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Methodenartikel

Sagittalebene kinematische Ganganalyse bei C57BL/6 Mäusen unterworfen MOG35-55 induzierte experimentelle Autoimmune Enzephalomyelitis

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DOI:

10.3791/56032

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4. November 2017

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* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Kinematische Ganganalyse in der Sagittalebene liefert präzise Informationen über wie Bewegung ausgeführt wird. Wir beschreiben die Anwendung dieser Techniken, Gang Defizite für Mäuse ausgesetzt Autoimmun-vermittelter Demyelinisierung zu identifizieren. Diese Methoden können auch verwendet werden, Gang Defizite für andere Maus-Modellen mit eingeschränkter Fortbewegung zu charakterisieren.

Zusammenfassung

Kinematische Ganganalyse in der Sagittalebene wurde häufig verwendet, um motorische Defizite bei Multipler Sklerose (MS) zu charakterisieren. Wir beschreiben die Anwendung dieser Techniken, Gang Defizite in einem Mausmodell der MS, bekannt als experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) zu identifizieren. Lähmung und Motor Defizite bei Mäusen EAE ausgesetzt sind in der Regel anhand einer klinischen Bewertungen Skala. Dieser Größenordnung führt jedoch nur ordinale Daten wenig Informationen über die genaue Art der motorischen Defizite. EAE Krankheitschwierigkeit wurde auch durch Rotarod Leistung bewertet stellt ein Maß für die allgemeine motorische Koordination. Im Gegensatz dazu erzeugt kinematische Ganganalyse der hinteren Extremität in der Sagittalebene höchst präzise Informationen darüber, wie die Bewegung beeinträchtigt ist. Um dieses Verfahren ausführen zu können, sind reflektierende Markierungen auf Hind Gliedmaßen, Beweglichkeit der Gelenke zu erkennen, während eine Maus auf einem Laufband Fuß gelegt. Bewegungsanalyse Software wird verwendet, um die Bewegung der Marker während des Gehens zu messen. Kinematische Gangartparameter werden dann aus den daraus resultierenden Daten abgeleitet. Wir zeigen, wie diese Gangartparameter verwendet werden können, beeinträchtigte Bewegungen der Hüfte, Knie und Knöchel Gelenke in EAE zu quantifizieren. Diese Techniken können verwendet werden, zum besseren Verständnis der Krankheitsmechanismen und identifizieren mögliche Behandlungen für MS und anderen neurodegenerativen Erkrankungen, die Mobilität zu beeinträchtigen.

Einleitung

Gang ist eine Reihe von sich wiederholenden Bewegungen der Gliedmaßen zur Fortbewegung zu erreichen. Gang besteht aus Schritt Zyklen, die in zwei Phasen unterteilt werden: die Standphase, was ist, wenn der Fuß auf dem Boden nach hinten bewegt, um treiben den Körper nach vorne; und die Schwungphase, wo der Fuß aus den Boden und bewegen nach vorne ist. Störungen des Gehens sind die typischen Merkmale der vielen neurodegenerativen Erkrankungen, wie z. B. Verletzungen des Rückenmarks (SCI), Multiple Sklerose (MS), Amyotrophe Lateralsklerose (ALS), Parkinson-Krankheit (PD) und Schlaganfall; präklinischen Nager-Modelle dieser Störungen rekapitulieren oft ihre jeweiligen Gangart Beeinträchtigungen1. Die grundlegende Kontrollmechanismen der Fortbewegung bei Mäusen wurden intensiv studiert2,3. Darüber hinaus gibt es Maus-Modellen von vielen menschlichen neurologische Störungen4. Ganganalyse bei Mäusen ist daher ein attraktiver Ansatz, mehrere Aspekte der motorischen Defizite zu messen, die anatomische Korrelate bekannt haben. Die Studie des Gehens in Mausmodellen kann Einblicke in die neuropathologische Grundlagen der motorischen Defizite bei neurodegenerativen Erkrankungen und ermöglicht die Identifizierung von möglichen Behandlungen.

