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Genetics

化学修饰肽核酸对单链 rna 双链 rna 的序列特异和选择性识别

Published: September 21, 2017 doi: 10.3791/56221
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Division of Chemistry and Biological Chemistry, School of Physical and Mathematical Sciences, Nanyang Technological University
* These authors contributed equally

Summary

我们报告了合成和纯化多肽核酸 (巴氨酸) 齐聚物的协议。本文介绍了复式修饰 PNAs 识别 RNA 的生物化学和生物物理方法。

Abstract

rna 正逐渐成为重要的生物标志物和治疗靶点。因此, 在 RNA 序列和结构的识别方面, 开发化学探针和治疗配体具有很大的潜力。化学修饰的核酸 (肽) 寡聚物最近被开发, 可以识别 RNA 复式在序列特定的方式。PNAs 的化学稳定性与中性肽样骨干。PNAs 可通过人工合成的 Boc-化学固相肽综合法相对容易合成。采用反相高效液相色谱法纯化 PNAs, 然后通过基质辅助激光解吸/电离-飞行时间 (MALDI) 对分子量进行表征。非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE) 技术促进了三重形成的成像, 因为精心设计的自由 RNA 复式结构和肽结合 triplexes 经常显示不同的迁移率。非变性页与溴溴后染色往往是一个简单的和信息技术, 以表征结合亲和力和特异性肽寡聚物。通常, 多个 RNA 发夹或复式单碱基对突变可用于表征肽结合性质, 如结合的亲和力和特殊性。2-嘌呤是腺嘌呤的异构体 (6-嘌呤);2-嘌呤荧光强度对局部结构环境变化敏感, 适用于在肽结合位点附近的 2-嘌呤残留物的三重形成监测。2-嘌呤荧光滴定法还可用于确认修饰 PNAs 对靶双 rna (dsRNAs) 的结合选择性 (单 rna)。紫外吸收-检测热熔实验允许测定肽-RNA 复式和 PNA·的热稳定性RNA2 triplexes。在这里, 我们描述了合成和纯化的肽寡聚体包含修饰残留物, 并描述了生物化学和生物物理方法的表征, RNA 复式的识别的修改 PNAs。

Introduction

rna 是重要的生物标记物和治疗靶点, 由于在不同的生物过程的调控和催化作用上的 rna 的发现的最近进展1,2,3。传统上, 反义股已被用来绑定到 ssRNAs 通过沃森-克里克复式编队 3,4,5,6,7,89,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26, 27. 最近, 三重形成的肽核酸 (TFPNAs) 被设计通过 Hoogsteen 氢键结合 (图 1)3,28的 dsRNAs。dsRNA 地区是存在于大多数传统反义的 rna, 包括 pre-mRNAs 和基因, 或 pri rna3, 和许多其他编码 rna1,26,27。以 TFPNAs 为目标的 dsRNAs 通过三重螺旋形成可能是有利的, 由于其结构的特殊性, 并具有巨大的潜力, 用于恢复正常功能的 rna, 这是失调在疾病, 例如。

最近发布的工作由 Rozners et al.和 us3、28、29、30、3132、33 34,35,36,373839,4041, 报告了改善改良 TFPNAs 对 dsRNAs 的选择性结合增强亲和性。我们已经开发了合理设计的肽单体 (图 2) 的合成方法, 包括硫代 pseudoisocytosine (L) 单体的30和胍改性的5甲基胞嘧啶 (Q) 单体31。通过各种生物化学和生物物理特性的方法, 我们已经证明, 相对短的 PNAs (6-10 残留) 纳入 L 和 Q 残留显示, 改善了沃森-克里克 g-c 和 c-g 基对, 分别在 dsRNAs。此外, 与未修饰的 PNAs 相比, PNAs 含 L 和 Q 残留物对 dsRNA ssRNA 和 dsDNA 具有更具选择性的约束力。在 Q 基地的胍功能42使 PNAs 进入 HeLa 细胞31。

