Method Article

Bewertung der vaskulären Kontrollmechanismen Nutzung Videomikroskopie der isolierten Widerstand Arterien von Ratten

DOI:

10.3791/56133

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December 5th, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physical Therapy, Marquette University, 2Medical College of Wisconsin, 3Department of Physiology, Medical College of Wisconsin, 4Graduate Programs of Nurse Anesthesia, Texas Wesleyan University, 5Office of Research, Medical College of Wisconsin

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Manuskript beschreibt in Vitro Videomikroskopie Protokolle für die Bewertung der Gefäßfunktion in Ratte zerebralen Widerstand Arterien. Das Manuskript beschreibt auch Techniken für die Bewertung der kapilläre Dichte mit Gewebekulturen beschrifteten Lektine und Gewebe Perfusion mit Laser-Doppler-Flowmetry.

Abstract

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Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von in-vitro- Fernsehen Mikroskopie auszuwertende Gefäßfunktion in isolierte zerebrale Widerstand Arterien (und andere Schiffe) und beschreibt Techniken für die Bewertung der Gewebedurchblutung mit Laser Doppler Flowmetry (LDF ) und kapilläre Dichte Nutzung Eindringmittel beschriftet Griffonia Simplicifolia (GS1) Lektin. Aktuelle Methoden zur Untersuchung isoliert Widerstand Arterien an Transmural Druck begegnet in Vivo und in Ermangelung von parenchymatösen Zelle Einflüsse stellen ein wichtiges Bindeglied zwischen in-Vivo -Studien und Erkenntnissen aus molekularen reduktionistische Ansätze, die begrenzten in integrative Antworten auf die ganze Ebene Einblick. LDF und Techniken, um selektiv Arteriolen und Kapillaren mit Gewebekulturen beschriftet GS1 Lektin identifizieren bieten praktische Lösungen für Ermittler, die Erkenntnisse aus Studien der isolierten Widerstand Arterien erweitern können. Dieses Whitepaper beschreibt die Anwendung dieser Techniken, grundlegende Kenntnisse der vaskulären Physiologie und Pathologie in der Ratte als allgemeines experimentelles Modell zu gewinnen, und in einer Vielzahl von spezialisierten gentechnisch verändert "Designer" Ratte-Stämme, die bieten kann wichtige Erkenntnisse über den Einfluss bestimmter Gene auf wichtige vaskulären Phänotypen. Nutzen diese wertvolle experimentelle Ansätze in der Ratte Stämme durch selektive Zuchtstrategien und neue Technologien für die Herstellung von gen-Knockout-Modelle bei der Ratte entwickelt dehnt die strenge der wissenschaftlicher Räumlichkeiten in Knockout-Maus-Modellen entwickelt und Dieses Wissen zu mehr relevanten Tiermodell, mit einem gut verständlichen physiologischen Hintergrund und Eignung für physiologische Untersuchungen aufgrund seiner Größe zu erweitern.

Introduction

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Die frühesten Studien der Gefäßfunktion in Arterien verwendet Conduit Arterien und in vielen Fällen die Aorta. Krafterzeugung in großen Arterien wurde in der Regel untersucht, durch das Anbringen eines Ring-Segments der Arterie zu einem Kraftaufnehmer in einem Gewebe-Bad; bei der Aorta Streifen durch Schneiden spiralförmige des Schiffes, so dass der glatten Muskelfasern in Längsrichtung zwischen den Punkt der Anlage und der Kraftaufnehmer, zu den besten Schätzwert für die Kraft, die durch Kontraktion der orientiert waren die glatte Muskulatur entlang seiner Längsachse. Die Standardtechnik für das Schneiden von spiralförmigen Streifen der Hauptschlagadern war, legen Sie einen Glasstab in das Lumen des Gefäßes, machen Sie einen Schnitt in der Gefäßwand im gewünschten Winkel und halten bis zum Ende der exponierte Kante der Gefäßwand, wie der Schnitt verlängert wurde, um ein Ganzes zu produzieren spiralförmigen Streifen des Schiffes. Zu diesem Zeitpunkt die endotheliale Seite des Schiffes war in der Regel ausgelöscht, um Ablagerungen zu entfernen, vor Befestigung des Schiff-Streifens zu Kraftaufnehmers und Eintauchen der Vorbereitung in Sauerstoff und Temperatur gesteuert Gewebe Bad. Schließlich, dass Ansatz zu einem der bekanntesten und wichtigsten Entdeckungen in der Geschichte der Physiologie von Furchgott und Zawadski1, nämlich die Rolle des Endothels führte abgeleitet entspannende Faktor (EFRE), anschließend identifiziert als Stickstoffmonoxid, in Regulierung der Gefäßfunktion. Das entscheidende Ereignis zu dieser Entdeckung war eine Situation, in der die Ermittler eine intakte Endothel durch Vermeidung des Kontakts der endothelialen Seite der Arterie mit ausländischen Oberflächen beibehalten, und bemerkte, dass der Aorta Streifen nicht die erwarteten aufweisen, Kontraktion von Acetylcholin (ACh), aber stattdessen entspannt als Reaktion auf ACh. Basierend auf dieser Beobachtung, die Ermittler entwickelt eine "Sandwich"-Vorbereitung, in der sie eine Aorten-Segment mit einem intakten Endothel (aber nicht in der Lage, Kontraktionskraft zu generieren) angebracht, zu einem standard spiralförmigen Streifen der Aorta und konvertiert die ACh-induzierte Kontraktion in eine Entspannung.

