן 2 L של 1x TBE פועל מאגר עבור תיבת ג'ל. מדולל 400 מ"ל של 5XTBE עם 1600 מ"ל ומערבבים. מקום 1x TBE חיץ בחדר קר להתקרר.
- טרום הפעלת ג'ל
- הוסף 2 L למאגר ריצה קר לתיבת ג'ל ולהכניס את הג'ל.
- טרום להפעיל את הג'ל ב 120 V במשך שעה 1 ב 4 ° C בחדר קר. במהלך תקופה זו, להכין את התגובה מחייב.
2. תגובה מחייב 8
- 2.1.הכנה את רכיבי התגובה הבאים.
20 מ"מ DTT
10 מ"מ BSA
10 mM שמרים tRNAs
חיץ 5X מחייב (50 מ"מ HEPES pH 8.0, 5 מ"מ EDTA, 250 מ"מ KCl, 0.2% Tween-20)
100 פלואורסצין ננומטר שכותרתו RNA מסחרית
חלבון Bicudal C מרוכז
50% גליצרול ב DEPC שטופלו H 2 O
DEPC שטופלו H 2 O - להרכיב את רכיבי התגובה מחייב צינור RNase חופשי microcentrifuge.
- כדי הצינור, להוסיף 5 μL של 10 מ"מ BSA, 5 μL של 20 מ"מ DTT, 5 μL של 10 mM שמרים tRNAs, 10 μL של הצפת 5x מחייב.
- הוסף חלבון לריכוז סופי של 250 ננומטר ב 50 μL. הוסף מים לנפח סופי של 45 μL.
- הוסף 5 μL של המצע RNA שכותרתו fluorescently. השתמש מסחרי שנרכש 3 'פלואורסצין שכותרתו 32 מצע נוקליאוטידים.
- מערבבים ו דגירה בחושך במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
3. ניתוח של דוגמאות על הילידים אופקית Polyacrylamide ג'ל
- לכל תגובה, להוסיף 15 μL של גליצרול 50% ומערבבים בעדינות.
- CarefuLly להוסיף 30 μL של כל תגובה לג'ל. כמות המדגם שניתן לטעון לתוך באר אחת משתנה בהתאם לעובי של ג 'ל ואת גודל הבארות. יש לנו כרכים טעון כמו μL 15 ו עד 45 μL לתוך באר אחת של ג'לים שנוצרו עם מסרק 24 גם שפכו לעובי של 2 ס"מ.
- לאחר חיבור ספק הכוח למתג הג 'ל על הכוח ולהתאים את המתח. הפעל את הג'ל ב 4 ° C ב 120 V.
הערה: עבור מכשיר ג'ל אופקית, זה בסופו של דבר להיות כ 5 V / cm. עבור מכשיר ג'ל אנכי, זה 16 V / cm.- כדי למנוע נזק או הלבנה של RNA שכותרתו fluorescently, לנהל אלקטרופורזה בחושך.
- פעמים אלקטרופורזה משתנה בהתאם הפרטים של קומפלקס חלבון רנ"א להיות מנותח.
הערה: יתרון גדול של ניתוח אופקי EMSA הוא אלקטרופורזה ניתן לעצור, הג'ל צילמו ולאחר מכן את geאני יכול להיות ממוקם בחזרה לתוך מנגנון אלקטרופורזה ניתן להמשיך עוד פעמים.
4. הדמיה ג'ל
- בצע ניתוח עם כל מכשיר המיועד לזיהוי וצילום פלואורסצנטי הדמיה.
- מניחים את הג'ל על imager.
- התאם הגדרות imager. עבור ligands RNA fluorescein שכותרתו, השתמש בהגדרות הבאות: FAM (אורך גל 473 ננומטר), 750 מתח מכפיל (PMT), 100 פיקסלים פיקסל גודל.