在我们的实验室, 我们合成 PNAs 由手工中银化学 (boc 或t-boc 代表叔 butyloxycarbony (参见图 2) 固相多肽合成方法4。以 boc 为胺保护基团合成的肽基单体, 与 fluorenylmethyloxycarbonyl (芴甲氧羰基) 胺保护基团相比, 具有更大的阻, 在肽类单体偶联中可能有益坚实的支持。中银集团是酸不稳定的, 可以很容易地去除固体支持的20-50% 乙酸酸 (TFA) 在二氯甲烷 (DCM) 在肽的合成。一种可用于合成肽类寡聚物的自动缩氨酸合成物;然而, 在自动多肽合成器中, 需要3-5 倍的蛋白质肽单体。手动合成需要大大减少肽单体 (2-3 倍多余), 每个耦合容易监测的凯泽测试43。此外, 许多自动合成器不兼容的 boc 战略综合, 由于使用腐蚀性 TFA 在中行的去除步骤。

采用反相高效液相色谱 (RP-HPLC), 通过 MALDI 的分子量表征 (图 3和 4)30,可以纯化肽寡聚物。31. 我们使用变性页来监视三重形成, 由于自由 RNA 双工构造和肽结合 triplexes 经常显示不同的迁移率 (图 5)30,31.如果能实现两个 RNA 双工和 PNA·的高效 post-staining, 则不需要标记RNA2三重带。变性页实验需要一个相对较小的样本量。但是, 加载 (孵化) 缓冲器和运行缓冲 (ph 8.3) 可能不一样, 导致测量被限制在动力学稳定的 triplexes, 因为相对较高的 ph 值8.3 可能会极大地动摇一个三重。

2-嘌呤是腺嘌呤的异构体 (6-嘌呤);2-嘌呤荧光强度 (发射峰在大约 370 nm) 是敏感的局部结构环境的变化, 并适用于监测的三重形成与 2-嘌呤残留物附近的肽结合位点 (图 6)31. 与其他许多在可见范围内显示荧光发射的染料不同, 2-嘌呤标记的 RNA 可以暴露在室温下, 而不需要光漂白。不像页面实验, 其中一个运行的缓冲 ph 8.3 是经常需要的, 2 嘌呤的荧光滴定法允许测量的约束力在一个解决方案在指定的 ph 值, 从而可以允许测量和检测相对薄弱和动力学不稳定的束缚在平衡。

紫外吸收-检测热熔实验允许测量复式 (图 7) 的热稳定性31和三丛30,32,44,45。根据长度和序列组成, 熔化的 triplexes 可能或可能不会显示一个明确的过渡。如果加热和冷却曲线重叠, 就可以得到热力学参数。等温滴定量热法 (ITC)32可获得准确的热力学参数;但是, 贸易中心通常需要大量的样品。

Protocol

1. PNAs 用中银化学的手动固相多肽合成

注意: 为了获得所需的肽类齐聚物合成的成功和容易, 所有的溶剂和试剂都应该是无水的。加入适当的分子筛 (4A, 直径1-2 毫米的颗粒), 偶尔将干氮气净化成瓶子。对于合成的修饰肽单体, 所报告的协议在各自的参考 30 , 31 可以使用。未修改的肽单体可以从商业来源购买。在每一个洗涤步骤, 适当的数量的溶剂添加到树脂, 形成一个浆料, 在它被排出.

