Her beskriver vi en metode som kombinerer i situ MHC-tetramer flekker med immunohistochemistry å bestemme lokaliseringen, fenotype, og antallet av antigen-spesifikke T-celler i vev. Denne protokollen brukes til å angi romlige og fenotypiske kjennetegn av antigen-spesifikke CD8 T-celler i forhold til andre celle type og strukturer i vev.
T-celler er avgjørende for mange immunologiske prosesser, inkludert oppdage og fjerne virus-infiserte celler, forebygge autoimmunitet, bistå i B-celle og plasma-celle produksjon av antistoffer, og oppdage og eliminere kreftceller. Utviklingen av MHC-tetramer farging av antigen-spesifikke T-celler analysert av flowcytometri har revolusjonert vår evne til å studere og forstå immunobiology av T-celler. Mens det er svært nyttig for å bestemme antall og fenotypen av antigen-spesifikke T-celler, kan ikke flowcytometri bestemme den romlige lokaliseringen av antigen-spesifikke T-celler til andre celler og strukturer i vev, og gjeldende disaggregation teknikker for å ekstra T nødvendig celler for flowcytometri har begrenset effektivitet i ikke-lymfoid vev. In situ MHC-tetramer flekker (IST) er en teknikk for å visualisere T-celler som er spesifikke for antigener rundt i vev. I kombinasjon med immunohistochemistry (IHC), kan IST bestemme overflod, plasseringen og fenotypen av antigen-spesifikke CD8 og CD4 T celler i vev. Her beskriver vi en protokoll for flekken og nummerere antigen-spesifikke CD8 T celler, med bestemte fenotyper innenfor bestemte vev avdelinger. Disse prosedyrene er det samme som vi brukt i våre siste publikasjon av Li et al., med tittelen “Simian immunsviktvirus-produserende celler i hårsekkene er delvis undertrykt CD8+ celler i Vivo.” Metodene beskrevet er bredt aktuelt fordi de kan brukes til å lokalisere, fenotype, og kvantifisere i hovedsak en antigen-spesifikke CD8 T celle som MHC tetramers er tilgjengelige, i alle typer vev.
T-celler er avgjørende for mange immunologiske prosesser, inkludert oppdage og fjerne virus-infiserte celler, forebygge autoimmunitet, bistå i B-celle og plasma-celle produksjon av antistoffer, og oppdage og eliminere kreftceller. Utviklingen av peptid/MHC klasse I tetramer farging av antigen-spesifikke CD8 T celler1 og nyere utviklingen av MHC klasse II tetramer farging av CD4 T celler2 av flowcytometri revolusjonerte vår evne til å studere og forstå den immunobiology av T-celler. Mens det er svært nyttig for å bestemme antall og fenotypen av antigen-spesifikke T-celler, tillater flowcytometri ikke påvisning av den romlige lokaliseringen av antigen-spesifikke T-celler til andre celler og vev, og gjeldende Disaggregation teknikker for å trekke ut de T-cellene trengs for flowcytometri har begrenset effektivitet i ikke-lymfoid vev3.
Vi og andre har utviklet ved hjelp av peptid-lastet MHC, klasse I og klasse II tetramer eller multimer reagenser stain antigen-spesifikke CD8 og CD4 T celler i vev4,5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. disse IST metoder tillater fastsetting av plasseringen, overflod og fenotypen av antigen-spesifikke CD8 og CD4 T celler i vev og gir en måte å oppdage disse celler i forhold til andre celler og strukturer i vev. Vår gruppe har mye brukt MHC-jeg tetramer flekker for å studere humant immunsviktvirus (HIV)- og simian immunsviktvirus (SIV) – spesifikke CD8 T celler i lymfoide, genital og endetarms vev å få en forståelse av HIV og SIV immunopathogenesis og for å identifisere korrelerer vellykket vaksinasjon, strategier,14,,15,,16,,17. Dessuten, utviklet vi også en teknikk som kombinerer IST med i situ hybridisering (ISH) å lokalisere og kvantifisere virus-spesifikke CD8 T celler og virus-infiserte celler i vev og bestemme i vivo effektor til mål nivåer 18 , 19.
