Profiling Anti-Neu5Gc IgG in menschlichen Seren mit einem Sialoglycan-Microarray-Assay

Zusammenfassung

Ein Sialoglycan-Mikroarray-Assay kann verwendet werden, um Anti-Neu5Gc-Antikörper in menschlichen Seren zu bewerten, was es zu einem potentiellen Hochdurchsatz-Diagnosetest für Krebs und andere chronisch entzündungsvermittelte menschliche Krankheiten macht.

Zusammenfassung

Die Zellen werden mit einem Mantel von Kohlenhydrat-Ketten (Glykane) bedeckt, der gewöhnlich bei Krebs verändert wird und der Variationen in der Sialinsäure (Sia) -Expression beinhaltet. Dies sind saure Zucker, die ein 9-Kohlenstoff-Grundgerüst haben und diese Kappe Wirbeltiere Glykane auf Zelloberflächen. Zwei der wichtigsten Sia-Formen bei Säugetieren sind N- Acetylneuraminsäure (Neu5Ac) und ihre hydroxylierte Form, N- Glykolylneuraminsäure (Neu5Gc). Menschen können keine endogenen Neu5Gc aufgrund der Inaktivierung des Gens, das für Cytidin 5'monophosphat-Neu5Ac (CMP-Neu5Ac) Hydroxylase (CMAH) kodiert, produzieren. Ausländische Neu5Gc wird von menschlichen Zellen durch den diätetischen Verzehr von rotem Fleisch und Molkerei erworben und erscheint anschließend auf diversen Glykanen auf der Zelloberfläche, die sich hauptsächlich auf Karzinomen ansammeln. Folglich haben die Menschen zirkulierende Anti-Neu5Gc-Antikörper, die vielfältige Rollen bei Krebs und anderen chronischen Entzündungs-vermittelten Erkrankungen spielen und potenzielle diagnostische und therapeutische Medikamente werdenRgets Hier beschreiben wir einen Hochdurchsatz-Sialoglycan-Microarray-Assay, um solche Anti-Neu5Gc-Antikörper in den menschlichen Seren zu beurteilen. Neu5Gc-haltige Glykane und deren abgestimmte Kontrollpaare (Neu5Ac-haltige Glykane) mit jeweils einem primären Amin-Amin sind kovalent an epoxidbeschichtete Glasscheiben gebunden. Wir veranschaulichen das Drucken von 56 Folien im 16-Well-Format mit einem speziellen Nano-Drucker, der bis zu 896 Arrays pro Druck erzeugen kann. Jede Folie kann verwendet werden, um 16 verschiedene menschliche Serenproben für die Bewertung von Anti-Neu5Gc-Antikörperspezifität, Intensität und Diversität zu screenen. Das Protokoll beschreibt die Komplexität dieses robusten Tools und bietet eine grundlegende Leitlinie für diejenigen, die die Reaktion auf Neu5Gc diätetische Kohlenhydrat-Antigen in verschiedenen klinischen Proben in einem Array-Format zu untersuchen.

Einleitung

Sias sind saure Zucker, die Glykinketten auf Zelloberflächen-Glykoproteinen und Glykolipiden bei Wirbeltieren abdecken. Sia-Expression wird in Krebszellen ¹ modifiziert und korreliert mit Progression und / oder Metastase ^{2 , 3} . Zwei der großen Sia-Formen bei Säugetieren sind Neu5Ac und seine hydroxylierte Form, Neu5Gc ² . Menschen können Neu5Gc aufgrund einer spezifischen Inaktivierung des für das CMAH-Enzym kodierenden Gens nicht synthetisieren. Diese nicht-menschliche Sia enthält metabolisch in menschliche Zellen als "Selbst", die aus diätetischen Neu5Gc-reichen Nahrungsmitteln ( zB rotem Fleisch) ^{4 , 5 stammen} . Neu5Gc ist bei niedrigen Niveaus auf den Zelloberflächen von menschlichen Epithelien und Endothelien vorhanden, aber es sammelt sich besonders bei Karzinomen an. Neu5Gc wird vom humanen humoralen Immunsystem ^{2 , 6} als fremd anerkannt.Die antigene Komplexität von Neu5Gc-Glykane können auf mehreren Ebenen entstehen, einschließlich Neu5Gc Modifikation, Verknüpfung, zugrunde liegenden Glykane und Gerüste, und ihre Dichte, alle reflektiert durch die Komplexität der anti-Neu5Gc Antikörperantwort beim Menschen ^6. Einige dieser Antikörper dienen als Karzinom-Biomarker und potenzielle Immuntherapeutika ⁷ . Das Aufkommen der chemoenzymatischen Synthese verschiedener Sialoglycane ⁸ ebnete den Weg für eine eingehendere Analyse solcher Antikörper, erleichtert durch den Einsatz der Glycan-Microarray-Technologie ^{9 , 10} . So sind mit der erleichterten Vorbereitung und Manipulation von großen Bibliotheken von natürlichen und synthetischen Kohlenhydraten Glycan-Mikroarrays zu einer leistungsfähigen Hochdurchsatz-Technologie geworden, um die Wechselwirkungen von Kohlenhydraten mit einer Vielzahl von Biomolekülen ^{10 , 11 , 12 , 13} In einem Array-Format werden minimale Mengen an Materialien verwendet, und diese multivalente Anzeige von biologisch relevanten Glykanen ermöglicht die Untersuchung von Tausenden von Bindungsinteraktionen in einem einzigen Experiment. Wichtig ist, dass diese Technologie auch auf die Biomarker-Entdeckung und die Überwachung von Immunantworten in verschiedenen Proben angewendet werden kann ^{7 , 12} .

