Method Article

Probengewinnung und gleichzeitige chromatographische Quantifizierung von Doxorubicin und Mitomycin C nach Kombination Medikamentenabgabe in Nanopartikel zur Tumor-tragenden Mäusen

DOI:

10.3791/56159

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October 5th, 2017

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1Department of Pharmaceutical Sciences, University of Toronto, 2Departments of Medical Biophysics and Radiation Oncology, University of Toronto, Ontario Cancer Institute, University Health Network

In This Article

Summary

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Dieses Protokoll beschreibt eine effiziente und komfortable analytischen Prozess der Probengewinnung und gleichzeitige Bestimmung von mehreren Medikamenten, Doxorubicin (DOX), Mitomycin C (MMC) und ein Cardio-toxische DOX Metabolit, Doxorubicinol (DOXol), in der biologischen Proben aus einem präklinischen Brust-Tumor-Modell mit Nanopartikel Formulierungen von synergistischen Arzneimittelkombination behandelt.

Abstract

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Kombinations-Chemotherapie wird häufig in der Klinik zur Behandlung von Krebs verwendet; damit verbundenen negative Auswirkungen auf Normalgewebe schränken jedoch seine therapeutischen Nutzen. Nanopartikel-basierte Arzneimittelkombination hat sich gezeigt, um die Probleme der freien Kombination der Arzneimitteltherapie zu mildern. Unsere früheren Studien haben gezeigt, dass die Kombination von zwei Krebsmedikamente, Doxorubicin (DOX) und Mitomycin C (MMC), produziert einen synergistischen Effekt gegen beide Murine und menschlichen Brustkrebs Zellen in Vitro. DOX und MMC Co geladenen Polymer-Lipid Hybrid Nanopartikel (DMPLN) umgangen verschiedenen Efflux-Transporter-Pumpen, die multidrug-Resistenz und nachgewiesene verbesserte Wirksamkeit bei Brustkrebs Tumormodellen übertragen. Im Vergleich zu konventionellen Lösung Formen, wurde diese überlegene Wirksamkeit von DMPLN die synchronisierten Pharmakokinetik von DOX und MMC und erhöhte intrazelluläre Medikament Bioverfügbarkeit innerhalb von Tumorzellen aktiviert, indem die Nanocarrier PLN. zugeschrieben

Zur Bewertung der Pharmakokinetik und Bio-Vertrieb von verwaltet Co DOX und MMC in kostenlose Lösung und Nanopartikel Formen, eine einfache und effiziente Multi-Drug-Analysemethode mit Reverse-Phase Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) wurde entwickelt. Im Gegensatz zu den bisher gemeldeten Methoden, die DOX oder MMC einzeln im Plasma analysiert, ist diese neue HPLC-Methode in der Lage, gleichzeitig DOX, MMC und ein großer Cardio-toxische DOX Metabolit, Doxorubicinol (DOXol), in verschiedenen biologischen Matrizen ( quantitate z. B. Vollblut, Brusttumor und Herz). Ein dual fluoreszierende und UV absorbierende Sonde 4-Methylumbelliferone (4-MU) diente als interner Standard (I.S.) für einstufige Erkennung von mehreren Drogen-Analyse mit verschiedenen Wellenlängen. Diese Methode wurde erfolgreich eingesetzt, um die Konzentrationen von DOX und MMC geliefert durch Nanopartikel und Lösung Ansätze im Vollblut und verschiedenen Geweben in einer orthotopen Brust Tumor Mausmodell zu bestimmen. Die analytische Methode vorgestellt ist ein nützliches Werkzeug für die prä-klinischen Analyse von Nanopartikel-basierte Lieferung von Medikamenten-Kombinationen.

Introduction

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Chemotherapie ist eine primäre Behandlungsmethode für viele Krebsarten, dennoch es oft mit schweren Nebenwirkungen und begrenzte Wirksamkeit aufgrund von Resistenzen und anderen Faktoren1,2,3 ist. Um das Ergebnis der Chemotherapie zu verbessern, wurden Drogen Kombination Therapien angewendet in der Klinik basierend auf Kriterien wie nicht-überlappende Toxizitäten, verschiedene Mechanismen der Wirkdauer und nicht Kreuz Medikament Widerstand4,5 , 6. in klinischen Studien eine bessere T....