Zwei bedeutende Fortschritte auf diesem Gebiet, das heute weitgehend benutzt werden sind die Entwicklung von Präparaten Messen aktiv Kontraktionskraft in kleinen Widerstand Arterien2,3 (z. B. im Darm Mesenterium3 ) und kanülierte Widerstand Arterie Vorbereitungen4,5,6. In einer der frühesten Berichte, Mulvany und Halpern3 beschriebenen Verwendung der Draht Myograph Zubereitung, aktive Kontraktionskraft in isolierten Widerstand Arterien aus dem Darm Mesenterium spontan Hypertensive Ratten (SHR) zu studieren und normotonen WKY Kontrollen. Im Anschluss an die Entwicklung des Systems der Draht Myograph waren kanülierte Widerstand Arterie Präparate entwickelt, um Studien der Schiffe näher, die in Vivo Bedingungen4,5,6zu ermöglichen.  Während beide Ansätze wertvolle Ergebnisse zu liefern, hat die kanülierte Arterie Vorbereitung die zusätzlichen Vorteile von mehr effektiv Erhaltung intrinsische aktiv Ton in den Arterien; und so die Ermittler, aktive myogen Reaktionen auf Veränderungen im Transmural Druck und Schiff Reaktionen auf Veränderungen in der Durchflussmenge und endotheliale Schubspannung zu studieren (siehe Beitrag von Halpern und Kelley6).

Ein wesentliches Ziel der vorliegenden Arbeit soll beschreiben, wie die altehrwürdige Technik der Videomikroskopie mit isolierten, kanülierte Widerstand Arterien um genaue Informationen über die Mechanismen zu gewinnen, die aktiv Ton in dieser entscheidenden Regeln beschäftigen Schiffe, unabhängig von Einflüssen der neuronalen, humorale oder parenchymatösen Zelle. Diese Basisinformationen, mit einem standard Rattenmodell und Beispiele aus unseren Studien von neu genetisch engineered Ratte Stämme, vermitteln dem Leser eine Vorstellung von den Arten der Erkenntnisse bezüglich Gefäßfunktion, die mit dem Fernsehen gewonnen werden können Mikroskopie-Ansätze und die eingesetzt werden können, in Studien mit jeder Kontrolle und experimentelle Gruppe(n) der Ermittler zu wählen, darunter mächtige neue experimentelle Ratte Modelle produziert durch gezielte Inzucht und neu entwickelte genetische Engineering-Techniken.

Dank der Präzision des Fernsehens Mikroskopie Ansätze bieten Messung von Durchmesserwechsel kanülierte Arterie Vorbereitungen sehr wertvolle Informationen über Endothel-abhängigen und Endothel-unabhängige Mechanismen der vaskulären Entspannung, als auch wichtige (und manchmal unerwartete) Veränderungen der vaskulären Kontrollmechanismen, die mit Bluthochdruck, hohe salzarme Kost und andere experimentellen Interventionen. Darüber hinaus Messung von Druck-Durchmesser Beziehungen in isoliert und kanülierte Widerstand Arterien, die durch die Behandlung mit Ca2 +maximal entspannt sind-freie Lösung oder eine pharmakologische gefäßerweiternde Medikament, ermöglicht es den Prüfer bewerten strukturelle Veränderungen in den Arterien durch vaskuläre remodeling und passive Spannungs-Dehnungs-Beziehungen-7 zu berechnen, die wichtige Erkenntnisse Änderungen in die passive mechanische Eigenschaften der Arterien bieten kann, die arterielle Funktion beeinflussen können unabhängig von (oder zusätzlich zu) ändert sich der aktive Kontrollmechanismen. Es ist auch wichtig zu beachten, dass Erkenntnisse aus Studien der isolierten Widerstand Arterien durch Informationen, die Verwendung von LDF, eine praktische Methode für die Bewertung der Gewebedurchblutung an das ganze Tier Level8,9 ergänzt werden können ,10, und durch kapilläre Dichte mit Gewebekulturen gekennzeichneten GS1 Lektin Bewertung gewonnenen Informationen, die spezifisch bindet an Glykoprotein Moieties in der Basalmembran der kleinen Arteriolen und Kapillaren11 , 12. letztere Methode ermöglicht eine sehr genaue Schätzung kapilläre Dichte, die nicht die klassische Schwierigkeiten bei der Abschätzung der kapilläre Dichte durch Schiffe in Vivo, z. B. fehlende nicht durchblutet zählen unterliegt Schiffe, wo die Durchblutung durch aktive Schließung der Arteriolen gestoppt ist. Wenn Sie zusammen verwendet, bieten diese Ansätze wichtige Erkenntnisse zum funktionelle Veränderungen in isolierten Widerstand Arterien zu Veränderungen der Gewebedurchblutung Ebene der mikrozirkulatorischen korrelieren; und einige Beispiele für die Verwendung dieser wertvolle Ansätze in Verbindung mit kanülierte Arterie Techniken erhalten Sie auch in der vorliegenden Handschrift.

Der vorliegende Beitrag konzentriert sich auf die Verwendung von Techniken der Videomikroskopie, vaskuläre Veränderungen in den Arterien von fremd-Sprague-Dawley Ratten zu bewerten. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass diese Techniken sehr wertvoll in Aufklärung phänotypische Veränderungen in hochspezialisierten gentechnisch Ratte Stämme erstellt durch selektive Züchtung oder gen Bearbeitung mit Hilfe von Techniken bewährt haben. In diesem Manuskript stellen wir Beispiele dafür, wie video Mikroskopiertechniken wichtige Informationen bezüglich Gefäßfunktion in einer Reihe von wertvollen Rat zur Verfügung gestellt haben-Modelle, darunter die Dahl Salz-Sensitive (SS) Ratte-eine Inzucht Ratte Belastung, die die am weitesten verbreitete ist experimentelles Modell verwendet untersuchen die Mechanismen von Salz sensible Hypertenson18,19,20,21,22,23; und Consomic Ratten durch selektive Züchtung von SS Ratten mit dem Salz-unempfindliche braun Norwegen (BN) Ratte Stamm erstellt. Jedes Chromosom aus Braun Norwegen Ratte wurde in der Consomic-Ratte-Panels Introgressed einzeln in den Dahl SS24,25,26 genetischen Hintergrund. Verwendung von Consomic Ratte Platten lieferte wertvolle Hinweise auf bestimmten Chromosomen, die Salz Empfindlichkeit der Blutdruck und anderen Phänotypen, darunter vaskuläre Reaktivität24,25,26 beitragen ,27,28.