  1. 在树脂上装载第一个单体并盖过多余的游离初级胺,
    1. 重30毫克 4-methylbenzhydrylamine 盐酸盐 (MBHA 和 #183; HCl) 聚苯乙烯树脂 (可商用; 加载值 0.7-1。4摩尔/克;100-200 目大小), 并转移到5毫升固相肽反应容器装有塞和玻璃塞子.
    2. 将树脂浸泡在适当数量的 DCM 中1小时, 使树脂膨胀并暴露胺 (HCl 盐).
      注: 在整个合成过程中, 树脂珠应始终完全浸入溶剂中.
    3. 通过在烧瓶顶部应用温和的干氮气气流, 将 DCM 排出。在 DCM 中添加 1 mL 50% (v/v) n, n -diisopropylethylamine (DIPEA), 并将其保留15分钟。这中和在树脂上附着在游离胺上的 HCl 盐.
    4. 重复步骤1.1.3。同时, 重6和 #181; 摩尔的单体和6和 #181; 摩尔的 (benzotriazol-1-基氧) tripyrrolidinophosphonium 六氟磷酸盐 (PyBOP), 并转移到1.5 毫升管。添加200和 #181; 胺 (DMF) 和12和 #181; 摩尔 DIPEA。涡的耦合解决方案为3-5 分钟的
      注: 所用的负载值为0.2 摩尔/克。所添加的第一单体是所需的肽序列 C 端的单体。第一个氨基酸的装载价值可以由苦味酸酸方法 46 计算.
    5. 从 DCM 解决方案中吸取 DIPEA。用 DCM (x 3) 清洗树脂, 其次是 DMF (x 3), 然后关闭塞。将准备好的偶联溶液加入树脂中, 轻轻摇动。用清洁的不锈钢刮刀将树脂沿容器内壁推入耦合溶液中。将玻璃塞子固定在恒温箱中, 在3小时 40 #176; C.
      注: 另一种方法是, 反应釜可在室温下保持稳定6-8 小时, 以使肽偶联反应完成.
    6. 通过混合240和 #181 来准备上限解决方案; 乙酸酐和360和 #181 的摩尔; DIPEA 为200和 #181; DCM 的 L。排出耦合液, 用 DMF (x 3) 和 DCM (x 3) 清洗树脂。加盖解决方案, 并离开船30分钟, 偶尔摇晃船只轻轻。用乙酰化法对树脂上的过量游离初级胺基团进行封盖.
    7. 重复步骤1.1.6。排出瓶盖溶液, 用 DCM (x 3) 冲洗树脂.
    8. 用细毛细管将小分树脂珠取出, 放入1.5 毫升小玻璃瓶中。执行凯泽测试 43 。添加15和 #181; 每一个凯泽测试解决方案, 到玻璃瓶和热使用热枪。加热后观察珠子的颜色。珠子的颜色应保持不变, 表明树脂上缺乏游离胺基团.
      注: 凯撒测试套件是商用的, 或者可以根据报告的协议准备。溶液 A: 乙醇中的茚;溶液 B: 乙醇中的苯酚;溶液 C: 吡啶中的氰化钾 (KCN).
      警告: KCN 是剧毒的;在没有易燃溶剂或试剂的情况下, 应穿戴适当的防护服, 在通风良好的通风罩内进行加热.
    9. 重复步骤1.1.6 如果树脂珠显示蓝色或淡蓝色.
  2. 删除 n-端胺保护组
    1. 将溶剂从反应釜中排出, 并在 DCM 中添加乙酸酸 (TFA) 的 50% (v/v) 溶液, 确保树脂完全浸入。离开该船15分钟, 偶尔摇动, 以方便脱胺基团。重复2次循环.
      警告: TFA 具有极强的腐蚀性。搬运时应佩戴适当的防护服.
    2. 用 dcm (x 3)、DMF (x 3) 和 dcm (x 3) 清洗树脂。在 DCM 中添加 5% DIPEA 的解决方案。离开船15分钟。这一步通过中和 TFA 反阴离子来激活游离胺。再重复一次.
    3. 从 DCM 解决方案中刷新 DIPEA。用 DCM (x 3) 清洗树脂。执行凯撒测试 (步骤 1.1.8).
      注: 成功的脱胺基团将产生蓝色变色的珠子。一旦脱成功, 就可以通过肽偶联进行单体的后续耦合.
      4. 随后单体的
  3. 耦合器
      称18和 #181; 所需单体的摩尔 (对 Boc-肽-OH 单体, 13.2 毫克的单体称重) 和18和 #181; 摩尔的 PyBOP 为1.5 毫升管。添加200和 #181; DMF 和 36 #181; 摩尔的 DIPEA 进入1.5 毫升管。漩涡直到所有固体化合物被溶解.
    1. 用 DMF 清洗树脂 (x 3)。将耦合液加入反应釜中, 轻轻摇动。用清洁的不锈钢刮刀将树脂沿容器内壁推入耦合溶液中。将玻璃塞子固定在恒温箱中, 在3小时 40 #176; C.
    2. 排出耦合液, 用 DMF (x 3) 和 DCM (x 3) 清洗树脂。执行步骤1.1.8。如果珠子的颜色保持不变, 重复步骤 1.2. 1-1. 3.3 直到所期望的肽序列完成。如果在单体耦合后观察珠子的蓝色变色, 重复步骤 1.3. 1-1. 3.3。如果变色仍然存在, 再次执行上限 (步骤 1.1.6).