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Protocol

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alle Tierversuche wurden genehmigt durch die Animal Care Ausschuss des University Health Network am Ontario Cancer Institute und im Einklang mit dem Canadian Council über Animal Care Leitlinien.

1. biologische Probenvorbereitung

  1. sammeln die Vollblut, wichtige Organe und Brust-Tumor zu vorgegebenen Zeitpunkten nach der intravenösen (i.v.) Verabreichung von wirkstoffhaltigen Formulierungen (z.B. DMPLN, liposomale DOX)
    1. injizieren ein Brust-Tumor-tragenden Maus i.v. mit einer vorbereiteten wirkstoffhaltigen Formulierung.
    2. Die Maus zu festgelegten Zeitpunkten (z.B., 15 min) zu betä....

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Results

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Zwei Krebsmedikamente, DOX und MMC sowie der DOX Metabolit, DOXol, wurden gleichzeitig ohne biologische Störungen unter der gleichen angewandte Gradienten HPLC Zustand mit 4-MU als die I.S. für die Fluoreszenz und die UV-Detektoren nachgewiesen. DOX, MMC, DOXol und 4-MU waren gut getrennt voneinander mit Retentionszeiten von 5,7 min für MMC, 10,4 min für DOXol, 10,9 min für 4-MU und 11,1 min für DOX (Abbildung 2). Jedes Medikament im Vollblut und verschiedene.......

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Discussion

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Im Vergleich zu anderen chromatographischen Methoden, die den Nachweis einer einzigen Wirkstoff-Spezies zu einem Zeitpunkt zu ermöglichen, ist dieses HPLC-Protokolls in der Lage, gleichzeitig drei Wirkstoffe (DOX, MMC und DOXol) in der gleichen biologischen Matrix ohne die Notwendigkeit zu ändern quantitate die mobile Phase. Diese Vorbereitung und Analyse-Methode wurde erfolgreich eingesetzt, um die Pharmakokinetik und Bio-Vertrieb von zwei Nanopartikel-based Drug Delivery Systeme bestimmen (z. B. liposomalen DO.......

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Disclosures

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Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen und Interessenkonflikte.