Selektive Zuchtstrategien nutzen SS Ratten und Consomic Ratten tragen einzelne BN Chromosomen konnten auch die Generation der verengten Congenic Stämme mit kleinen Segmenten der einzelnen braun Norwegen Chromosomen Introgressed in die genetische Dahl-SS Hintergrund22,29. Diese können extrem wertvollen input auf bestimmte Gene oder schmale Regionen der Chromosomen, die entscheidende physiologischen Variablen, z. B. Blutdruck, Nierenschädigung und vaskuläre Reaktivität22,29beeinflussen können. Eine weitere leistungsstarke Ergänzung zu der Ratte genetische Toolbox ist die Entwicklung von Ratte gen Knockout Modelle nutzen fortschrittliche gen Bearbeitung Techniken einschließlich ZFN, transcriptional Aktivator-artigen-Effektor Nukleasen (TALENS), und zuletzt CRISPR-Cas913 ,14,15,16,17. Das Aufkommen dieser mächtigen Techniken, mit denen Gene bei der Ratte geschlagen werden können ist eine immens wichtige Entwicklung, weil gen Knockout Studien bisher verwendet haben (und weiterhin verwenden) Mäuse fast ausschließlich. Eine weitere experimentelle Komponente in der vorliegenden Arbeit zeigt die Bedeutung von kanülierte Arterie Techniken und Videomikroskopie, physiologische Kontrollmechanismen bei Knockout Ratten fehlt die master Antioxidans und Zelle schützende Transkription zu bewerten Faktor, nukleare Faktor (2 erythroiden abgeleitet) - wie - 2 (NRF2)30,31, die mit TALEN Technologie in Sprague-Dawley genetischen Hintergrund17entwickelt wurden. In-vitro- Videomikroskopie Techniken wurden in diesen Experimenten Verlust des Gens NRF2 funktionale nachzuweisen und einen potentiell wertvollen therapeutischen Ansatz basierend auf direkte Hochregulation von NRF2-vermittelten Antioxidans zu testen verwendet. Abwehrkräfte. NRF-2 ist der erhebliche therapeutische Bedeutung Bekämpfung vaskulären oxidativen Stress in den Menschen angesichts der enttäuschenden Ergebnisse der klinischen Studien mit direkten Verwaltung von Antioxidantien wie Vitamine C und E32.

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Protocol

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Das Medical College of Wisconsin institutionelle Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) genehmigt alle Protokolle, die in diesem Dokument beschriebenen und alle Verfahren sind in Übereinstimmung mit den National Institutes of Health (NIH) Büro des Labor Tier Wohlfahrt (OLAW) Vorschriften.