Die erfolgreiche Glycan-Microarray-Herstellung erfordert die Berücksichtigung von drei wichtigen Aspekten: der Roboter-Typ, die Glycan-Konjugationschemie und die Detektionsoptik. Für die Druckinstrumentenbetrachtung stehen zwei Techniken zur Verfügung: Kontakt- und berührungslose Drucker. Im Kontaktdruck werden 1-48 Stahlstifte in eine Multi-Well-Quellplatte mit Glycan-Lösung getaucht und auf funktionalisierten Glasrutschen durch direktes Kontaktieren der Glas-Gleitfläche entdeckt. Die Lösungsmenge deAn die Folie geleitet wird, ist eine Funktion der anhaltenden Dauer auf der Gleitfläche. Normalerweise werden die Proben zuerst auf einem Glasblock vorgespannt (um homogene Flecken zu erreichen), bevor sie auf die Gleitfläche gedruckt werden. Bei berührungslosen Druckern ( z. B. dem piezoelektrischen Drucker) werden die Glykane aus einer Glaskapillare mit kontrollierten elektrischen Signalen bedruckt. Das elektrische Signal kann fein kalibriert werden, um ein präziseres Drucken im Verhältnis zum Kontaktdruck zu erreichen. Die Größe und Morphologie der Flecken sind auch relativ homogener. Ein zusätzlicher Vorteil ist das Recycling der Probe nach dem Druck auf die Quellplatte. Trotzdem ist der Hauptnachteil von piezoelektrischen Druckern die Druckspitzenbegrenzung (4 oder 8), was zu einer sehr langen Druckdauer führt, die besondere Aufmerksamkeit auf Gleitstabilität, Temperatur, Feuchtigkeit und Probenverdampfung erfordert. Der berührungslose Tintenstrahldrucker benötigt größere Probenvolumina ¹⁴ .

Im Gegensatz zu den begrenzten verfügbaren Optionen für Druckmethoden ist die Glycan-Konjugationschemie eine komplexere Betrachtung, mit vielen Möglichkeiten zur Auswahl. Ausgewählte Immobilisierungschemie muss sowohl die aktiven Gruppen auf den Glykanen als auch die Schieberoberflächenreaktivität berücksichtigen. Die Glycane, die auf einer bestimmten Mikroarray-Oberfläche immobilisiert werden sollen, entweder synthetisch synthetisiert oder natürlich isoliert, benötigen alle eine identische reaktive Gruppe. Darüber hinaus müssen die Glykane rein und homogen sein. Auf der anderen Seite sollte die Immobilisierungsoberfläche und die Chemie Reproduzierbarkeit und zuverlässige Befestigungsdichte bieten. Mehrere Immobilisierungsmethoden wurden mit entweder kovalenten oder nicht-kovalenten (physikalischen Absorptions-) Bindungen ^{10 , 11 , 12 , 13 entwickelt} . Für detaillierte Informationen über gedruckte Glycan-Microarray-Technologie für die UninitiativeD Ermittler, beziehen sich auf diese ausgezeichneten Bewertungen ^{13 , 15} . Wichtig ist, dass die jüngsten Mindestinformationen für eine Glycomics Experiment (MIRAGE) Initiative Leitlinien für die Probenvorbereitung ¹⁶ und für die Meldung von Daten aus Glycan-Microarray-Analysen ¹⁷ zur Verbesserung der Standards in diesem wachsenden Bereich beschrieben werden.

Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für die Herstellung von Sialoglycan-Mikroarrays mit einem speziellen Kontakt-Nano-Drucker im 16-Well-Format. Jeder der Glycane hat ein primäres Amin, das ihre kovalente Verbindung zu epoxyaktivierten Glasrutschen vermittelt. Wir beschreiben auch die Entwicklung und Analyse einer Folie mit verschiedenen menschlichen Serenproben, Antikörpern und Sia-bindenden Pflanzenlektinen. Sialoglycan Microarray-Assays beinhalten mehrere wichtige Schritte, die Array-Herstellung, Verarbeitung, Entwicklung und Analyse beinhalten. Array-Fertigung erfordert die Planung der arRay-Layout, Vorbereitung der Glykane und Quellplatte, Programmierung der Nano-Drucker, und das Drucken der Folien. Anschließend werden die Folien verarbeitet, entwickelt und analysiert ( Abbildung 1 ).

Protokoll

Menschliche Serenproben wurden von der israelischen Blutbank bezogen und wurden in Übereinstimmung mit der Erklärung von Helsinki und dem Tel Aviv University Institutional Review Board verwendet.

1. Array Fertigung Planung und Layout

1. Bestimmen Sie das Folienlayout.
   HINWEIS: Jede Folie enthält 16 Sub-Arrays, die in 16 identische Blöcke unterteilt sind, die mit B1 bis B16 numeriert sind ( Abbildung 1B , Ergänzende Abbildung 1A ).
2. Bestimmen Sie die Pin-Layout. Verwenden Sie vier Stifte, die jeweils vier Sub-Arrays (Blöcke) pro Folie drucken:
   Pin 1 druckt die Blöcke 1, 2, 9 und 10;
   Pin 2 druckt die Blöcke 3, 4, 11 und 12;
   Pin 3 druckt die Blöcke 5, 6, 13 und 14; und
   Pin 4 druckt die Blöcke 7, 8, 15 und 16 ( Ergänzende Abbildung 1A ).
3. Bestimmen Sie den Block- und 384-Well-Plattenlayout.
   HINWEIS: Die Reihenfolge, in der die Glykane in jedem Block erscheinen, erfordert eine sorgfältige Planung. In diesem Beispiel arrAy, drucken Sie jede Probe bei vier Replikaten, entwerfen Sie fluoreszierende Markerflecken, um sich an der unteren rechten Ecke zu befinden (um die Spotanalyse zu erleichtern) und drucken Sie die Standard-Kurve-IgG (STD) -Punkte mit sechs steigenden Konzentrationen ( Ergänzende Abbildung 1B ).
   1. Für jede gedruckte Stelle zuerst das Material in vier Wells (eine für jeden Pin) in einer 384-Well-Platte geben.
      HINWEIS: Die Reihenfolge der Materialien in der 384-Well-Platte beruht auf dem gestalteten Blocklayout ( Ergänzende Abbildung 1B-C ).