Acknowledgements

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Die Autoren erkennen dankbar der Anlagen Zuschuss von naturwissenschaftlichen und technischen Forschung (NSERC) Council of Canada für HPLC, Betriebskostenzuschuss seitens des Canadian Institute of Health Research (CIHR) und Canadian Breast Cancer Research (CBCR) Allianz X.Y. Wu und der University of Toronto-Stipendium für R.X. Zhang und T. Zhang.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Doxorubicin Polymed Theraeutics111023Krebsmedikament
Mitomycin CPolymed Theraeutics060814Krebsmedikament
Doxorubicinol (DOXol)Toronto Research ChemicalsD558020Metabolit von DOX
4-Methylumbelliferon-Natriumsalz Sigma-AldrichM1508Interner Standard
MyristinsäureSigma-Aldrich544-63-8   Materialien für Polylipid-Hybrid-Nanopartikel
Polyoxyethylen (100) StearateSpectrumM1402Materialien für Polylipid-Hybrid-Nanopartikel
Polyoxyethylen (40) StearatSigma-AldrichP3440Materialien für Polylipid-Hybrid-Nanopartikel
Pluronic F68 (PF68)BASF Corp.9003-11-6Materialien für Polylipid-Hybrid-Nanopartikel
Ultraschall (UP100H)Hielscher, UltraschalltechnologieNANanopartikelvorbereitung
Wasserbad (ISOTEMP 3016HS)Fisher ScientificNANanopartikelzubereitung
Liposomales Doxorubicin  (Caelyx)JanssenGekauft in der Apotheke Princess Margaret HospitalKlinisch zugelassene Nanopartikelformulierung 
HPLC-zertifiziertes MethanolCaledon Chemicals6701-7-40HPLC-Zusammensetzung für mobile Phasen
HPLC-graded H2OCaledon Chemicals8801-7-40HPLC-Zusammensetzung für mobile Phasen
HPLC-zertifiziertes Acetonitril Caledon Chemicals1401-7-40HPLC Zusammensetzung der mobilen Phase
TrifluoressigsäureSigma-Aldrich302031HPLC Zusammensetzung der mobilen Phase
0,45 μ m Nylonmembran-FilterpapierWhatmanWHA7404004HPLC-Vorbereitung der mobilen Phase
1cc KunststoffspritzenBecton, Dickinson and Company2606-309659Behandlungsinjektion
5cc KunststoffspritzenBecton, Dickinson and Company2608-309646Gewebeentnahmen
30G 1/2 NadelnBecton, Dickinson and Company305106Behandlung Injektion
25G 5/8 NadelnBecton, Dickinson and Company305122Gewebeentnahmen
Steril 0,9% KochsalzlösungUniversität Toronto Hausmarke1011Gewebeperfusion
13 ml Konisches Röhrchen mit abgerundetem Boden SARSTEDT62.515.006Prolyprolen, Gewebehomogenisierung
Alpha Minimum Essential Medium (MEM)Gibco12571063Zellmedium
1 x Phosphatpuffer KochsalzlösungGibco10010023Gewebehomogenisierung
Triton X-100Sigma-AldrichX100-100 MLGewebehomogenisierung
AmeisensäureCaledon Chemicals1/5/3840pH-Wert für Extraktionslösungsmittel einstellen
Natriumheparin besprühte KunststoffröhrchenBecton, Dickinson and Company367878Blutentnahme
 Sartorius CPA225D
NA pH-Messgeräte Fisher Scientific13-637-671accumet BASIC
Vortex MixterFisher Scientific02-215-365Vortexen von Proben mit der gewünschten Geschwindigkeit
von 1,5 ml  MikrozentrifugenröhrchenFisherbrand2043-05408129Prolyprolen
Modell 1000 HomogenisatorFisher Scientific08-451-672Gewebehomogenisierung
5702REppendorf5702RExtraktionsvorbereitung
Beheiztes VerdampfersystemGlas-ColNAProbenrekonstitution
HPLC Fläschchen mit SchraubgewindeDIKMA5320HPLC-Probeninjektion
HPLC-Schraubverschlüsse mit PTFE-Septen aus weißem SilikonDIKMA5325HPLC-Probeninjektion
HPLC-Polypropylen-Einsatz   Agilent Technologies5182-0549Maximales Volumen 250 μ l, HPLC-Probeninjektion
Xbridge C18 ColumnWaters Corporation186003117Arzneimittelanalytik
Gradientenpumpe Waters CorporationW600für die Arzneimittelanalytik
Waters CorporationW2707
Photodioden-Array-DetektorWaters CorporationW2998Wirkstoffanalyse
Multi- & Lambda-Fluoreszenzdetektor Waters CorporationW2475Arzneimittelanalytik
EMPOWER 2Waters CorporationNADatenanalysesoftware
WissenschaftlerMicromathNAPharmakokinetische Analyse
Weibliche Balb/c-MäuseJackson Laboratory001026In vivo
EMT6/WT Brustkrebszellenzur Verfügung gestellt von Dr. Ian Tannock; Ontario Cancer InstituteNAIn vivo
Analytische Waage für Zentrifuge für Autosampler für die Arzneimittelanalyse

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Holohan, C., Van Schaeybroeck, S., Longley, D. B., Johnston, P. G. Cancer Drug Resistance: An Evolving Paradigm. Nat. Rev. Cancer. 13 (10), 714-726 (2013).
  2. Szakacs, G., Paterson, J. K., Ludwig, J. A., Booth-Genthe, C., Gottesman, M. M. Targeting Multidrug Resistance in Cancer. Nat Rev Drug Discov. ....

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Doxorubicin Mitomycin CHPLC QuantitationDrug Combination AnalysisNanoparticle Drug DeliveryReverse Phase HPLCBiological Matrix ExtractionInternal Standard MethodSimultaneous Drug DetectionPharmacokinetics StudyTumor Tissue Analysis

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