1. Vorbereitung der Lösungen und Schiff Kammer

  1. Bereiten Sie vor der Durchführung einer Reihe von Experimenten, 2 L 20 x konzentrierte Salzlösung Lager bestehend aus 278 g/L NaCl; 14 g/L KCl; 11,52 g/L MgSO4. 7H2O; und 9,4 g/L CaCl2. 2H2O. Bereiten Sie auch 2 L 20 x konzentrierte Ausgleichslagers bestehend aus 80,8 g/L Nahco33 und 0,4 g/L EDTA und 2 L 20 X konzentrierte sich Ca2 +-kostenlose Stammlösung bestehend aus 281,6 g/L NaCl; 14 g/L KCl und 11,52 g/L MgSO4. 7H2O.
    Hinweis: 20 X Stammlösungen können bis zum Gebrauch im Kühlschrank aufbewahrt werden.
  2. Am Tag des Experiments vorbereiten 2 L einer physiologischen Salzlösung (PSS) von 20 x konzentrierte Stammlösungen wie folgt: 1.800 mL entionisiertem Wasser in einem 2 L Erlenmeyerkolben oder Becherglas auf einer motorisierten rühren Platte 100 mL 20 x Salz Aktie hinzufügen. 100 mL 20 X Ausgleichslagers hinzufügen, während kontinuierlich Äquilibrierung der Lösung mit einem Gasgemisch mit 21 % O2, 5 % CO2, balance, N2, und rühren es mit einer magnetischen Rührstab. Fügen Sie langsam 0,28 g NaH2PO4 während der Überwachung des pH-Wertes; einstellen Sie durch Hinzufügen von Tropfen 6 N HCl oder 6,5 N NaOH-Lösung aus einer Pasteurpipette wie nötig, um pH 7.4. Nachdem die PSS vorbereitet ist und der pH-Wert wird eingestellt, Hinzufügen der PSS 1,98 g Glukose.
    Hinweis: Es ist wichtig, langsam NaH2PO4 zuletzt hinzugefügt, während der Überwachung des pH-Wert der PSS, weil die Zugabe von NaH2PO4 um eine alkalische Lösung (pH > 7.4) könnte einen Calcium-Phosphat-Niederschlag bilden, wie durch die Darstellung der eine trübe Lösung oder einen weißen Niederschlag in den Boden des Behälters.
    Hinweis: Die endgültige Zusammensetzung der PSS ist 119 mM/L NaCl; 4,7 mM/L KCl; 1,17 mM/L Mg2SO4; 1,6 mM/L CaCl2; 1,18 mM/L NaH2PO4; 24 mM/L Nahco33; 0,03 mM/L EDTA; und 5,5 mM/L Glucose. Obwohl sich die Zusammensetzung der PSS Labors unterscheiden kann, eignet sich dieses Rezept für die Aufrechterhaltung der Gefäßtonus, Endothelfunktion und Reaktionen auf vasoaktive Agenten in isolierten Widerstand Arterien.
  3. Um den maximalen Durchmesser zu bestimmen und aktive Ton in der Arterie zu bewerten, indem Sie produzieren maximale Ausdehnung des Schiffes, bereiten Sie 500 mL Ca2 +-freie PSS durch Zugabe von 25 mL 20 X Ca2 +-Salz bestand bis 450 mL entionisiertem Wasser frei , gefolgt von 25 mL 20 x Ausgleichslagers in einen Erlenmeyerkolben oder Becherglas ähnlich 1.2 oben Schritt. Fügen Sie 0,07 g NaH2PO4 während der Überwachung und Anpassung der pH-Wert der Lösung der Projektmappe hinzu. Die Ca2 +-kostenlose PSS wird hinzugefügt, um die PSS Reservoir und Schiff Kammer am Ende des Experiments zu vermeiden, zum Abbau der intrazellulärer Ca2 + Läden, die Schiff Antworten in normalen PSS beeinträchtigen könnten. Weil die Ca2 +-kostenlose Lösung wird hinzugefügt, am Ende des Experiments, maximale Entspannung der Arterien, zu produzieren, besteht keine Notwendigkeit der PSS Glukose hinzu.
    Hinweis: Wenn abgeschlossen, die endgültige Zusammensetzung des Ca2 +-kostenlose PSS ist 120,6 mM/L NaCl; 4,7 mM/L KCl; 1,17 mM/L Mg2SO4; 1,18 mM/L NaH2PO4; 24 mM/L Nahco33; 0 mM/L CaCl2; und 0,03 mM/L EDTA.
    Hinweis: Für viele Studien erfordern maximale Ausdehnung der Arterie, kann ein Calcium-Eintrag-Blocker wie Verapamil (1 µM) und/oder ein Stickoxid-Spender wie Natrium Nitroprusside (10 µM) die Lösung zusätzlich zur Entfernung von Ca2 + aus der PSS hinzugefügt werden.
  4. Pflegen Sie die PO-2, PCO2und pH von der PSS, indem kontinuierlich Äquilibrierung der PSS fließt in die Gefäß-Kammer in einem standard Orgel Bad zur Untersuchung der isolierten Aorta Ringe, Darm Glattmuskel oder anderen Geweben (Abbildung 1). Verwenden Sie synthetische Fluorpolymer Tetrafluorethylen Schlauch, um den Gas-Tank zum Orgel-Bad zu verbinden, weil diese Art von Schläuchen Gas undurchlässige, im Gegensatz zu vielen anderen Formen der Schläuche, z.B., Latex.
  5. Legen Sie eine kleine Luft Stein an das Gleichgewichtherstellung-Gas-Gemisch in der Schiff-Kammer zur Aufrechterhaltung die PSS Gaszusammensetzung angeschlossen.
    Hinweis: Schiff Reaktionen auf Veränderungen im PO2 können getestet werden, indem die Äquilibrierung der PSS in das Gefäß Kammer und luminalen Perfusat mit Gasgemischen mit verschiedenen Anteilen von O2, z.B.21 % O2, 10 % O2, 5 % O2 , und 0 % O2mit 5 % CO2 und Balance N233,34,35. Für die größeren Arterien mit dickere Wände, wo Diffusion von Sauerstoff in der Mitte der Gefäßwand eine Einschränkung sein kann, kann ein höherer Anteil an Sauerstoff, z.B., 95 % O2 verwendet werden.
  6. Verfolgen Sie die Temperatur in der Kammer Schiff aufmerksam, wie einzelne Kammern in ihre Hitze Übertragungsverhalten variieren.
    Hinweis: Viele kommerziell zubereiteten Schiff Kammern für Studien der kanülierte Widerstand Arterien verwendet nutzen eine peristaltische Pumpe liefern sauerstoffreiches PSS aus einem Gas-equilibriert Reservoir und sehr präzise Steuerung der Badtemperatur und Sauerstoffversorgung der die PSS.
  7. Legen Sie die PSS in eine große Flasche (2 L) Mariotte, mit einem Stopfen und zentrale Glasrohr, dienen als Reservoir kontinuierlich PSS in der Orgel-Bad schaffen, erwärmt und Gas-gestalten die PSS fließt in die Gefäß-Kammer (Abbildung 1A).
  8. Legen Sie die Öffnung des zentralen Glasrohrs Mariotte Flaschenpost auf dem gleichen Niveau wie die Spitze der PSS in der Orgel-Badewanne, weiterhin einen konstanten hydrostatischen Druck-Kopf für die Lieferung von PSS in der Orgel-Bad. Verwendung-Polyethylen-Schlauch verbunden zu einem J-förmigen Glas oder Kunststoff-Rohr, die PSS von Mariotte-Flasche in der Orgel-Bad zu liefern.
  9. Verwenden Sie für luminalen Perfusion (Abbildung 1A) Polyethylen-Schlauch anschließen die Zufluss Pipette ein PSS-Reservoir, bestehend aus einem 60 cc Kunststoffspritze erhöht, um eine Position, die die gewünschte Zufluss Druck (in der Regel 80 MmHg für Studien der Ratte zerebralen hält (Arterien), gemessen mit einem Druck-Wandler über einen Absperrhahn an das System angeschlossen.
  10. Verbinden Sie die Abfluss-Pipette mit Polyethylenschlauch zu PSS durch das Schiff als Reaktion auf ein Druckgefälle fließen zu lassen, und schließen Sie die Abfluss-Leitung zu einem Reservoir ähnlich dem Zufluss Reservoir. Verwenden Sie eine ähnliche Absperrhahn und Druck Wandler-Verbindung zum Abfluss Druck messen.
    Hinweis: Verfahren für die Festlegung Transmural Druck und Durchfluss durch das Schiff zu kontrollieren sind in Abschnitt 2 beschrieben.
  11. Am Ende des Experiments spülen Sie gründlich die Kammer, Förderleitungen und Reservoir Systeme mit destilliertem Wasser. In kurzen Abständen, ersetzen Sie die Schläuche und Lieferung Zeilen, sauber oder ersetzen die Hähne im System und in regelmäßigen Abständen unterziehen jedes Glas PSS Stauseen eine Säurewäsche zu verhindern das Wachstum von Bakterien und anderen Mikroorganismen, die Verunreinigungen verursachen und beeinflussen Sie Schiff-Reaktivität.