2. Vorbereitung der Glykane und der Quellplatte

1. Glycan-Druckpuffer (50 ml 300 mM Phosphatpuffer, pH 8,4) vorbereiten. 58,5 mg Mononatriumphosphatmonohydrat (NaH ₂ PO ₄ · 1H ₂ O) und 3,9 g Dinatriumphosphatheptahydrat (Na ₂ HPO ₄ · 7H ₂ O) in 40 ml entionisiertem Wasser (DIW) wiegen. Mit 4 M NaOH auf pH 8,4 titrieren. Stellen Sie die Lautstärke auf 50 mL anD durch eine 0,2 μm Membran zur Sterilisation filtrieren
2. Markerpuffer (50 ml 187 mM Phosphatpuffer, pH 5) zubereiten. 289 mg Mononatriumphosphatmonohydrat (NaH ₂ PO ₄ · 1H ₂ O) und 1,94 g Dinatriumphosphatheptahydrat (Na ₂ HPO ₄ · 7H ₂ O) in 40 mL DIW wiegen. Mit 1 M HCl auf pH 5 titrieren. Stellen Sie das Volumen auf 50 ml ein und filtrieren Sie durch eine 0,2 μm Membran zur Sterilisation.
3. Vorbereitung des STD-Kurvenpuffers (50 ml PBS-Glycerin: phosphatgepufferte Kochsalzlösung, pH 7,4, ergänzt mit 10% Glycerin aus einem 100% igen Glycerinbestand) und filtrieren sie durch eine 0,2 μm Membran zur Sterilisation.
4. Bereiten Sie jede Glycan-Stammlösung bei 10 mM in DIW vor. Überprüfen Sie die sialylierten Glycan-Konzentrationen durch Fluoreszenz-Detektion bei Umkehrphasen-Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie-Analyse ¹⁸ .
5. Verdünnen Sie jedes Glycan auf 100 & mgr; M in einem Gesamtvolumen von 100 & mgr; l Glycan-DruckpufferIn Mikrozentrifugenröhrchen.
6. Bereiten Sie primäre Amin mit fluoreszierenden Farbstoff vor. Solarilisieren Sie Alexa 555-Hydrazid auf 1 mg / ml mit Markerpuffer und verdünnen Sie dann auf 1 μg / ml in einem 1 mL Gesamtvolumen.
   HINWEIS: Jeder andere primäre aminhaltige Farbstoff kann mit einer geeigneten Wellenlänge nach dem Dia-Scanner verwendet werden.
   HINWEIS: Markerpunkte erleichtern die Rasterausrichtung in jedem Block während der Analyse.
7. Bereiten menschliche IgG-STD-Kurvenverdünnungen vor: Herstellung von 0,5 ml einer Stammlösung von humanem IgG bei 160 ng / μl im STD-Kurvenpuffer. Seriell verdünnen den Bestand 1: 1 sechsmal, um 80, 40, 20, 10, 5 und 2,5 ng / μl zu erhalten, alle in STD-Kurvenpuffer bei einem Gesamtvolumen von jeweils 200 & mgr; l
   HINWEIS: Andere Ig-Isotypen können verwendet werden, wenn sie für das Experiment geeignet sind ( zB humanes IgA, IgM, IgE oder ein Ig eines anderen Organismus).
8. Legen Sie die 384-Well-Platte auf Eis. Mit einer elektronischen Multipipette, Aliquot 7 μL von jedem Glycan, Marker und STD-Kurve IgG-vier replizierenS von jedem - entsprechend dem Plattenlayout ( Ergänzende Abbildung 1C ). Für eine bessere Genauigkeit laden Sie 35 μl jeder Probe und aliquotieren 7 μl in jede der vier Vertiefungen der Probe. Legen Sie die restlichen 7 μl jedes Glycan zurück in ihre ursprüngliche Röhre.
9. Die Platte mit Parafilm bedecken und 2 min bei 250 g und 12 ° C abspinnen. Legen Sie die Platte auf Raumtemperatur (RT), vor Licht geschützt. Die Platte nicht aufdecken, bevor die Feuchtigkeit im Raum 60-70% erreicht.