      注: 如果出现耦合问题, 则建议延长耦合时间 (3-12 小时) 和/或使用多余的单体和偶联试剂.
    3. 一旦所需的肽序列完成, 用 DMF (x 3) 和 DCM (x 3) 清洗树脂。将干氮气连续流动15分钟, 使树脂完全干燥。这种干燥的树脂可以分裂, 并用于附着赖氨酸或荧光标记, 如菁 3 (Cy3) 和羧基在 N 末端的巴胺肽.
  4. 连接赖氨酸或荧光标记 (Cy3、Cy5 或羧基) 到巴氨酸
      的 N 末端, 重达10毫克的树脂, 并预装了所需的肽序列。转移到5毫升反应容器。将树脂浸泡在 DCM 中1小时.
    1. 对于赖氨酸的附着, 执行步骤 1.2. 1-1. 3.3, 用中银-赖氨酸 (Z)-oh 或芴甲氧羰基-赖氨酸 (boc) 取代单体-哦.
    2. 有关羧基的附件, 请执行步骤 1.2. 1-1. 3。3, 10 倍超过 5 (6)-羧基为单体, 而 n、n 和 #39; -diisopropylcarbodiimide (DIPC) 和 hydroxybenzotriazole (HOBt) 作为 DMF 中的偶联试剂。将耦合反应留在40和 #176 的恒温箱中过夜; C.
      注: 由于羧基对光敏感, 反应容器应覆盖铝箔.
    3. Cy3 或 Cy5 染料的附件, 按 "化学方法" 标签, 执行步骤 1.2. 1-1. 3.3, 用 N-Boc-2-propargyl-L-glycine 取代单体。这 functionalizes 炔烃组的 N 末端。执行铜催化单击反应, 以附加叠氮化物含 Cy3 或 Cy5 荧光染料 12 , 47 , 48 , 49
  5. 从固态支持、纯化和特性分析中提取卵裂 注: 如果任何胺类群受甲氧羰基保护基团保护, 首先 deprotect 胺基团, 在 DMF 中处理 20% piperdine解决方案为15分钟 (2 周期)。用 DMF (x 3) 彻底清洗树脂, 然后是 DCM (x 3)。将干氮气连续流动15分钟, 使树脂完全干燥。
    1. 将5毫克的干树脂转移到小瓶中。添加10和 #181; l 硫和 4 #181; l 12-乙, 确保树脂浸入试剂中。在室温下离开管5分钟.
      注: 这些试剂作为清道夫, 它诱捕活性阳离子物种, 这是在清除保护基团的过程中形成的。适当的清道夫可以选择基于侧链保护组.
    2. 添加100和 #181; TFA 进入含有树脂和清道夫的管子。轻轻地将混合物涡旋, 并进行短暂的离心。在室温下离开管10分钟.
      警告: TFA 具有极强的腐蚀性。搬运时应佩戴适当的防护服.
    3. 小心地将20和 #181 的磺酸 (TFMSA) 添加到管中。在室温下, 轻轻地搅动反应混合物, 然后进行短暂的离心。使管在室温下保持稳定2小时.
      警告: TFMSA 具有极强的腐蚀性。搬运时应佩戴适当的防护服.
    4. 用装有棉花的玻璃巴斯德吸管将裂解鸡尾酒过滤成5毫升的圆形底瓶 (RBF)。使用少量的 TFA 来清洗树脂.
    5. 将干氮气清除到所收集的滤液中, 直到所有挥发性溶剂被蒸发。在 RBF 中加入1毫升的冷乙醚.
      注: 乙醚会引起肽的沉淀。
      1. 在将云溶液转换为1.5 毫升管之前, 先用乙醚将径向基函数冲洗几次。将试管进行离心处理, 以使肽的沉淀安定下来。醒酒溶剂, 加 300-500 #181; 蒸压水的沉淀。漩涡彻底溶解的巴肽.
    6. 使用 water-acetonitrile-0.1% TFA 作为移动阶段, 通过反相高效液相色谱纯化粗肽样样品。收集相应的分数, 蒸发所有溶剂使用真空浓缩器之前, re-dissolving 纯化肽在蒸压水中.
    7. 用和 #945 的 MALDI-cyano-4-hydroxycinnamic 酸 (CHCA) 作为样品结晶基质, 表征纯化的肽的特性.
    8. 在65和 #176 测量肽核酸的紫外线吸收量 (260 nm); c. 计算肽的浓度与方程:
      Equation 1
      注意: 这里 c 是浓度, A 是获得的吸光度读数, 和 #949; 是 RNA 序列的消光系数, l 是试管的光学路径长度 (1cm). 肽序列的消光系数是单个单体的消光系数的总和 50 。腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和嘧啶的消光系数分别为15.4、7.3、11.7 和8.8 毫升/和 #181; 摩尔和 #183; cm。所使用的 l-和 Q 单体的消光系数假定与胞嘧啶 (C) 基的消失率相同.