Einige Techniken, die zur Messung der Gangart bei Nagetieren gehören Sichtprüfung (z.B., Basso Maus Maßstab5 und Freiland Test6) und Analyse der Gang von der ventralen Flugzeug-7. Methoden zur Sagittalebene Kinematik der Megalosauridae Bewegungen Messen haben vor kurzem Popularität gewonnen, weil sie mehr über die Ausführung der Bewegung Informationen und sind daher empfindlicher auf subtile Veränderungen in Gang8, 9 , 10 , 11. kinematische Techniken entwickelt, um die Megalosauridae Bewegung in der Sagittalebene studieren beim gehen auf einem Laufband-9,-12 wurden im Rahmen des SCI, ALS, kortikale traumatische Verletzungen, Schlaganfall, ausgiebig untersucht und Chorea Huntington8,9,10,11,13,14,15,16. Im Gegensatz dazu haben diese Techniken eingeschränkte Nutzung in der Studie der motorischen Defizite für Maus-Modellen von Multipler Sklerose17gesehen.

Experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) ist die am häufigsten verwendeten Mausmodell der MS18. Die zwei wichtigsten Methoden des Verursachens EAE erfolgt über aktive oder passive Impfung. In aktive EAE sind Mäuse mit Myelin Antigene, verursachen autoreaktiven T-Zell-vermittelten Neuroinflammation und Demyelinisierung im Rückenmark und Kleinhirn immunisiert. Passive EAE, wird auf der anderen Seite durch Übertragung von autoreaktiven T-Zellen von einer Maus mit aktive EAE auf einen naiven Maus19induziert. Wie an anderer Stelle beschrieben, den Krankheitsverlauf und Neuropathologie sind beeinflusst durch das zentrale Nervensystem (ZNS) Antigen und Maus belasten20,21,22,23,24 ,25. Bei der EAE Experimente sind Kontrollmäusen komplette Freund des Adjuvans (CFA) ohne das Myelin-Antigen gespritzt. EAE zeichnet sich durch aufsteigende Lähmungen, die beginnt mit Schweif Schwäche und kann potentiell die Vorderbeine mit Ataxie und Lähmung20führt. Wir haben vor kurzem Gang Änderungen bei C57Bl/6 Mäusen unterworfen Myelin Oligodendrozyt Glykoprotein 35-55 (MOG35-55) gekennzeichnet-induzierte EAE. Diese Studien haben gezeigt, dass Ganganalyse als klassische Verhaltensanalyse überlegen sein, denn Abweichungen vom normalen Knöchel Bewegung mit dem Grad der weißen Substanz-Verlust in der Lendenwirbelsäule Rückenmark von EAE Mäusen26stark korreliert sind. Im Gegensatz dazu war die Stärke der Korrelation zwischen weißen Substanz-Verlust und zwei andere traditionelle Verhaltensmaßnahmen (klinische scoring und Rotarod) viel schwächeren26.

Wir beschreiben hier die Verwendung von kinematischen Ganganalyse, Bewegung Defizite in der Sagittalebene von EAE Mäusen gehen auf einem Laufband zu erkennen. Fünf reflektierende Markierungen wurden auf eine Megalosauridae Bewegung der Hüfte, Knie und Sprunggelenke in High-Speed-Videoaufnahmen identifizieren gesetzt. Bewegungsanalyse Software wurde verwendet, um kinematische Daten über gemeinsame Ausflüge zu extrahieren. Das Dienstprogramm dieser Techniken zu quantifizieren, Bewegung Defizite für das MOG-35-55 -Modell der EAE werden diskutiert. Diese Techniken sind auch für das Studium der Gangart Defizite in anderen Maus-Modellen von neurodegenerativen Erkrankungen.

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Protokoll

dieses Protokoll des Canadian Council on Animal Care Richtlinien entspricht und von der Dalhousie University Ausschuss an Labortieren genehmigt wurde.