(2) kanülierte Arterie Vorbereitung

  1. Ein Sprague-Dawley Ratten mit 5 % Isofluran zu betäuben und Aufrechterhaltung der Narkose mit 1,5-2,5 % medizinischem Sauerstoff36. Alternativ zu verwalten eine intramuskuläre Injektion mit Ketamin (75,0 mg/kg), Acepromazine (2,5 mg/kg) und Xylazin (10,0 mg/kg); eine intraperitoneale Injektion von Pentobarbital (50-60 mg/kg); oder eine andere anerkannte Methode der Anästhesie, Protokolle und/oder Ermittler Vorlieben abhängig.
  2. Die Ratte Tiefe Narkose zu enthaupten und das Gehirn für Studien der zerebralen Widerstand Arterien zu entfernen.
  3. Nach der Entnahme des Gehirns, sorgfältig zu isolieren, die mittlere zerebrale Arterie (MCA) (oder anderen Arterien von Interesse, z.B., a. basilaris oder hinteren zerebralen Arterie)37,38. Isolieren der MCAs, platzieren Sie das Gehirn in einem Glas Petrischale Rückenlage gefüllt mit eiskalten PSS (Abbildung 2).
  4. Verwenden Sie Vannas Schere und einer feinen Spitze Pinzette Dumont Nr. 5 um die MCA aus dem Gehirn Verbrauchsteuern.  Reinigen Sie alle verbleibenden Gehirngewebe von der MCA mit der Pinzette und übertragen Sie die Arterie auf eine Temperatur-kontrollierten Gefäß-Kammer mit PSS wie zuvor beschrieben. 33 , 34  .
  5. Um die Arterie der Schiff-Kammer zu übertragen, halten Sie sanft dem ausgeschnittenen Behälter durch die ACA oder posterior kommunizierende Arterie Segment und legen Sie es vorsichtig in die Kammer.
    Hinweis: Neben der MCA eignet sich das kanülierte Gefässsystem für eine Vielzahl von kleinen Schiff Vorbereitungen, einschließlich der Skelettmuskulatur Widerstand Arterien33,39,40, mesenterialen Widerstand Arterien 38 , 41 , 42und große (Erstbestellung) Arteriolen des Cremaster Muskel43, sowie menschliche koronare Arteriolen und menschlichen Arteriolen subkutanem Fettgewebe entnommen, während gluteal Biopsie44,45, 46,47.
  6. Legen Sie die Arterie auf Zufluss Mikropipette ziehen sie in Richtung der Pipette-Basis, bis die Spitze in das Lumen der MCA Fortschritte. Sichern Sie die Arterie auf der Zufluss Pipette durch das Binden einer Schleife aus eine Einzelstrang-Faser, die zuvor gehänselt von 10-0 Nähte um die Arterie (Abbildung 1 b) vorbereitet. Sichern Sie das gegenüberliegende Ende des MCA, der Abfluss-Pipette durch eine zweite Naht Schleife um das Schiff (Abbildung 1 b) anziehen.
    Hinweis: Legen Sie die Naht Schleifen auf Mikropipetten vor dem Einbau des Schiffes und positionieren sie in der Nähe der letzte Punkt der Anlage, so dass sie leicht über der Arterie rutschte und schnell gesichert, wenn das Schiff in Position ist, die Minimierung des Risikos der Arterie der Pipetten abrutschen.
    Hinweis: Mikropipetten werden zubereitet aus Borosilikatglas Kapillare Schläuche (2 mm Durchmesser, 1 mm Innendurchmesser, 10 cm lang) mit einem vertikalen Mikropipette Abzieher. Vor dem Anbringen der Arterie, entsprechen Sie die Spitze Durchmesser der Mikropipetten so eng wie möglich um Fehlanpassungen des zu- und Abflusses Widerstandes in der Perfusion System zu verhindern.
  7. Nachdem die Arterie an der Mikropipetten sicher gebunden ist, verwenden Sie das Mikrometer an den Zufluss Pipette Halter verbunden, um die Arterie zur in Situ Länge zu Strecken.
  8. Binden Sie alle Seitenäste mit Einzelsträngen gehänselt von 10-0 Nähte um einen konstanten Druck in der Arterie zu erhalten.
  9. Überprüfen Sie das Fehlen von Lecks, indem sichergestellt wird, dass der Intraluminal (Transmural) Druck konstant bleibt, nach dem Zufluss Pipette vorübergehend schließen. Binden Sie keine Äste oder für Löcher in das Schiff überprüfen Sie, ob der Druck abfällt. Wiederherstellen Sie, Perfusion, nachdem Sie sich vergewissert, dass die Transmural Druck konstant bleibt.
    Hinweis: Kanülierung der isolierten Widerstand Arterien erfordert handwerkliches Geschick und Übung. Die wichtigsten Vorsichtsmaßnahmen zu beachten sind, zu vermeiden, brechen die Pipetten und um sicherzustellen, dass die Arterie der Pipetten nicht abrutschen. Es ist wichtig, sanft mit den isolierten Arterien während des gesamten Verfahrens zu sein, da Trauma des Schiffes Endothel beschädigt werden kann und/oder stören die normale Funktion der vaskulären glatten Muskulatur.
  10. Messen Sie den Innendurchmesser der Arterie mit einer Videomikroskopie Setup (Abbildung 1A) bestehend aus einer Videokamera an einen sezierenden Mikroskop befestigt und mit einem video Mikrometer und TV-Monitor (Zahlen 1 b, 1 C) verbunden. Dies ermöglicht den Betrachter, Schiffs Durchmesser manuell zu messen, indem man bewegliche Referenzlinien auf der Innenwand der Arterie und, falls gewünscht, an der Außenwand der Arterie als auch um Schiff Wandstärke messen.
    Hinweis: Einige video Mikrometer bieten automatische Verfolgung von Behälterabmessungen.
    Hinweis: Kalibrieren Sie das video Mikrometer mit einem Mikroskop Bühne Mikrometer und den Zufluss und Abfluss Druckaufnehmer mit einem Quecksilber-Manometer (0 MmHg, 50 MmHg 100 MmHg, 150 MmHg und 200 MmHg) zwischen Experimente um genaue Messungen zu versichern Durchmesser und Intraluminal Behälterdruck.