2。非变性页

  1. 准备必需的缓冲区解决方案
    1. 使用116.88 毫克氯化钠 (200 mm)、50和 #181, 准备孵化缓冲液 (10 毫升); 100 mm 乙酸酸 (EDTA) (0.5 mm), 200 和 #181; 1M 库存 lHEPES (20 mM), 9.75 m H 2 O;将缓冲器调整为 pH 值 7.5.
    2. 用100毫升10x 三硼酸盐-edta 在 pH 值8.3 和 900 ml H 上制备1x 三硼酸盐-edta (1 升)-2 O
    3. 10% 过硫酸铵 (APS) 溶液 (300-#181; l) 使用30毫克过硫酸铵, 300 和 #181; l H 2 O.
  2. 准备12% 聚丙烯酰胺凝胶
      清洗 well-forming 梳、玻璃浇铸板和乙醇的垫片; well-forming 梳和垫片是1毫米厚。用凝胶封口胶带设置凝胶组装和密封.
    1. 对于 22 cm x 16.5 cm x 1 mm 尺寸的聚丙烯酰胺凝胶, 50 毫升的凝胶溶液是足够的。称量5.7 克丙烯酰胺和0.3 克的 n、n 和 #39;-methylenebisacrylamide (19:1), 并将其转换为50毫升离心管.
      注意: 丙烯酰胺是致癌的。避免吸入丙烯酰胺产生的粉尘烟雾, 并确保在搬运时佩戴适当的防护服.
    2. 将离心管放入50和 #176 中, 将固体化合物溶解在50毫升1X 的运行缓冲器中; C 水浴15分钟或直到所有固体化合物溶解。执行离心 (3000 rpm, 5 分钟, 25 和 #176; C), 以消除所有气泡内的解决方案。让溶液冷却到室温.
    3. 添加250和 #181; 10% APS 解决方案和 50 #181; l tetramethylethylenediamine (TEMED) 到凝胶溶液中, 用刮刀轻轻搅拌。立即倒在玻璃板之间的解决方案, 确保不引入任何气泡。插入 well-forming 梳, 并在室温下将凝胶设置为至少60分钟, 以允许聚合发生, 然后在存储在4和 #176; C 直到准备使用.
  3. 准备样品
    1. 将所需数量的 RNA 发夹 (1 和 #181; M) 从主库存移到干净的1.5 毫升管中。使用真空浓缩器干燥 RNA 溶液.
      注: 每个样品包含1和 #181; M 的 RNA 在20和 #181; L 孵化缓冲。通常, 13 样本的 RNA 是为一页实验准备。所有样品的 RNA 都可以在一根管子中一起制备.
    2. 删除所需数量的目标肽 (最终浓度高达50和 #181; M) 从主要库存和转移到单独的1.5 毫升管。使用真空浓缩器蒸发肽溶液的水.
    3. 添加260和 #181; L 的孵化缓冲到1.5 毫升管含有干 rna 和彻底混合, 以确保所有的 rna 被羞辱olved将 RNA 置于冷却: 将管子放入热块 (预热到95和 #176; C) 5 分钟后立即转到冰浴中, 然后离开10分钟.
    4. 添加20和 #181; 在含有干肽的1.5 毫升管中加入 RNA, 并彻底混合。执行退火: 将含有 RNA 和肽类混合物的管子放入热块 (预热到65和 #176; C) 10 分钟关闭散热块的电源, 让样品慢慢冷却到室温。在晚上4和 #176 孵化样品; C.
  4. 运行和处理凝胶
      将玻璃盘底部的凝胶密封胶带移除。用塑料夹子将玻璃板固定在垂直的凝胶支架上.
      注: 凝胶运行在一个寒冷的房间进行, 大约4和 #176; C。在运行凝胶之前, 所有的设备、样品和缓冲器都冷却在4和 #176; C.
    1. 用1x 的缓冲池填充下缓冲区, 直到该板被淹没在大约1-2 厘米的运行缓冲器中。用运行缓冲器填充上缓冲区, 直到缓冲液的水平超过凝胶的顶部1-2 厘米. 慢慢地轻轻地移开 well-forming 梳, 允许运行的缓冲器填满井.
    2. 将凝胶支架连接至电源。预运行凝胶至少30分钟与恒定电压 250 V, 为 22 cm x 16.5 cm x 1 毫米胶凝体被优选.
    3. 同时, 添加4和 #181; L (20% 的样品量) 的35% 甘油溶液对每个样品和轻轻地混合。一旦运行完成, 装载20和 #181; L 每个样品 (包括一个 rna 单独样品和包含 rna 和肽混合物的样品) 仔细地入井的底部使用微和胶凝体装货提示, 保证不介绍任何气泡。在250伏的恒定电压下运行凝胶, 类似于运行, 用于5小时.
    4. 在5小时后停止电源, 然后从支架上卸下玻璃板。取下剩余的胶封胶带, 拆卸玻璃板。用350毫升去离子水将凝胶轻轻地取出并浸入到容器中。小心地添加35和 #181; L 溴溴化物 (10 毫克/毫升), 并将容器放在平台振动筛 (低速) 上, 30 分钟.
      注意: 溴溴化物是一种诱变。搬运时应佩戴适当的防护服.
    5. 将溴溴化液处理为指定的废弃容器。用蒸馏水冲洗 1.5-2 升的凝胶。用一个 532 nm 的绿色激光器扫描凝胶 (参见 材料表 ), 并将发射过滤器设置为 610 nm.
  5. 凝胶分析
    1. 使用自由软件 GelQuant.NET (http://www.biochemlabsolutions.com/GelQuantNET.html) 量化凝胶带强度。根据以下内容规范化频带强度:
      Equation 2
      注意: 在这里 I 双面打印器最大 是单独的 RNA 发夹的带强度没有加法肽, 并且 I 三重最大 是三重波段强度与最高浓度的肽增加。
      1. 根据:
        Equation 3
    2. 将三重编队 (Y) 的分数计算为所添加的肽浓度 (#181; M)。将数据与公式相匹配以获取离解常数 ( K d ):
      Equation 4
      注意: 这里 R 0 是 RNA 发夹浓度 (1 和 #181; M)。在这里, Y 0 和 B 分别是三重分数的初始和最大变化。Y 是在不同的肽浓度的三重的分数。X 是总肽浓度和 K d 是离解常数.