1. konstruieren reflektierenden Markierungen:

  1. mit einem handgeführten Locher, die gewünschte Anzahl von kleinen Kreisen von reflektierenden Papier Stanzen. Jedes Tier benötigt 5 Marker für eine einzelne Aufnahme; zwei große und drei kleine Markierungen.
  2. Mit einer feinen Schere, einen geraden Schnitt erstreckt sich von den Rand in die Mitte des Kreises stellen.
  3. Entfernen Sie das Schutzpapier des Markers, die Klebefläche zu offenbaren. Mit feinen Pinzette, halten Sie den Marker fest und curl es in sich selbst mit dem Finger in form eines Kegels. Um eine kleine Markierung machen, kräuseln des Kegels fest. Um eine große Markierung machen, kräuseln den Kegel locker.
  4. Mit handgeführten Klebepistole, füllen Sie das Innere des kegelförmigen Markers mit Leim während die Spitze des Kegels mit einer Pinzette greifen und halten die Markierung auf einem flachen Stück Karton. Der Kleber wird verhindert, dass den Marker aus zusammenbricht und biegen bei der Aufnahme um optimale Reflexion des Lichtes zu gewährleisten. Wenn der Leim ist trocken (ca. 10 min), entfernen Sie die Markierung aus den Karton mit einem Skalpell ( Abbildung 1A).

2. Bereiten Sie das Tier für die Aufnahme

  1. Anesthetize die Maus mit Isofluran Gas (2,5 %; 2 Liter/min O 2) indem man die Maus in eine Induktion-Kammer. Sobald die Maus bewusstlos ist, legen Sie sie in einen Nase Kegel auf einem umlaufenden Warmwasserbereitung Decke positioniert. Der Zweck des Anesthetization ist, die Maus für die Platzierung von Marker zu immobilisieren; der Eingriff ist nicht schmerzhaft. Tiefe der Narkose muss daher nicht bewertet werden.
  2. Aktuelle Auge Schmiermittel für beide Augen gelten.
  3. Rasieren die gewünschte Megalosauridae mit elektrischen Haarschneider. Am Knöchel beginnen Sie und erstrecken Sie sich auf die Wirbelsäule und den unteren Rand der Rippen; sicher kein Fell bleibt wie dies Marker Haftung beeinträchtigen wird.
    Hinweis: Hier wurde die richtige Megalosauridae verzeichnet; jedoch entweder Megalosauridae verwendet werden kann.
  4. Mit einem permanent-Marker, geben den Standort der Beckenkamm und das Hüftgelenk. Der Beckenkamm ist nur unter dem unteren Rand der Rippen und leicht spürbar ist, indem Sie die Knie zusammen unter der Maus ' Körper s.
    Hinweis: Das Hüftgelenk finden Sie durch Biegen und verlängern das Bein um den Punkt der Artikulation zwischen Becken und Oberschenkelknochen zu finden.
  5. Mit feinere Pinzetten, fassen Sie das Spitze Ende eine kleine Markierung und tauchen die Basis in flinke Klebstoff Leim oder eine gleichwertige Alternative. Positionieren Sie die Markierung an der Spitze der vierten Stelle und halten Sie für 2-3 s, um den Kleber trocknen lassen. Legen Sie die anderen zwei kleinen Markierungen auf die MTP-Gelenk- und Sprunggelenk in der gleichen Weise ( Abbildung 1 b).
  6. Setzen große Markierungen auf den Beckenkamm und Hüftgelenk ( Abb. 1 b) in der gleichen Weise wie die kleinen Markierungen.
  7. Entfernen Sie die Maus aus die Bugnase und sofort übertragen auf den Aufnahmeraum mit einem Transfer-Käfig. Platzieren Sie den Mauszeiger auf dem stationären Laufband und lassen für die vollständige Wiederherstellung aus der Narkose.