3. Programmierung des Nano-Druckers

1. Öffnen Sie die Software "Microarray Manager". Verwenden Sie das Fenster "Methodeneigenschaften".
2. Richten Sie das Arbeitstabellenlayout ein: Wählen Sie die "56 Folienkonfiguration".
   HINWEIS: Dies ist eine vordefinierte Konfiguration, die das Drucken von 56 Folien ermöglicht. Kalibrieren Sie für jede Art von Platten-, Stift- und Druckformat ( Ergänzende Abbildung 2 , Schritt 1).
3. Wählen Sie "Pin-Konfiguration"| "Pin Werkzeug 1x4 9 mm."
   HINWEIS: Dies ist eine vordefinierte Konfiguration für die Verwendung von vier Pins ( Ergänzende Abbildung 2 , Schritt 2).
4. Definiere den "Pin-Typ". Berechnen und erstellen Sie den Pin-Typ, der für den Druck geeignet ist.
   HINWEIS: Dieser Schritt legt fest, wieviele Flecken ein Pin drucken würde, bevor er in die Probe 384-well eintaucht und für die verschiedenen Pin-Typen und die Gleitflächenchemie optimiert werden sollte.
   HINWEIS: Bei Verwendung von 946MP3 Pins beachten Sie zwei wichtige Probleme: 1) jeder Pin kann bis zu 140 homogene Flecken drucken und 2) Vorspotting ist wichtig, um überschüssige Flüssigkeit von der Spitze des Pins vor dem Drucken auf die Folien abzulassen. Deshalb programmiere jeder Pin, um 20 Pre-Spots auf einem Pre-Printing-Block zu drucken (optimiert für 946MP3 Pins auf Epoxy-beschichteten Folien).
   1. Berechnen Sie die Gesamtzahl der gedruckten Punkte pro Probe.
      HINWEIS: Hier gibt jeder Pin 4 Spots pro Sub-Array (Block) aus. Insgesamt 4 Sub-Arrays pro Folie = 16 Spots / SlIde Nach 7 Rutschen druckt jeder Pin 16 x 7 = 112 Spots. Darüber hinaus gibt es 20 Pre-Spots vor dem Drucken 132 Spots / Dip. Daher wird der Pin-Typ als "946MP3-132 Spots" (4 Spots pro Probe pro Block x 4 Blöcke x 7 Folien + 20 Pre-Spots = 132) definiert.
   2. Erstellen Sie den "Pin-Typ" ( Ergänzende Abbildung 2 , Schritt 3). Drücken Sie "Setup" (linke Seite der Software) "Micro Spotting Pins" "Neuer Name" (946MP3-132 Spots). Definieren Sie die Anzahl der Punkte pro Dip (132), den Spotdurchmesser (100 μm), die Aufnahme (0,25 μL), die Auslieferung (0,7 nL) und den minimalen Spotabstand (100 μm). Drücken Sie "OK" "OK."
   3. Wählen Sie im Fenster "Methodeneigenschaften" den angelegten Pin-Typ aus: "946MP3-132 Spots".
5. Definieren Sie die Waschbedingungen. Setzen Sie das "Waschen vor dem Start" und "Nach dem Finish waschen" auf "Normalwäsche" ( Ergänzung Abbildung 2 , Schritt 4).
6. Definiere die "Plattenliste".
   HINWEIS: Dies ist das Stichprobenmuster von der Platte (die Reihenfolge der Dips von der 384-Well Platte) nach dem Plattenlayout. Um die Platte in die Plattenliste hochzuladen, richten Sie ein Mustermuster ein.
   1. Erstellen Sie die Platte "Sampling Pattern". Gehen Sie zu "Vorlagen" ( Ergänzende Abbildung 3 ) "Stichprobenmuster". Geben Sie einen neuen Namen ( zB JoVE-Array) und wählen Sie "Einfügen" "Füllen Sie die Oberseite" "Pin Werkzeug 1 x4 9 mm." Wählen Sie die Reihenfolge der Brunnenaufnahmen nach dem vordefinierten Plattenlayout ( Ergänzende Abbildung 1A ). Drücken Sie "OK" "OK."
   2. Legen Sie das Probenmuster ein. Klicken Sie auf die rechte Seite der Zelle "Plate list" ( Ergänzende Abbildung 3 ) "Platte hinzufügen" und wähle das richtige Mustermuster (das in Schritt 3.6.1 beschriebene "JoVE-Array"). Wählen Sie "Normal Wash". Drücken Sie"OK" | "OK."
7. Gehen Sie zu den "Sample Plates" und ändern Sie die Position Offset auf 1 (die bestimmt, wo die Platte befindet sich auf dem Arrayer Deck).
   HINWEIS: Die Offsetposition von 0 liegt näher am Sonicatorbad.
8. Definiere das "Microarray Print Design". Berechnen Sie die Block-to-Block-Abstände und den Abstand.
   1. Betrachten Sie die Abmessungen des Entwicklungswerkzeugs, das den Schieber in 16 Vertiefungen von 7 x 7 mm, mit 2-mm-Zwischenräumen zwischen Sub-Arrays (insgesamt 9 mm zwischen den Blöcken, Ergänzung Abbildung 4 ).
   2. Betrachten Sie die Sub-Array-Dimensionen.
      HINWEIS: Der Abstand zwischen den Flecken beträgt 0,275 mm und es gibt 12 Spalten und 18 Reihen in diesem Druckdesign; Die Gesamtabmessungen sind: Breite (11 x 0,275 mm = 3,025 mm) und Höhe (17 x 0,275 mm = 4,675 mm). Berechnen Sie den horizontalen Abstand: 9 mm - (11 0.275) = 5,97 mm. Berechnen Sie den vertikalen Abstand: 9 mm - (17 x 0,275) = 4,325 mm. Berechnen dVon der linken Seite des Schiebers: 4.43 mm + 1.07 mm = 5.5 mm. Berechnen Sie den Abstand von der Oberseite des Objektträgers: 2,95 mm + 0,55 mm = 3,5 mm ( Ergänzende Abbildung 4 ).
   3. Definiere die "Print Designs" ( Ergänzende Abbildung 5 ). Wählen Sie "Vorlagen" "Druckdesign" "Neu."
      1. Wählen Sie "Pin Setup" "Stiftwerkzeug 1 x 4 9 mm" "Pin - 946MP3-132 Spots." Ändern Sie auf der Registerkarte "Allgemein" den "Name des Microarray-Drucks" ( dh "JoVE-Array"). Wählen Sie "Spot Speed" "Replikatnummer" (4) | "Berührungspunkt Höhe" (0 mm) | "Soft Touch Height" (3 mm) "Druck auf alle verfügbaren Positionen" ( Ergänzende Abbildung 5A ).
      2. Wählen Sie auf der Registerkarte "Microarray" den horizontalen und vertikalen Abstand (5,9 mm und 4,325 mm ab Schritt 3.8.2) und die Anzahl der horizontalen und vertikalen Mikroarrays (2). Wählen Sie "Drucken"Microarray horizontal "|" Duplizieren Microarray "( Ergänzende Abbildung 5B ).
      3. Wählen Sie auf der Registerkarte Sub-Array die maximale Anzahl von Spalten (12), die maximale Anzahl von Zeilen (18) und den Abstand zwischen den Spalten und Zeilen (275 μm) ( Ergänzende Abbildung 5C ).
      4. Wählen Sie auf der Registerkarte Messungen den Abstand von der linken Seite des Schiebers (5,5 mm), den Abstand von der Oberseite des Schiebers (3,5 mm, berechnet in Schritt 3.8.2), die Breite des Druckschiebers (25 mm) , Und die Höhe des Druckschiebers (75 mm) ( Ergänzende Abbildung 5D ). Drücken Sie "OK" "OK."
9. Klicken Sie auf die rechte Seite der "Microarray Print Designs" Zelle und wählen Sie das definierte Design (das "JoVE Array" aus Schritt 3.8.3, Ergänzende Abbildung 6 ).
10. Definiere die "Slide Count" (56) und ändere den "Position Offset" (0). Das bestimmt die poDie erste Folie, die auf dem Arrayer-Deck gedruckt werden soll ( Ergänzende Abbildung 6 ).
11. Definieren Sie das "Microarray Pre-Print Design" ( Ergänzende Abbildung 6 ). Wählen Sie "Glass Block" "Vor-Druck 1 x 4 mm Pin-Werkzeug."
    HINWEIS: Diese Spot-Abstands-Einstellung erlaubt 46.464 Vorspots (für alle 4 Pins) auf dem Glasblock, also 46.464 / 4 = 11.616 Vorspots pro Pin. Wenn der Platz auf dem Pre-Print-Block aufgebraucht war, wird der Drucker anhalten und der Block muss umgedreht werden.
    HINWEIS: Um zu berechnen, wie viele Samples der Pre-Print-Block voll ist, sollten Sie folgendes beachten: Jede Probe wird mit 8 Pin-Dips in der 384-Well-Platte aufgenommen, um 56 Slides (7 Slides pro Dip) und jedes Dip zu vervollständigen Hat weitere 20 Pre-Spots, so dass insgesamt 160 Pre-Spots pro Probe. Daher 11,616 / 160 = 72,6 Proben. So müsste der Vor-Druck-Glasblock nach 72 Proben umgedreht werden (um die Zeit zum Spiegeln zu bewerten, m zu messenOw lang dauert es für eine Probe, um einen vollen Lauf auf 56 Folien abzuschließen und dann mit 72 zu multiplizieren).
12. Wählen Sie "PrePrint Design verwenden" "Ja" "Scan-Barcodes" (Nein) "Einzelne Replikate drucken" (Nr.) ( Ergänzende Abbildung 6 ).
13. Klicken Sie auf "Validieren" ( Ergänzende Abbildung 6 ).
14. Klicken Sie auf "Speichern" und speichern Sie die Methode als arr-Datei ( zB "JoVE array.arr", Ergänzende Abbildung 6 ).