3. 2-嘌呤荧光结合试验

  1. 准备样品 (含 dsRNA)
      删除所需数量的 2-嘌呤 (2AP) 标记 dsRNA (1 和 #181; M 为每个股) 从主要的股票变成一个干净的1.5 毫升管。用真空浓缩器在 RNA 溶液中蒸发水分.
      注: 每个样品包含1和 #181; M 的 RNA 在75和 #181; L 孵化缓冲。通常, 13 样本的 RNA 的准备。RNA 为所有样品可以一起准备在一根管子.
    1. 从主要库存中删除所需的目标肽的数量, 并将其转移到单独的1.5 毫升管中。使用真空浓缩器蒸发肽溶液的水.
    2. 添加975和 #181; L 的孵化缓冲到1.5 毫升管含有干 rna 和混合彻底, 以确保所有 rna 被解散。简要地离心 RNA 解答并且服从它退火: 安置管子入热块 (预热到95和 #176; C) 为10分钟关闭热块的力量并且让样品慢慢地冷却到室温.
    3. 添加75和 #181; 在含有干肽的1.5 毫升管中加入 RNA, 并彻底混合。将样品留在室温下至少1小时, 在4和 #176 ° C 下孵化样品; 一夜之间.
  2. 准备样品 (含 ssRNA)
    1. 将所需数量的 2 ap 标记的 ssRNA (1 和 #181; M) 从主库存中移到干净的1.5 毫升的管子中。提取所需数量的目标肽, 从主要库存的各种浓度和转移到各自的1.5 毫升管包含 ssRNA。使用真空浓缩器干燥 RNA 和肽的混合物.
    2. 添加75和 #181; L 的孵化缓冲到每个1.5 毫升管和混合彻底。将混合料退火: 将管放入热块 (预热至95和 #176; C) 10 分钟关闭电源, 让样品慢慢冷却到室温。在晚上4和 #176 孵化样品; C.
  3. 测量和分析
    1. 使用荧光分光光度计测量波长范围为 330-550 nm 的发射。使用 303 nm 的激发波长.
      注: 样品在室温下测量, 每样样品被测量3次, 平均取平均值.
    2. 传输70和 #181; L 孵化缓冲到 1 cm 正方形试管。开始测量.
    3. 从试管中删除缓冲区。用蒸馏水冲洗试管, 净化氮气晾干。对所有示例重复此操作。从所有示例中减去缓冲区度量值.
    4. 根据波长 (nm) 绘制荧光强度 (a.u)。将所有样品的荧光强度记录在 370 nm。在 370 nm (a.u) 上, 根据所添加的肽 (#181; M) 的相应浓度绘制荧光强度.
    5. 将数据与步骤2.5.2 的公式相匹配以获取离解常数 ( K d ): y = y 0 + (B/(2 r 0 )) (r 0 + X + K d -(r 0 + X + K d ) 2 -4R 0 X) 1/2 ), 其中 R 0 是 2 ap 标记的 dsRNA 浓度 (1 和 #181; M).
      注意: 在这里 Y 0 和 B 是荧光强度的初始和最大变化分别为 370 nm。Y 是 370 nm 的荧光强度在不同的肽浓度。X 是总肽浓度和 K d 是离解常数.