- סרוק את הג'ל כדי ללכוד תמונה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כדי להדגים את הכוח ואת צדדיות של אופקי הילידים ג 'ל אלקטרופורזה ניתחנו את הכריכה של Xenopus Bicaudal-C (Bicc1) חלבון ל RNA שכותרתו fluorescently המכיל אתר מחייב Bicc1. חלבונים Bicc1 לתפקד כמו mRNA ספציפיים מדכאים translational לשלוט בתאי הגורל החלטות במהלך השלבים האימהיים של התפתחות בעלי חיים 9 , 10 , 11 , 12 כמו גם את הפונקציות של איברים ספציפיים למבוגרים 13 , 14 . העבודה שלנו ב Xenopus זיהה את האתר מחייב הראשון עבור חלבון Bicc1 8 : אזור 32 נוקליאוטידים מן 3'UTR של mRNA Crypto-1 8 , 12 . אתר זה מחייב הוגדר באמצעות שילוב של טכניקות: RNase להגןיון מבחני footprinting, בניסויים מחייב vivo וב מבחני מבחנה EMSA 8 .
מטוהרים Xenopus Bicc1 חלבון היה מעורב עם fluorescently שכותרתו 32 RNA נוקליאוטידים; האתר Bicc1 מחייב מ mRNA Crypto-1 8 . בתגובה נפרדת Bicc1 חלבון היה מעורב עם fluorescently שכותרתו 32 RNA נוקליאוטיד נגזר 3'UTR של mRNA b1 cyclin. Bicc1 לא לכבול את cyclin B1 mRNA 8 , 12 ו RNA זה משמש שליטה שלילית. מחצית התגובה כל נותח על ג 'ל polyacrylamide אנכי יליד ( איור 1 א ) בעוד החלק השני נותח במקביל במקביל ג'ל הילידים אופקית ( איור 1 ב ). זה נראה בקלות באמצעות אחת מהשיטות Bicc1 נקשר RNA Cripto-1 RNA ויצר מורכבת מסויים aNd זה לא לכבול את cyclin B1 שליטה שלילי RNA. עם זאת, Bicc1-Cripto-1 קומפלקסים הם מובהקים יותר כאשר ניתח עם ג'ל אופקית, הן להקל על איתור שלהם ומאפשר את ההפליה של מתחמי RNA חלבון מ רנ"א מאוגד. לאחר ההדמיה, הג'ל הושם בחזרה לתוך מכשיר ג'ל electrophoresed במשך שלוש וחצי שעות נוספות. לאחר הדמיה מחדש את הג 'ל מתחמי היה היגר עוד יותר היו עדיין לזיהוי בקלות, המציין את היציבות שלהם ( איור 1C ). יכולת זו להמשיך אלקטרופורזה וניתוח לאחר ההדמיה הראשונית יהיה מאתגר, אם לא בלתי אפשרי, עם פורמט ג'ל אנכי.
איור 1: השוואה של ג 'ל הילידים אנכי אופקי לניתוח הכריכה של Bicc1 כדי Cripto1 RNA. דוּניסויים מחייב cc1 נערכו עם 32 נוקליאוטידים CyclinB1 RNA שליטה שלילית או ניאון 32-nucleotide Cripto1 RNA שליטה חיובית. כל תגובה הכילה 0 nm או 250 ננומטר של SUMO-Bicc1 N- מסוף ונותחו על ( א ) אנכי polyacrylamide ג 'ל הילידים לרוץ במשך 30 דקות ב 120 V ב 4 ° C או כמו דגימות כפולות ג'ל הילידים אופקי polyacrylamide עבור ( ב ) 2 שעות ב 120 V ב 4 ° C או ( C ) 5.5 שעות ב 120 V ב 4 ° C. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ג 'ל polyacrylamide הילידים הם כלי רב ערך לחקר אינטראקציות חלבון- RNA ו באופן מסורתי ג'לים אלה electrophoresed אנכית 2 , 3 . השתמשנו שינוי של פרוטוקול מחליף ג 'ל polyacrylamide יליד נוצר electrophoresed אופקית 1 , 4 , 6 , 7 , 15 . שינויים אלה משמשים בשילוב עם מצעים RNA fluorescently שכותרתו לספק יתרונות רבים לניתוח ביוכימי של אינטראקציות חלבון- RNA מחייב. יתרונות אלה כוללים את הפעולות הבאות: ערבוב מאגרים מופשטים בהשוואה למנגנון אנכי המחייב משאבה להעברת חיץ מהתא התחתון לגלים העליונים, האופקיים, ניתן ליצור עם בארות גדולות המספקות יכולת מוגברת לניתוחדוגמאות ג 'נרל אלקטריק, אלקטרופורזה על ג' לים אופקי לעתים קרובות לספק רזולוציה משופרת של מתחמי RNA חלבונים לעומת ג'לים אנכיים, אופקית אלקטרופורזה ג'ל מספק את היכולת ניסויים התמונה במספר נקודות זמן במהלך הניתוח.