3. Gang der Aufnahme

  1. vor der Aufnahme der Maus ' s Gang, nehmen Sie ein Bild von einem Kalibrierblock mit bekannten Dimensionen auf dem Laufband.
    Hinweis: Dies ermöglicht die Pixel in dem Video in reale Messungen konvertiert werden. Die Kamera sollte ca. 120 cm vom Laufband platziert werden.
    1. Position der Kamera in der gleichen Höhe und Ebene als das Laufband. Die Position der gleichen Kamera für die Aufnahmen nach der Kalibrierung Bild zu erhalten.
  2. Sobald die Maus aus der Narkose vollständig erholt hat, schalten Sie das Laufband auf eine niedrige Drehzahl (5 cm/s), die Maus zu Fuß beginnen zu lassen. Sicherzustellen, dass die Laufband Gürtel Richtung ist so, dass die Markierungen auf der Maus in Richtung der Kamera stehen.
  3. Erhöhen das Laufband Geschwindigkeit schrittweise bis zu 20 cm/s; das ist die ideale Geschwindigkeit für eine konsequente Gangart bei den meisten gesunden Mäusen.
    Hinweis: Obwohl es ideal, um alle Mäuse, die mit der gleichen Geschwindigkeit zu Fuß ist, möglicherweise einige nicht in der Lage, konsequent diese Geschwindigkeit zu erreichen.
    1. , Wenn die Maus nicht mehr laufen können bei 20 cm/s, reduzieren Sie die Geschwindigkeit nach Bedarf und achten Sie darauf, dies zu notieren. Reduzieren Sie die Geschwindigkeit des Laufbandes bis konsequenter Schritt Zyklen erreicht sind.
      Hinweis: Später Datenanalyse kann für unterschiedliche Geschwindigkeiten anpassen.
  4. Beginnen die Videoaufnahme, sobald die Maus stetig geht (d.h., zu Fuß in einem konsistenten Tempo, nicht Aufzucht oder Weben seitlich). Weiter aufzeichnen bis 8 bis 12 aufeinander folgenden Schritt Zyklen aufgezeichnet wurden. Für jedes Video aufzeichnen die Geschwindigkeit des Laufbandes und der Seite der Maus aufgenommen.
  5. Sobald die Aufnahme abgeschlossen ist, ist schalten Sie das Laufband und die Maus in ihren Käfig zurück. Reinigen Sie das Laufband gründlich zwischen Aufnahmen, wie Düfte von anderen Mäusen zurückgelassen wurde das Verhalten von eingehenden Mäusen verändern können. Um Stress abzubauen und Hautschäden, entfernen Sie die Markierungen nicht; ermöglichen die Mäuse, sie auf eigene Faust zu entfernen.

4. Analyse

  1. Bearbeiten der Videos mit Bewegungsanalyse Software.
    Hinweis: In unseren Experimenten verwendet wir benutzerdefinierte Skripts für Bildgebung und statistische Software entwickelt (siehe Tabelle der Materialien), die von Dr. Nicolas Stifani geschrieben wurden. Die folgenden Schritte werden mit der ausgewählten Bewegungsanalyse Software durchgeführt.
    1. Die Pixelkoordinaten der Marker aus Videos extrahieren, und die Kalibrierung Video, verwandeln die Pixelwerte in Zentimeter und Berechnung der Gelenkwinkel bei jedem Frame.
    2. Identifizieren, die Anfang und Ende eines jeden Schritt, damit Informationen über Schritt Dauer und Länge zu erhalten.
    3. Normalisieren den Schritt Zyklusdauer zu 200 normalisierte Frames, so dass Schwung- und Standphase 100 Frames bzw. vertreten sind.
  2. Mit den normalisierten Frames kinematischen Parameter für die Datenanalyse mit Tabellenkalkulations-Software zu berechnen (siehe Tabelle der Materialien).
    1. , Den durchschnittliche Winkel eines bestimmten Gelenks zu etablieren, nehmen den Mittelwert aus allen Winkeln in einem normierten Rahmen als:
      figure-protocol-1
      Hinweis: X steht hier für den Winkelwert am eine normalisierte gegeben Rahmen und n steht für die normalisierte Rahmennummer.
    2. Herstellen der Bewegungsumfang eines bestimmten Gelenks für eine gegebene Maus subtrahieren den kleinsten Winkel aus den größten Winkel in einen Satz von normalisierten Frames wie folgt:
      Beweglichkeit = Winkel maximale - Winkel mindestens.
      Hinweis: Hier maximale Winkel und Winkel mindestens sind die größten und kleinsten Winkel erreicht innerhalb des Zyklus normalisiert Schritt bzw..
    3. RMS Unterschied zu etablieren, zuerst subtrahieren den durchschnittliche Winkel jedes experimentelle Zeit-Punkt aus der Baseline-Aufzeichnung. Als nächstes quadratisch jeden Unterschied, den Mittelwert aller quadrierten Werte und Quadratwurzel der Mittelwert zu nehmen. Die Gleichung lautet wie folgt:
      figure-protocol-2
      Hinweis: hier figure-protocol-3 stellt den durchschnittlichen Winkel von der Grundlinie aufzeichnen; y steht für den durchschnittlichen Winkel von jedem experimentellen Zeit-Punkt; n und steht für die Anzahl der normalisierten Frames. Root bedeutet quadrierte Differenz (RMS) ist ein Maß zur Beurteilung der Abweichung im Gangbild von Ausgangsmessungen aufgezeichnet haben.
  3. Wissenschaftliche Grafik und Statistik-Software zu verwenden, zu analysieren und präsentieren der Daten (siehe Tabelle der Materialien).