4。紫外吸收-检测的热熔实验

  1. 样品制备 注: 测量 rna 在95和 #176 的紫外线吸收 (260 nm); C (确保 rna 二级结构被打乱)。用方程计算 RNA 的浓度:
    Equation 5
    和 #8203; 其中 c 是浓度, A 是获得的吸光度读数, 以及 #949; 是消光系数RNA 序列, l 是试管 (1 厘米) 的光学路径长度。利用 MeltWin 51 , 52 , 基于最近邻模型计算 RNA 的消光系数。程序包可根据要求提供。
    1. 将所需数量的 ssRNA (5 和 #181; M) 从主库存移到干净的1.5 毫升管中。将所需数量的目标肽 (5 #181; M) 从主要库存中移除, 并将其转移到包含 ssRNA 的相应1.5 毫升管中。使用真空浓缩器干燥 RNA 和肽的混合物.
    2. 添加130和 #181; L 的孵化缓冲到每个1.5 毫升管和混合彻底。将混合料退火: 将管放入热块 (预热至95和 #176; C) 10 分钟关闭电源, 让样品慢慢冷却到室温。在晚上4和 #176 孵化样品; C.
  2. 测量和分析
    1. 使用紫外可见分光光度计测量 260 nm 的吸光度, 使用8微试管, 路径长度为1厘米. 测量样品和 #39; 吸收在升温15到95和 #176; c, 其次是降低温度从95到15和 #176; c 在坡道速度为0.5 和 #176; c/分钟.
    2. 传输130和 #181; L 将样本放入每个井中, 确保其中一个井包含了孵化缓冲。开始测量。根据需要重复此操作.
    3. 使吸光度值正常化为统一的高温读数, 并根据温度 (#176; C) 绘制归一化吸收读数。绘制曲线的第一个导数。通过将第一阶导数曲线拟合到高斯函数来获得熔化温度.

Representative Results

反相 HPLC 法可以纯化肽核酸寡聚物。我们可以得到纯肽寡聚物与两个回合的 HPLC 纯化 (图 3)。PNAs 的身份可以通过 MALDI-飞行时分析 (图 4) 进行确认。

非变性页是一种简单的信息技术, 用于表征肽寡聚物的结合亲和力和特异性。我们通常使用多个 RNA 发夹或复式单基对突变来表征绑定属性 (图 5)。图 5中显示的变性页数据清楚地表明, Q 和 L 修饰的肽可以识别一个具有 C-G 对的 dsRNA 区域 (图 5B, 底部面板) 但没有一个没有 C-G 对 (图 5B, 顶部面板)。这种特定的和增强的识别是通过 T·L·Q·PNA·RNA2基三 (图 1A, C, D) 形成。不同的 PNAs 有单个或多个突变, 也可以用来证明改良的肽的结合性能。我们已经表明, 在孵化缓冲中添加 2 mM Mg2 +不会影响绑定显着31。