יתרון גדול נוסף הוא כי פורמט אופקי משאיל את עצמו ליצירת ג'לים עם מספר גדול של בארות המספק את היכולת לנתח דגימות מרובות במקביל 1 . תכונה זו מרחיבה באופן משמעותי את השימוש שלהם ככלי ביוכימי לניתוח אינטראקציות רנ"א חלבונים. לדוגמא, היכולת לנתח דגימות מרובות מקלה חוקרים את הפרמטרים הכמותיים של היווצרות קומפלקס החלבון-RNA באמצעות ניסויי תחרות 15, k off ניתוח 15 וכן ניסויים שנועדו להגדיר את והרכב של הרכיבים המורכבים המחייבים 15. בנוסף, השימוש שלמצעים RNA ניאון מאפשר לבצע ניתוחים מרובים, כגון מבחני קיטוב פלואורסצנטי מחייב תגובה אחת ולקבל נתונים כמותיים ואיכותיים מחייב 5 , 15 .
כדי להשיג תוצאות אופטימליות מן ההתקנה ג 'ל אופקי, ישנם מגוון רחב של פרמטרים שניתן להתאים כדי לשפר את האיכות של מתחמי הדמיה. אלה כוללים שינוי אחוז acrylamide של ג 'ל על מנת להקל על הטיפול ולשפר את ההפרדה של מתחמי RNA חלבון מ RNA חינם יותר. עם זאת, זה יכול להיות קשה להתמודד עם אחוז נמוך acrylamide ג 'ל בשל גודל. אנו מוצאים את זה הכי קל להשתמש ג 'לים כי יש ריכוז acrylamide של 7.5% או יותר. כמו כן, אם יש צורך התנאים אלקטרופורזה ניתן לשנות כדי לשפר את היציבות של מתחמי RNA חלבונים; התאמת מתח האלקטרופורזה, הפעלת הג'ל בטמפרטורת החדרמודעה של 4 ° C והתאמת התנאים מראש לרוץ.
למרות היתרונות הרבים יש גם כמה מגבלות של מבחני אלקטרופורזה ג 'ל אופקי הילידים. לדוגמה, השירות שלה הוא מוגדל באמצעות מצעים ניאון RNA. בהתאם fluorophore שנבחרו וגודל RNA, קבלת מצעים כאלה יכולים להיות יקרים. בנוסף, ג 'לים אופקי הם בדרך כלל הרבה יותר מאשר ג'לים אנכיים ולכן דורשים כמויות גדולות יותר של חומר כגון polyacrylamide ו DEPC שטופלו פתרונות.
אופקי הילידים ג'ל אלקטרופורזה יש פוטנציאל לשמש ככלי אימות עבור מסכים מולקולריים המבקשים לזהות תרכובות כי היעד הרלוונטיים קלינית רנ"א חלבונים אינטראקציות 16 . מסכים כאלה בדרך כלל משתמשים בבדיקות ביוכימיות לפתרון תרכובות רלוונטיות לצורך מחקר נוסף. פוטנציאל התפוקה הגבוהה יותר של הפורמט האופקי בהשוואה לפורמט האנכידז הזדמנות להחיל יליד ג'ל אלקטרופורזה ככלי אימות משני של מועמדים פוטנציאליים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים לורה Vanderploeg להכנת דמויות. עבודה במעבדה Sheets נתמך על ידי מענק NSF 1050395 ומענק NIH (R21HD076828). עבודה במעבדה ריידר נתמכת על ידי מענקים NIH R01GM117237 ו R01GM117008. מייגן Dowdle נתמכת על ידי מלגת GRS SciMed הזדמנות מתקדמת באמצעות אוניברסיטת ויסקונסין-מדיסון בוגר בית הספר ותוכנית ביוטכנולוגיה הדרכה באמצעות המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית של המכונים הלאומיים לבריאות (T32GM008349).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Horizontal Gel Box | OWL | N/A | Product no longer made. Similar gel boxes can be found at Thermo Scientific, A-series gel boxes. Catalog Number: A2-BP |
| 24-well large large horizontal gel electrophoresis combs | OWL | N/A | Product no longer made. Similar gel boxes can be found at Thermo Scientific, A-series gel box combs. Catalog Number: A2-24C |
| Powerpac 300 | Bio-Rad | 1655050 | |
| Mini-Protean II Electrophoresis Cell | Bio-Rad | 165-2940 | |
| InstaPAGE-19 40% 19:1 Acrylamide/Bis | IBI | IB70015 | |
| TEMED | IBI | IB70120 | |
| APS | IBI | IB70080 | |
| Yeast tRNAs | Ambion | AM7119 | |
| Fluorescein labeled RNA | IDT | N/A | Order can be made custom to length and desired sequence |