    Hinweis: Die standard-Steuerelement Transmural Ratte MCA Experimente kann 80 MmHg. Kalibrierung für höhere und niedrigere Druckstufen gewährleistet Genauigkeit für Studien der myogen Reaktionen auf Veränderungen im Transmural Druck und Passive Druck-Durchmesser-Kurven in maximal geweitete Arterien.
  11. Passen Sie die Höhe der zu- und Abfluss Stauseen, gewünschte Transmural Druck auf einem konstanten Niveau zu halten. Der Zufluss Reservoir um einen kleinen Betrag (< 5 MmHg) heben und senken von Abfluss-Reservoir um den gleichen Betrag hält den mittleren Transmural Druck und schafft Perfusion fließen in das Gefäß Lumen6.
    Hinweis: Das Zufluss-Reservoir heben und senken der Abfluss-Reservoir durch gleiche Mengen behält die gleiche mittlere Transmural Appetithemmer Druck in der Arterie, aber erzeugt einen hydrostatischen Druckgradienten, die Strömung und Schubspannung im Behälter, verursacht so dass die Ermittler, Endothel-abhängigen Reaktionen auf Veränderungen im Intraluminal Schubspannung in verschiedenen Versuchsgruppen48zu bewerten.
  12. Myogen Antworten und Schiff Reaktionen auf gefäßerweiternde Reize zu bewerten, stellen Sie sicher, dass die Arterie ein angemessenes Niveau der aktiven Ton (ca. 40 %) vor dem Experiment zeigt. Entsorgen Sie alle Arterien fehlt aktiv Ton in Ruhe mit Ausnahme von Schiffen, z.B., kleine mesenterialen Arterien, die nicht normalerweise aktiv ruhenden Ton ausstellen.
    Hinweis: Für Schiffe, die nicht normalerweise spontan Ton ausstellen, Pre verengen Sie sich die Arterien durch eine äquivalente Menge nutzt einen Vasokonstriktor Agonisten wie Noradrenalin oder Phenylephrin. Ein guter Ansatz um die Wahl der Dosis der Agonist verwendet, um die Arterie verengen sich vorab ist eine EC50 Dosis des Vasokonstriktor Agenten, z.B.Noradrenalin41,42zu nutzen. Jedoch sollte pharmakologische Vasokonstriktor Agenten nicht auf Arterien angewendet werden, die spontan aktiv Ton unter Ruhe-Bedingungen aufweisen.
  13. Endothel-abhängige Reaktivität der kanülierte Widerstand Arterie durch Messung Schiffs Durchmesser während der Zugabe von steigenden Konzentrationen von ACh zu testen (10-10 m-10-5 M) an die Gefäß-Kammer. Endothel-unabhängige Stickoxid-Empfindlichkeit von vaskulären glatten Muskelzellen durch Messung Schiffs Durchmesser während der Zugabe von steigenden Konzentrationen (10-10 m-10-5 M) von der Stickoxid-Spender Natrium Nitroprusside, Testen der Schiff-Kammer.
    Hinweis: Empfindlichkeit Vasokonstriktor Agenten und anderen gefäßerweiternden Agonisten kann in ähnlicher Weise geprüft werden, indem das Schiff Kammer steigende Konzentrationen von Agonisten hinzufügen.
    Hinweis: Neben vasoaktive Agenten können verschiedene Medikamente, Inhibitoren und andere pharmakologische Wirkstoffe in das Gewebe-Bad und/oder an der luminalen Perfusat hinzugefügt werden. Veränderungen in der PO-2 (sowie PCO2 und pH-Wert) können selektiv der endothelialen oder Extra-luminalen Seite der Arterie durch separate Gleichgewichtherstellung der luminalen Perfusat mit einem Luftstein verbunden mit einem kalibrierten Gasgemisch verabreicht werden anders als die Mischung verwendet, um die PSS Gewebe Bad33,34,49equilibrate. Myogen Reaktionen auf Veränderungen im Transmural Druck können studiert werden, schließen die Abfluss-Pipette und zu erhöhen (oder senken) die Höhe der PSS-Reservoir verbunden, der Zufluss Pipette49,50,51 , erhöhen Sie oder reduzieren Sie Intraluminal Druck.
  14. Um die Rolle des Endothels bei der Vermittlung Schiff Reaktionen auf bestimmte Reize zu testen, entfernen Sie das vaskuläre Endothel und vergleichen Sie Schiff Reaktionen auf diese Reize in das Vorhandensein oder Fehlen des Endothels zu. Um das Endothel zu entfernen, die Arterie aus der Abfluss-Pipette vorsichtig lösen und das Lumen der Arterie mit einer Luft-Bolus langsam perfundieren (0,5-1,0 mL). Wiederherstellen Sie nach Luft Perfusion PSS Durchblutung um die Zelltrümmer zu löschen, bevor das Schiff zu den Abfluss Pipette43neu zu binden.
    Hinweis: Nach dem Endothel Denudation Verfahren ist es wichtig zu überprüfen, ob das Endothel entfernt ist, durch die Prüfung vaskulärer Reaktionen auf ein Agonist (in der Regel ACh) bekannt, die Endothel-abhängige Vasodilatation in diesem Schiffstyp zu produzieren. Jedoch sind in bestimmten pathologischen Bedingungen Endothel-abhängige Vasokonstriktoren veröffentlicht, in welchem Fall ist es wichtig zu überprüfen, ob die Constrictor Antwort entfällt nach einer endothelialen Entfernung.
  15. Am Ende des Experiments bestimmen den maximalen Durchmesser der Arterie durch Zugabe von Ca2 +-PSS Perfusat und Superfusate frei. Berechnen Sie aktiv ruhenden Ton (%) als ((Dmax-DRest) / dmax) x 100, wo Dmax ist der maximale Durchmesser im Beisein von Ca2 +-kostenlose Lösung und DRest ist der ruhende Kontrolle Durchmesser.
    Hinweis: Durchmesser Messungen maximal entspannt Arterien in verschiedenen Versuchsgruppen sind wertvolle Vergleich aktiv ruhenden Ton, strukturelle Umgestaltung (d. h., Änderungen im Wand-Dicke und Lumen-Durchmesser) und passive mechanische Eigenschaften (Spannungs-Dehnungs-Beziehungen aus passiven Durchmesser auf verschiedenen Ebenen der Transmural Druck berechnet).