Her beskriver vi en protokoll som peptid-lastet MHC-jeg tetramers stain antigen-spesifikke CD8 T celler i ferskt vev deler, til counterstain vev bruker IHC og kvantifisere celler med bestemte fenotyper i bestemte vev avdelinger. Disse prosedyrene er det samme som ble brukt i våre siste publikasjon av Li et al., der vi bestemt plasseringen, overflod og fenotypen av SIV-spesifikke T celler i lymfoidvev under kronisk SIV infeksjon i aper20.
Til dette friskt vev er delt og ruges natten med peptid-lastet MHC-jeg tetramers konjugert til fluorescein thiocyanate molekyler (FITC). De er så fast i paraformaldehyde. Etter festing vevet, forsterkes signalet fra MHC-tetramers bruker kanin anti-FITC antistoffer og inkubert med fluorescently merket anti-kanin IgG antistoffer, som ytterligere forsterke signalet fra de bundne tetramers. IHC brukes i forbindelse med IST for å karakterisere antigen-spesifikke T celler og omkringliggende celler. Antistoffer som gjenkjenner epitopes på overflaten av celler eller ekstracellulær inn er inkludert i den primære inkubering med tetramers. Antistoffer som anerkjenner intracellulære epitopes krever gjennomtrengning av cellen vegg før flekker. Delene farget vev er fotografert ved hjelp av en AC confocal mikroskop og analysert ved hjelp av AC confocal programvare. Merket cellene er kvantifisert bruker AC confocal mikroskopi programvare eller ImageJ. Beskrevet protokollen kan brukes til å flekken i hovedsak en antigen-spesifikke CD8 T celle i alle typer vev for hvilke MHC-jeg tetramers er tilgjengelige.
IST kombinert med IHC gir et viktig verktøy for oppdage karakterisere og kvantifisere antigen-spesifikke CD8 T celler i innfødte miljøer med konteksten av andre celler og vev strukturer. Her beskrevet vi detaljerte fremgangsmåter for IST kombinert med IHC, etterfulgt av kvantitative bildeanalyser, for å avgjøre plasseringen, overflod og fenotypen av antigen-spesifikke CD8 T celler i lymfeknutene fra rhesus aper. Lignende flekker kan brukes på menneskelig, mus eller andre arter vev for hvilke MHC-jeg tetramers er t…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av helsevesenet tilskudd fra National Institutes of Health (T32 DA007097, R01AI096966, andUM1AI26617).
MHC-I monomer | NIH tetramer core facility | Materials for MHC-tetramer preparation | |
ExtrAvidin-FITC | Sigma-Aldrich | E2716 | Materials for MHC-tetramer preparation |
Normal goat serum | Jackson Immunoresearch | 005-000-121 | |
Low melt agarose | Promega | V3121 | |
Heparin | Sigma-Aldrich | SLBL6391V | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T-6878 | |
Urea | J.T.Baker | 4204-05 | |
Glycerol/gelatin | Sigma-Aldrich | SLBH2672V | |
n-propyl gallate | Sigma-Aldrich | P3130 | |
rat-a-h-CD8 (1:500) | Acris | 0714 | Antibody unstable, use single use frozen aliquot |
m-a-h-CD20 (1:500) | NOVOCASTRA | 6026819 | |
m-a-h-Ki67 (1:500) | Vector | 6022201 | |
goat-a-m-A488 (1:2000) | Jackson Immunoresearch | 124083 | |
goat-a-rb-Cy3 (1:5000) | Jackson Immunoresearch | 106232 | |
goat-a-rat-Cy5 (1:5000) | Jackson Immunoresearch | 118088 | |
goat-a-h-IgM-Dylight649 (1:5000) | Jackson Immunoresearch | 86579 | |
Compresstome: VF-300 Microtome | Precisionary Instruments, LLC | 1079 | |
Quick Set Instant Adhesive | Loctite | 46551 | |
24-well flat bottomed tissue culture plates | Falcon | 353226 | |
Microscope slide | Globe scienfitic Inc. | #1321 | |
Razor blade | Ted Pella, Inc | 121-6 | |
Feather Disposable Scalpel | FEATHER SAFETY RAZOR CO. LTD. | No. 21 | |
Round paintbrush #2 | PRINCETON ART & BRUSH CO. | 4350R | Can trim as needed with razor |
Confocal Microscope | Olympus | FV1000 | |
FV10-ASW_Viewer4.0 | Olympus |