4. Gestaltete Arrays drucken

HINWEIS: Alle Schritte sollten in einem sauberen Raum mit einer Feuchtigkeit von 60-70% und mit geeigneten Handschuhen und Kleidung zum Schutz durchgeführt werden

1. Schalten Sie den Nano-Drucker und den Luftbefeuchter ein.
2. Für den Waschpuffer und die Befeuchtung mit DI-Wasser füllen. Entleeren Sie die Waschflasche (Abfluss) und Befeuchtungsfalle Carboy ( Ergänzende Abbildung 7A ).
3. Stellen Sie den Luftbefeuchter auf70% Feuchtigkeit und Befeuchtung beginnen.
4. Reinigen Sie alle Stifte vor dem Drucken. Vorbereiten von 50 ml heißer (65 ° C) Pin-Tip-Reinigungslösung (15 g Pin-Tip-Reinigungsreagenz und 50 ml 65 ° C Wasser, sorgfältig gemischt, bis sich das feste Reagenz vollständig auflöst).
   1. Tragen Sie die Reinigungslösung auf jede Pin-Spitze auf, indem Sie die Pin-Spitze-Bürste (fein) in die Pin-Spitze-Reinigungslösung eintauchen und die Oberfläche jeder Pin-Spitze bürsten.
      HINWEIS: Pin-Spitze Reinigungslösung ist korrosiv und giftig. Achten Sie darauf, bei der Verwendung dieser Lösung jederzeit Handschuhe und Schutzbrille zu tragen. Einweichenstifte in Pin-Tip-Reinigungslösung für mehr als ein paar Minuten können zu dauerhaften Pin-Schäden führen.
   2. Füllen Sie das Ultraschallbad mit 1 l destilliertem Wasser und legen Sie die Stifte in einen schwimmfähigen Pin-Rack im Bad. Sonate für 5 min und entfernen Sie die Stifte. Trocknen lassen und vorsichtig mit Reinraum-Spezialtüchern abwischen.
5. Öffnen Sie den "Microarray Manager"Er software; Bei Anschluss wird das Druckerlicht eingeschaltet (rot / grün). Drücken Sie "Stop" "Löschen" "Init" ( Ergänzende Abbildung 7B , Schritte 1-3); Der Druckkopfarm setzt dann die X-, Y-, Z-Ausrichtungen zurück.
6. Um die Stifte in den Druckkopf zu laden, drücken Sie "Load" ( Ergänzende Abbildung 7B , Schritt 4) und platzieren Sie die Stifte in den Druckkopf entsprechend der definierten Konfiguration des Druck / Pin-Werkzeug-Layouts ( Ergänzende Abbildung 7C ); Dieses Layout verwendet 4 Stifte, wobei jeweils 4 Sub-Arrays auf jeder Folie gedruckt werden, um insgesamt 16 Sub-Arrays pro Folie zu erhalten ( Ergänzende Abbildung 1A ). Nach dem Einsetzen der Pins drücken Sie erneut "Init".
7. Montieren Sie die Folien auf dem Arrayer Deck. Öffnen Sie die Schiebebox und reinigen Sie jede Folie, indem Sie ultra-hochreinen Stickstoffgas aufblasen. Legen Sie die gewünschte Anzahl von Folien auf die Array-Plattform. Halten Sie die Rutschen mit zwei Fingern an den unteren Ecken und legen Sie die Rutsche in ihrePosition. Halten Sie die beiden rechten Ecken und schieben Sie die linken Ecken vorsichtig, bis der Schieber fest in seine Position passt. Schieben Sie sanft in die linke untere Ecke, um einen festen Sitz zu gewährleisten ( Ergänzende Abbildung 7D ).
8. Reinigen Sie das Vorblockglas mit destilliertem Wasser, 70% Ethanol und 100% Ethanol und lassen Sie es an der Luft trocknen (verwenden Sie nur spezielle Reinraumtücher). Legen Sie das Vorblockglas in seine Position auf dem Deck.
9. Füllen Sie ein Sonicator-Bad ( Ergänzende Abbildung 7B ). Drücken Sie auf "Fill" für 55 s und drücken Sie dann "OK". Den Sonicator abtropfen lassen, indem du für 20 s auf "Drain" gehst und dann "OK" drücke. Wiederholen Sie die Füllung und entleeren Sie noch einmal und füllen Sie dann wieder für 55 s.
10. Füllen Sie das Waschbad ( Ergänzende Abbildung 7B ): Drücken Sie "Prime" für 40 s und drücken Sie dann "OK".
11. Positionieren Sie die 384-Well-Platte mit aliquotischen Proben in ihre Position auf dem Arrayer-Deck und entfernen Sie die Parafilm-Abdeckung.
12. Druck starten.
13. Wenn der Druckvorgang abgeschlossen ist, entleeren Sie das Sonicator-Bad ( Ergänzende Abbildung 7B ) und schalten Sie den Luftbefeuchter aus.
14. Lassen Sie die Objektträger auf dem Arrayer Deck für 16-24 Stunden ohne Befeuchtung trocknen.
15. Nummerieren Sie die Folien mit einem alkohol- / lösemittelbeständigen Markierungsstift und bewahren Sie sie im Dunkeln in einer vakuumdichten Box auf.