3. Bewertung der Cerebral Blood Flow Antworten mit LDF

  1. Betäuben Sie das Tier mit 5 % Isofluran zu und sichern Sie die Ratte in einer stereotaktischen Apparat9,10.
  2. Halten Sie das Tier unter konstanten Anästhesie während der Überwachung, Atemfrequenz, Ende Gezeiten-CO2und die Tiefe der Narkose mit einer Zehe Prise36.
  3. Sorgfältig dünne Schädel, Transluzenz mit einem Zahnbohrer niedriger Drehzahl und Mineralöl, optische Kopplung10bereitzustellen. Seien Sie vorsichtig, vermeiden übermäßigen Hitze erzeugen und zu vermeiden, den Knochen eindringen.
    Hinweis: Ausdünnung des Schädels kann das Laserlicht, das darunter liegende Gewebe zu erreichen und zum die Sonde reflektiert werden, um die Dopplerverschiebung messen die Größe durch die Anzahl der beweglichen Teilchen (z.B. rote Blutkörperchen bestimmt wird) und Ihre Geschwindigkeit.
  4. Sichern Sie die LDF-Sonde in einem Mikromanipulator und positionieren Sie es direkt über die ausgedünnte Bereich des Schädels. Während des Experiments ist es sehr wichtig, Bewegung der LDF-Sonde oder die Zubereitung selbst, zu verhindern, da die LDF zur Messung des Durchflusses in einem begrenzten Gebiet des Gewebes dient und extrem empfindlich gegenüber Bewegungsartefakte ist.
    Hinweis: Jede Bewegung der Sonde Weg von seiner Ausgangsposition erhalten eine Schätzung des Blutflusses in einem anderen Bereich des Gewebes, Vergleiche ausschließt. Während LDF keine absolute Flow-Werten bietet und eignet sich nicht für den Vergleich zwischen Themen, ist es eine hervorragende Möglichkeit, nicht-invasiv Änderungen in Gewebedurchblutung in Reaktion auf experimentelle Interventionen in einzelnen Fächern zu bewerten; und relative Änderungen in LDF-Signal vom Control-Werte können im Durchschnitt und im Vergleich zu Änderungen in LDF-Signal von Kontrolle in anderen Versuchsgruppen.
    Hinweis: LDF ist ein passender Ansatz Einblick in Faktoren Blutfluss auf der Ebene des gesamten vaskulären Bettes in verschiedenen Versuchsgruppen8,9,10zu regulieren. Bewertung der Gewebedurchblutung mit LDF bietet einen praktischen Ansatz um Erkenntnisse aus isolierten Behälter Studien relativiert eine ganze Bett zu assimilieren. Abgesehen von regionalen Unterschiede der vaskulären Kontrollmechanismen Widerstand Arterien und die Mikrozirkulation geben Messungen mit LDF Aufschluss über die Gewebe Blut der Steuerung des Datenflusses, die Ergebnisse, die mit in der Regel entspricht kanülierte Arterie Vorbereitungen.

4. Bewertung des skelettartigen Muskels kapilläre Dichte mit GS1 Lektin

  1. Entfernen des Cremaster-Muskels von einer männlichen Ratte durch schneiden den Hodensack mit standard feine chirurgische Schere geöffnet und dann mit einer Pinzette Dumont Nr. 5, um den Muskel zu erfassen.
    Hinweis: Dünne Muskeln (z.B.der Cremaster-Muskel, sowie die m.digitorum Longus und m. Tibialis anterioren Streckmuskeln, die bei männlichen und weiblichen Ratten gefunden werden) für den Einsatz eignen sich ideal als Ganzes für Lektin Studien, steigt zwar histologischen Abschnitte können für dickere Gewebe verwendet werden.
  2. Entfernen Sie den Cremaster-Muskel aus dem Hoden mit einem einzigen Schnitt. Legen sie im eiskalten PSS und Heften Sie es heraus in einer Petrischale mit einem Silikon-Elastomer-Futter auf dem Boden im inneren Oberfläche. Sanft zu necken Weg Bindegewebe mit Dumont Nr. 5 Pinzette.
  3. Spülen Sie die Muskel-Proben mit 2 mL gepufferten PSS und dann tauchen sie in Rhodamin beschriftet GS1 Lektin (20 µg/mL PSS) für 50 min. in einem 12-Well Kultur Zellplatte mit 2 mL/gut ist, eingewickelt in Alufolie, Licht auszuschließen.
  4. Das Gewebe aus der Lektin-Projektmappe entfernen, spülen Sie sie dreimal in PSS mit 5 min "waschen" Inkubationen auf einer Wippe, und klebe sie auf Objektträger. Achten Sie darauf, das Gewebe im Dunkeln inkubieren und speichern die Folien in der Dunkelheit, Verlust der Fluoreszenz zu verhindern.
    Hinweis: Wenn die Folien sofort verwendet werden können, können sie in den Kühlschrank ohne Verlust der Fluoreszenz gehalten werden. Für längere Lagerung können die Folien in einer Tiefkühltruhe Verschlechterung11zu verhindern gehalten werden.
  5. Bewerten Sie kapilläre Dichte durch zählen der Anzahl der Schnittpunkte von beschrifteten Mikrogefäßen mit Computer-generierten Rasterlinien überlagert Bild52oder mit einem klaren Raster-Overlay überlagert den Monitor verwendet wird, um die Folien anzeigen.
    Hinweis: GS1 Lektin Ansätze verwendet wurden, um zu demonstrieren: Salz-induzierte mikrovaskuläre Verdünnung53, die schützende Wirkung von Salz zu verhindern induzierte Angiotensin-II-Unterdrückung bei der Wiederherstellung der kapilläre Dichte in Salz gefütterten Tiere17 ,53,54; die Rolle von NRF2 vermitteln die schützende Wirkung der niedrigen Dosis Angiotensin II Infusion kapilläre Verdünnung in Salz gefütterten Ratten17zu verhindern; und auch um die Rolle von Angiotensin II bei der Aufrechterhaltung der angiogenen Reaktionen auf chronische Muskelstimulation in Salz zugeführt Ratten54,55. Ein Vorteil der GS1-Lektin-Technik ist, dass es verwendet werden kann, kapilläre Dichte in die gleichen Tiere für Studien der kanülierte Widerstand Arterien oder LDF verwendet zu beurteilen.