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Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt eine schematische Darstellung des Verfahrens für kinematische Ganganalyse verwendet. Erste, reflektierende Markierungen gemacht und auf eine Maus an 5 anatomischen Punkten platziert. Gang wird dann aufgezeichnet, während die Maus auf einem Laufband Fuß ist. Bewegungsanalyse Software wird verwendet, um kinematische Daten für spätere Analysen zu extrahieren.

Abbildung 2A -C repräsentieren die Schritt-Z...

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Diskussion

Bei Mäusen mit EAE die zwei am häufigsten verwendeten Methoden zur Messung der motorischen Defizite sind klinische Bewertung und Latenz von einer Rotarod27,28fallen. Diese Techniken haben einige Einschränkungen. Obwohl praktisch und weit verbreitet, beschränkt klinische Bewertung durch nachgeben nur ordinale Daten, was bedeutet, dass das Ausmaß der Unterschiede zwischen klinischen Resultate sind nicht bekannt. Klinische Bewertung leidet auch nicht in der Lage, ge...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie nichts preisgeben.

Danksagungen

Wir würden gerne Sid Chedrawe für seine technische Unterstützung bei Dreharbeiten zu bestätigen. Diese Arbeit wurde unterstützt durch die Finanzierung von der MS Society of Canada (EGID 2983).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
KameraNikonNikon D750Wird zum Filmen des Videos verwendet
Reflektierendes BandB& L EngineeringMKR-Tape-2
Feine SchereFine Science Tools15023-10
PinzetteFine Science Tools11252-20
KlebepistoleCraftsmartE231647
Skalpellgriff #4RobozR5-9884
Skalpellklinge Nr.10Feder2020-12
C57BL/6 MäuseCharles River Laboratories
AnästhesiegerätEZ AnesthesiaEZ-AF9000 Auto Flow System
Umwälzwasser-HeizdeckeAndroitHTP-1500
topisches AugenschmiermittelRefreshDIN00210889
ShaverOster78997-010
HochgeschwindigkeitskameraFastecFastec IL3-100
HochleistungsleuchteSmith Victor CorporationModell 700 SG (600 Watt Quarzleuchte, 120 Volt)
LichtstativPromasterLS1
LaufbandSonderanfertigung am Zoologischen Institut, Universität zu Köln
Microsoft Excel 2016MicrosoftVersion 2016
KinemaJNicolas StifaniDies ist ein Skript, das für die Verwendung mit ImageJ
KinemaRNicolas Stifanierstellt wurde Dies ist ein Skript, das für die Verwendung mit Rstudio
Vicon MotusVicon MotusVersion 9.00
erstellt wurde GraphPad PrismGraphPadVersion 6.00

Referenzen

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