| EDTA tetrasodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | E5391-1KG | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-500G | |
| Tris Base Ultrapure | US Biological | T8600 | |
| Boric Acid | Fisher Scientific | BP168-500 | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-1 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| DEPC | Sigma-Aldrich | 1609-47-8 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 3483 12 3 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 9048-46-8 |
References
- Ryder, S. P., Recht, M. I., Williamson, J. R. Quantitative analysis of protein-RNA interactions by gel mobility shift. Methods Mol Biol. 488, 99-115 (2008).
- Dahlberg, A. E., Dingman, C. W., Peacock, A. C. Electrophoretic characterization of bacterial polyribosomes in agarose-acrylamide composite gels. J Mol Biol. 41 (1), 139-147 (1969).
- Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nat Protoc. 2 (8), 1849-1861 (2007).
- Pagano, J. M., Farley, B. M., Essien, K. I., Ryder, S. P. RNA recognition by the embryonic cell fate determinant and germline totipotency factor MEX-3. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (48), 20252-20257 (2009).
- Royer, C. A., Scarlata, S. F. Fluorescence approaches to quantifying biomolecular interactions. Meth Enzymol. 450, 79-106 (2008).
- Su, C., Wang, F., Ciolek, D., Pan, Y. C. Electrophoresis of proteins and protein-protein complexes in native polyacrylamide gels using a horizontal gel apparatus. Anal Biochem. 223, 93-98 (1994).
- Buczek, P., Horvath, M. P. Thermodynamic Characterization of Binding Oxytricha nova Single Strand Telomere DNA with the Alpha Protein N-terminal Domain. J Mol Biol. 359 (5), 1217-1234 (2006).
- Zhang, Y., Park, S., Blaser, S., Sheets, M. D. Determinants of RNA binding and translational repression by the Bicaudal-C regulatory protein. J Biol Chem. 289 (11), 7497-7504 (2014).
- Gamberi, C., Lasko, P. The Bic-C family of developmental translational regulators. Comp Funct Genomics. , 141386 (2012).
- Saffman, E. E., et al. Premature translation of oskar in oocytes lacking the RNA-binding protein bicaudal-C. Mol Cell Biol. 18 (8), 4855-4862 (1998).
- Chicoine, J., et al. Bicaudal-C recruits CCR4-NOT deadenylase to target mRNAs and regulates oogenesis, cytoskeletal organization, and its own expression. Dev Cell. 13 (5), 691-704 (2007).
- Zhang, Y., et al. Bicaudal-C spatially controls translation of vertebrate maternal mRNAs. RNA. 19 (11), 1575-1582 (2013).
- Maisonneuve, C., et al. Bicaudal C, a novel regulator of Dvl signaling abutting RNA-processing bodies, controls cilia orientation and leftward flow. Development. 136 (17), 3019-3030 (2009).
- Tran, U., et al. The RNA-binding protein bicaudal C regulates polycystin 2 in the kidney by antagonizing miR-17 activity. Development. 137 (7), 1107-1116 (2010).
- Pagano, J. M., Clingman, C. C., Ryder, S. P. Quantitative approaches to monitor protein-nucleic acid interactions using fluorescent probes. RNA. 17 (1), 14-20 (2011).
- Foley, T. L., et al. Platform to Enable the Pharmacological Profiling of Small Molecules in Gel-Based Electrophoretic Mobility Shift Assays. J Biomol Screen. 21 (10), 1125-1131 (2016).