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Results

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In-vitro- Mikroskopie der kanülierte Widerstand Arterien ermöglicht die Untersuchung von Einflussfaktoren auf aktive Ton in kleinen Widerstand Arterien (und größeren Arteriolen) bei normalen in Vivo Transmural drücken und bei fehlender parenchymatösen Zelle beeinflusst. Neben der Beurteilung der Reaktivität der Schiffe auf verschiedene gefäßerweiternde und vasokonstriktorische Reize und myogen Antworten auf Transmural Druck Erhebung im normalen PSS, die Ca2 +-...

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Discussion

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Wie in der Einleitung erwähnt, dieses Paper beschreibt die Verwendung von Fernsehen Mikroskopie und isolierten Widerstand Arterie Ansätze zur Bewertung der Gefäßfunktion nicht nur in standard Ratte-Modellen (wie im Video), aber auch in hochspezialisierten genetisch veränderter Ratte Stämme, die zeigen, das neuartige und leistungsfähige Einsichten, die unter Verwendung dieser Ansätze gewonnen werden können. Die Verwendung dieser leistungsfähigen Techniken, aktive Ton zu bewerten und passiv mechanischen Eigenschaften des k...

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Disclosures

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Die Autoren haben keinen finanziellen Interessenkonflikt.

Acknowledgements

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Die Autoren äußern ihren aufrichtigen Dank Katie Fink und Lynn Dondlinger für ihre unschätzbare Hilfe bei der Vorbereitung dieser Handschrift.

Zuschuss: NIH #R21-OD018309; #R56-HL065289; und #R01-HL128242.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
SS RatMedical College of WisconsinSS/JHsd/Mcwi StammKontakt Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)
SS.5BN Consomic RatMedical College of WisconsinSS-Chr 5BN/Mcwi StammKontakt Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)
SS.13BN Consomic RatMedical College of WisconsinSS-CH 13BN/Mcwi StammKontakt Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)
Ren1-BN Congenic RatMedical College of WisconsinSS. BN-(D13hmgc41-D13)hmgc23/Mcwi StammKontakt Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)
Ren1-SSA Congenic RatMedical College of WisconsinSS. BN-(D13rat77-D13rat105/Mcwi StammKontaktieren Sie Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)
Ren1-SSB Congenic RatMedical College of WisconsinSS. BN-(D13rat124-D13rat101/Mcwi StammKontakt Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)
Nrf2(-/-) Knockout Ratte and Wildtype LittermatesCollege of WisconsinSD-Nfe212em1Mcwi StammKontakt Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)
Low Salt Rat Chow (0,4% NaCl)-AIN-76A Dyets, Inc.
Rattenfutter mit hohem Salzgehalt (4 % NaCl)-AIN-76ADyets, Inc.
Colorado Video CaliperColorado Video, Inc.Modell 308
VideokameraHitachiKPM1AN
MikroskopOlympus Life ScienceCKX41
FernsehmonitorPanasonicWVBM1410
DruckwandlerStoelting56360
BlutdruckanzeigeeinheitStoelting50115
Kanülierte ArterienkammerLiving Systems InstrumentierungCH-1Einzelgefäßkammer für den allgemeinen Gebrauch
Temperaturregler für Einkammer-LebendsystemeInstrumentierungTC-09S Gasdispersionsrohr
, Miniatur, geradeWohnsysteminstrumentierungGD-MSBietet Belüftung im Gefäßbad
Gasaustausch Oxygenator, Miniatur-Lebendsystem-InstrumentierungOXErmöglicht den Gasaustausch mit Perfusat
Laser-Doppler-DurchflussmesserPerimedPeriFlux 5000 LDPM
GS1 LectinVector LabsRL-1102
Glaskapillarröhrchen für MikropipettenFredrich Haer Co.27-33-1mm ODX1 mm ID
Verticle PipettenabzieherDavid Kopf InstrumentsModell 700C
Nylon-Nahtmaterial (10/0)-3 PLYAshaway Line und Twine Manufacturing Co.114-ANM-10Einzelstränge aus 3-lagigem Nylonnaht, herausgekitzelt für die Verwendung auf Gefäßen
Dumont #5 Pinzette-InoxFine Science Tools11254-20
Vannas ScissorsFine Science Tools15003-08
ProtandimProtandimNRF2 Induktor: Wenden Sie sich an Dr. Joe McCord (JOE.MCCORD@UCDENVER.EDU)
NatriumchloridFisher BioreagenzienBP358-212
NatriumbicarbonatFisher ChemicalS233-3
Dextrose (d-Glukose) wasserfreiFisher ChemicalD16-500
Magnesiumsulfat (MgSO4-7H2O)Sigma AldrichM1880-500 G
Calciumchlorid (CaCl2-2 H2O)SigmaC5080-500G
Natriumphosphat-monobasisch (NaH2PO4)SigmaS0751-500G
Kaliumchlorid (KCl)Fisher ChemicalP217-500G
Ethylendiamintetraessigsäure Dinatriumsalzdihydrat (EDTA)SigmaED255-500G
Medical 113755113756 2

References

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