5. Verarbeitung und Entwicklung der Arrays

1. Nehmen Sie einen Schlitten aus dem vakuum-versiegelten Kasten und legen Sie ihn in eine chemische Haube für 5 min, Array nach oben, um die überschüssige Flüssigkeit zu verdampfen.
2. Scannen Sie die Folie mit der höchsten Verstärkung (950 PMT), um sicherzustellen, dass alle Flecken gedruckt wurden.
3. Gehen Sie mit der chemischen Blockierung von Epoxygruppen auf der Folie vor
   1. 50 ml Ethanolamin-Blockierungslösung (0,1 M Tris-HCl, pH 8 und 0,05 M Ethanolamin) zubereiten. Mischen Sie 140 ml DIW mit 8,8 ml Tris-HCl (1,7 M, pH 8) und 0,45 ml Ethanolamin (16,6 M). Transfer zu einem 50-ml-Färberohr ( Ergänzende Abbildung 8A ) und warm auf 50 ° C.
   2. Hydrat die Rutsche. Legen Sie die Folie in ein mit DIW gefülltes Färberohr, bedecken Sie es mit Folie und inkubieren Sie für 5 min mit langsamem und sanftem Schütteln bei RT.
   3. Blockiere die reaktiven Epoxygruppen auf der Folie. Tauchen Sie den Schlitten in das 50-ml-Färberohr, das mit vorgewärmter Ethanolamin-Blockierlösung gefüllt ist, mit Folie abdecken und 30 min lang unter langsamen und schonenden Schütteln bei RT inkubieren.
   4. Die Ethanolamin-Sperrlösung in den entsprechenden Biohazard-Müllbehälter verwerfen und den Rutschen in ein neues, sauberes Färberohr geben, das mit 50 ° C DIW gefüllt ist. Mit Folie abdecken und 10 min mit langsamen und schonenden Schütteln bei RT inkubieren.
   5. Das Wasser verwerfen und die Objektträger auf einen Glasfärbehalter übertragen ( Ergänzende Abbildung 8B ). Legen Sie den Glasfärbehalter in einen schwenkbaren Plattenhalter und zentrifugieren Sie den Objektträger für 5 min bei 200 xg und RT.
4. Richten Sie einen Teiler ein und fahren Sie mit der biologischen Blockierung fort.
   1. Legen Sie die Folie auf einen 16-Well-Teiler ( Ergänzende Abbildung 8C ).
   2. Vorbereitung der PBST-Waschlösung: 50 ml phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), pH 7,4 + 0,1% Tween-20.
   3. Biologische Blockierungslösung (PBS-OVA) vorbereiten: 5 ml PBS, pH 7,4 + 1% Hühnchen-Ovalbumin (10 mg / ml).
      HINWEIS: Die Wahl des Blockierungsreagenzes ist entscheidend für den Erfolg des Nachweises von Anti-Neu5Gc-Antikörpern. Ovalbumin wird in Hühnern hergestellt, die wie die Menschen nicht neu5Gc synthetisieren können, was einen Mangel an Ausdruck dieses Sia verursacht. Für den Nachweis von Neu5Gc können auch kleinere Verunreinigungen die Empfindlichkeit des Assays drastisch reduzieren und manchmal sogar keine Anti-Neu5Gc-Reaktivität nachweisen. Beispielsweise enthält das am häufigsten verwendete Blockierungsreagenz Rinderserumalbumin (BSA), obwohl es nicht selbst glykosyliert ist, Rinder-IgG-Verunreinigungen, die Neu5Gc-Reste tragen und daher konkurrierenIth gedruckte Glykane bei der Bindung an die Probe mit Anti-Neu5Gc-Antikörpern ^{19 , 20} .
   4. Prewet die Brunnen. Mit einer Multi-Pipette, 200 μl PBST in die Slide-Wells austauschen, in eine überdachte Feuchtkammer geben und 5 min schütteln.
      ANMERKUNG: Die Feuchtigkeitskammer ist eine Glasschale mit einem nassen Tuchpapier, bedeckt mit Nylonverpackung und Folie, um die Proben vor Licht zu schützen.
   5. Entfernen Sie das PBST, indem Sie es vorsichtig auf ein sauberes Papiertuch klopfen und darauf austauschen und 200 μl PBS-OVA-Blockierpuffer in jede Vertiefung geben. In eine feuchte Kammer geben und 1 h bei RT unter leichtem Schütteln inkubieren.
5. Vorbereitung der Primärdetektion, verdünnt in PBS-OVA-Blockierungspuffer, wie in Tabelle 2 aufgeführt .
   HINWEIS: Für die Qualitätskontrolle (QC) Bewertung dieses sialoglycancanarraray verwenden Sie mehrere Sia-bindende Proteine: Sambucus nigra lectin (SNA), isoliert aus Holunderrinde, wird erwartet, dass Sia &# 945; 26; Maackia Amurensis Lectin II (MALII) wird erwartet, Siaα23 zu erkennen; Und Huhn Anti-Neu5Gc IgY erwartet alle Neu5Gc-haltigen Sialoglykanen. Darüber hinaus verwenden Sie verschiedene humane sera Proben, um Anti-Neu5Gc IgG-Antwort zu profilieren. Die Konzentration von Lektinen / Antikörpern / Seren sollte experimentell kalibriert werden.
6. Flock-trockener PBS-OVA-Blockierungspuffer und füge 200 μl Primärantikörper pro Vertiefung hinzu (minimales Volumen pro Vertiefung: 70 μl), inkubieren in einer feuchten Kammer für 2 h.
7. Flick trockne die Primärerkennung und wasche 4 Mal mit PBST (zwischen dem ^3. und ^4. Waschen, Inkubieren der Objektträger in PBST für 5 min in der feuchten Kammer). Einmal mit PBS waschen.
8. Bereiten Sie den sekundären Antikörper in PBS vor, wie in Tabelle 2 aufgeführt .
9. Flick trocken das PBS und füge 200 μl Sekundärantikörper hinzu. Inkubieren für 1 h bei RT unter Schütteln.
10. Flick trocknen Sie den sekundären Antikörper und waschen Sie sich viermal mit PBST (zwischen den 3RD und ^4. Waschen der Objektträger in PBST für 5 min in der feuchten Kammer) inkubiert.
11. Entfernen Sie den Rahmen vorsichtig und legen Sie die Objektträger in ein mit PBS gefülltes 50 ml-Gleitgefäßrohr und schütteln Sie es für 5 min.
12. Füllen Sie zwei Gleitfärbebäder ( Ergänzende Abbildung 8D ) mit DIW, legen Sie den Schlitten in den Gleithalter und tauchen Sie ihn in das Bad. Schnell 10 mal eintauchen und dann auf das zweite Bad übertragen und noch 10 mal tauchen. 10 min bei RT unter Schütteln inkubieren.
13. Verwerfen Sie das Wasser und übergeben Sie den Schieber auf einen Glasfärbehalter ( Ergänzende Abbildung 8B , lassen Sie den Schlitten an der Luft trocknen). Legen Sie den Glasfärbehalter in einen schwenkbaren Plattenhalter und zentrifugieren Sie den Objektträger für 5 min bei 200 g und RT.
14. Scannen Sie die Folie und bewahren Sie sie dann in einer vakuumdichten Box im Dunkeln auf.

6. Array Scanning und Datenanalyse

1. Öffnen Sie den Leuchtstoff-Scanner und lassen Sie ihn 5 min warm werden. Öffne dasScannen und Analysieren von Software.
2. Setzen Sie die Scan-Parameter ( Ergänzende Abbildung 9A ): Scan bei 532 nm und 100% Leistung mit einer Verstärkung von 350 PMT, mit einer Linie bis durchschnittlich und einer 0-μm-Fokusposition. Verwenden Sie eine Pixelgröße von 10,0 μm.
   HINWEIS: Die Scan-Parameter können auf unterschiedliche Folientypen, Fluoreszenz und Auflösung eingestellt werden.
3. Scannen Sie die entwickelte Folie. Öffnen Sie die Scannertür und legen Sie die Rutsche nach innen, Array nach unten. Starten Sie das Scannen (grüne Taste "Play" im Menü der Software-Navigationstafel, Ergänzende Abbildung 9B ).
4. Speichern Sie die gescannten Folien als TIFF-Datei.
5. Vorbereitung der Folie für die Analyse. Wählen Sie "Load Array-Liste" und laden Sie die entsprechende GAL-Datei, die die Arrays in jedem Block auf der Folie ( ergänzende Abbildung 9C ).
   HINWEIS: Die GAL-Datei enthält Informationen über die Identität und den Standort (X, Y) jedes Flecks auf der Folie. Diese Datei kann erstellt werdenDurch die Druckersoftware, die eine tabulatorgetrennte Textdatei exportiert, die auf Probenidentitäten in der 384-Well-Quellplatte und dem definierten Druckdesign basiert.
6. Setzen Sie die Ausrichtungs- und Analyseparameter. Drücken Sie die Taste "Option" im Menü der Software-Navigationstafel ( Ergänzende Abbildung 10 ).
7. Definieren Sie die Ausrichtungsparameter. Finden Sie kreisförmige Merkmale, verkleinern Sie die Funktionen während der Ausrichtung um 50 - 350%, begrenzen Sie die Spielweise auf eine maximale Übersetzung von 40 μm, unflag-Funktionen, die den Hintergrundschwellenwert überschreiten (CPI-Schwelle 0), schätzen Sie die Umhüllung und die Rotation bei der Suche nach Blöcken und automatisieren Sie die Bildregistrierung (10 Pixel) ( Ergänzende Abbildung 10 ).
8. Definieren Sie die Analyseparameter: W1 / 532-Verhältnis, normale Standardabweichung, analysieren fehlende Merkmale und Hintergrund-Subtraktion. Klicken Sie auf "select" und dann "Local feature background median" und setzen Sie 2 Pixel auszuschließen und eine 3-Pixel-Breite des Hintergrunds. Drücke OK." SeT der Scannersättigungspegel auf Default ( Ergänzende Abbildung 10 ).
   HINWEIS: Die Hintergrund-Subtraktionsmethode hängt vom experimentellen Design ab und kann je nach Bedarf angepasst werden.
9. Richten Sie die Karten aus. Stellen Sie das Programm in den Blockmodus ein (drücken Sie auf "B"), wählen Sie alle Blöcke (Strg + A), positionieren Sie die Array-Kartengitter und richten Sie alle Blöcke aus (Alt + Shift + F7) ( Ergänzende Abbildung 11 ).
10. Verfeinern Sie die Merkmalsausrichtung in jedem Block. Zoom (Drücken Sie "Z", um in den Zoom-Modus zu gelangen) in den oberen linken Block, drücken Sie erneut "B" (Blockmodus) und drücken Sie das Raster dieses Blocks. Bewegen Sie nur das Raster dieses Blocks, bis es sich perfekt an die Blockpunkte anpasst und drücken Sie F5, um die Features in diesem ausgewählten Block auszurichten. Wiederholen Sie die Gitterbewegung und die F5-Ausrichtung, bis die Flecken perfekt umkreist sind. Muss dasselbe für jeden der 16 Blöcke, bis alle Gitter vorhanden sind.
11. Analysieren und speichern Sie die Daten. Alle Blöcke auswählen (Crtl +A) und analysiere dann die Daten (Alt + A). Speichern Sie die Analyseergebnisse (Strg + U) als .gpr-Datei.
12. Öffnen Sie die gespeicherte .gpr-Datei in einem Tabellenkalkulationsprogramm und analysieren Sie die Intensität jedes Punktes basierend auf Fluoreszenz nach lokaler Hintergrund-Subtraktion (F532-B532).

Ergebnisse

Array Drucken, Entwicklung und Analyse:

Das Drucken eines Sialoglycan-Mikroarrays mit mehreren Glycan-Proben und menschlichen IgG-STD-Kurven in 16 verschiedenen Blöcken erfordert eine sorgfältige Kalibrierung, um sicherzustellen, dass alle Proben in allen 16 Blöcken pro Folie und allen Folien im gleichen Drucklauf gleichmäßig wie möglich gedruckt werden. Daher sind mehrere Kalibrierungsexperimente erforderlich, bevor die spezifis...

Diskussion

Eine erfolgreiche Glycan-Microarray-Fertigung erfordert eine sorgfältige Planung und beinhaltet einige wichtige Schritte im Protokoll. Dazu gehören: (1) Planung der Block- und Plattenlayouts, die alle nachfolgenden Parameter definieren ( zB Distanzen, Abstand, Probenmenge und Druck); (2) Reinigung der Stifte und Sicherstellung der Pin-Integrität, die für die Kontrolle der Spot-Homogenität entscheidend ist; (3) Aufrechterhalten hoher Feuchtigkeit während des Druckens, entscheidend für die Vermeidung von Probenve...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Primäraminhaltige Sialoglykane	Glycohub, Inc., Davis, CA, USA (http://www.glycohub.com/services)	Kontaktieren Sie info@glycohubusa.com für Verbindungsanfragen	Gedruckte Glykane
Mononatriumphosphat-Monohydrat	Sigma	S9638	Druckpufferkomponente
Dinatriumphosphat-Heptahydrat	Sigma	S9390	Druckpufferkomponente
Phosphat gepufferte Kochsalzlösung	Hy-Labs	BP-507/500D	Druckpuffer / Inkubations-/Waschpuffer
Tris-Base	Sigma	T1503	Objektträgerblocker
Reagenz Glycerin	Sigma	G-7893	Druckpufferkomponente
Ethanolamin	Thermo-Fisher Scientific	0700/08	Objektträgerblocker Reagenz
Ovalbumin (Grade V)	Sigma	A5503	Objektträger-Blockierungsprotein
Tween-20	Sigma	P7949	Objektträgerwaschmittel
Alexa 555-Hydrazid	Thermo-Fisher Scientific	A20501MP	Marker auf dem Array
ChromReines humanes IgG, ganzes Molekül	Jackson Immunoresearch	009-000-003	Druckkomponente
Biotinyliert - SNA	Vector Laboratories	B-1305	Pflanzenlektin – Bindung Sia-alpha2– 6-linked
Biotinylated-MALII	Vector Laboratories	B-1265	Pflanzliches Lektin – Bindung von Sia-alpha2– 3-linked
Chicken-anti Neu5Gc IgY	BioLegend	146903	Primärnachweis
Cy3-Streptavidin	Jackson Immunoresearch	016-160-0848	Biotin-Bindung
Cy3-anti Human IgG	Jackson Immunoresearch	109-165-088	Sekundärnachweis gegen humanes IgG
Cy3-anti Chicken IgY	Jackson Immunoresearch	703-165-155	Sekundär Nachweis gegen Hühnerfleisch IgY
Humane Serenproben	Israelische Blutbank		Primärnachweis
Komprimierter Stickstoff (Klasse 5)			Allgemeines Staub-/Trocknungswerkzeug
Epoxidbeschichtete Objektträger	Corning	40044	Objektträger
Epoxidbeschichtete Objektträger	PolyAn	2D 104-00-221	Diapositive. Bei dieser Art von Objektträgern ist die Oberfläche hydrophober (im Vergleich zu Kernobjektträgern), daher müssten die Glykane Print Buffer mit 0,005% Tween-20 ergänzt werden, um 100 & Mikro zu erhalten; M große Flecken.
384-Well-Mikrotiterplatte	Genetix	2070	Druckplatte
VWR Labormarker	VWR	52877-310	Objektträgerbeschriftung
Färberöhrchen	ArrayIt	MST	Objektträgerentwicklungswerkzeug
Färbebad	VWR	25608-904	Objektträgerentwicklungswerkzeug
Objektträger Glashalter	VWR	631-9321	Objektträgerentwicklungswerkzeug
GenePix Scanner	Molekulare Bauelemente	4000B	Diascanner
LM-60 Nanoprinter	ArrayIt	LM-60 Array-Drucker
Pins	ArrayIt	946MP3	Druckpins
ProPlate Modul	Grace Bio-Labs	P37004	Dia-Entwicklungsmodul
Destilliertes Wasser	Bio-Lab	2321020500	Erforderlich für Arrayer und Luftbefeuchter
Elektronische Multi-Pippete, 8 Kanal, Lautstärkebereich 2-125 μ L	Thermo-Fisher Scientific (Matrix)	MA-2131 Impact2 Equalizer 384	Multi-Pippete für die Probenverteilung in eine 384-Well-Platte