我们已经证明了 2-嘌呤荧光滴定, 一个 Q 和 L 修饰的肽结合到一个目标的 dsRNA 区域 (图 6a, 6C, 6D), 但不是 ssRNA (图 6B, 6E, 6F)。肽 P3 绑定到2嘌呤标记的 dsRNA, 其Kd值为0.8 ±0.1 µM。370 nm 的 2-嘌呤标记 ssRNA 的荧光强度保持相对恒定, P3 浓度不同, 表明肽 P3 对 ssRNA 缺乏约束力。

含有 Q 残滓的 PNAs (P2 和 P3) 显示没有热熔转变 (图 7), 建议不绑定到 ssRNA。这是由于在沃森-克里克像 Q G 对的空间空间冲突。与未修饰的肽 P1、PNAs P4 和 P5 含有修正的 l 残留物, 但没有 Q 残基, 显示了相应的 RNA 肽复式的熔融温度下降, 由于在沃森-克里克像 l-G 对的空间位碰撞存在。紫外吸光度检测的热熔数据与 2-嘌呤荧光滴定数据一致, 这也表明含有 Q 和 L 残留物的肽基不明显地绑定到 ssRNA (图 6B, 6E, 6F)。合并 Q 基地比 L 基地更不稳定作为一个 q 基有一个更重要的空间空间冲突形成一个沃森-克里克样的 Q G 对 (图 1F) 相比, 沃森-克里克样的 l-g 对 (图 1E).

Figure 1
图 1: 稳定基三和不稳定基对结构的化学结构.(A-D)主槽 PNA·RNA2基 T·的三元组U (a), C+·G-C (B), L·G-c (c) 和 Q·C-G (D)。(E, F)不稳定的沃森-克里克喜欢肽-RNA 基对的 l-g (E) 和 Q-g (F)。字母 R 代表 RNA 的糖磷酸盐中坚。氢键由黑色虚线表示。该图从引用31中复制。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: 肽单体的化学结构.显示四肽单体 (T、C、L 和 Q)。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3: 肽寡聚物的化学结构和高效液相色谱法提纯.(A) 肽核酸序列 P3 的化学结构。(B, C)粗肽 P3 (B) 和 re-purified 肽 P3 (C) 的反相 HPLC 数据。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 4
图 4:MALDI P3 的纯化肽谱.请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 5
图 5:RNA 发夹和肽核酸序列和绑定特性的变性页。(A) RNA 发夹 (rHP1 和 rHP2), 肽 P3, 和 PNA·RNA2三重形成于肽 P3 和 rHP2 之间。(B) 非变性页 (12%) 结果为 rHP1 和 rHP2 绑定到肽 P3。孵化缓冲液为200毫米氯化钠, 0.5 毫米 EDTA, 20 毫米 HEPES, pH 7.5。装载的 RNA 发夹 (rHP1 和 rHP2) 在1µM 在20µL。在车道从左到右的肽浓度是 0, 0.2, 0.4, 1, 1.6, 2, 4, 10, 16, 20, 28, 和50µM. 肽 P3 不绑定到 rHP1 (顶部面板), 但绑定到 rHP2 (底部面板)。(C) Kd确定 P3 绑定到 rHP2。三层组成 (Y) 的分数是针对肽的浓度而绘制的。该图是从引用31改编的。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 6
图 6: 肽 P3 结合的荧光滴定研究2-嘌呤标记的 rna。在 RNA 序列中, 2-嘌呤残留物被指定为 "2"。孵化缓冲液为200毫米氯化钠, 0.5 毫米 EDTA, 20 毫米 HEPES, pH 7.5。(a) PNA·RNA2三重形成于 P3 和一个2嘌呤标记的 dsRNA (dsRNA2-2AP) 之间。(B) 在 P3 和2嘌呤标记的 ssRNA (ssRNA2-2AP) 之间形成的一种假想的肽-RNA 双工。(C, E)2-嘌呤标记的 RNA 双工 (1 µM) 和 ssRNA (1 µM) 的荧光发射谱, 分别为不同的 P3 浓度在 pH 7.5。峰值在大约 475 nm 是由于弱荧光发射的 L 基地在巴肽。(D, F)Kd基于 RNA 双工和 ssRNA 的 2-嘌呤荧光强度 (370 nm) 的地块, 分别与肽 P3 浓度的测定。该图是从引用31改编的。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 7
图 7: RNA 肽复式的热熔化结果.孵化缓冲液为200毫米氯化钠, 0.5 毫米 EDTA, 20 mm NaH2PO4, pH 7.5。所有样本包含5µM 的单 RNA (ssRNA1) 和巴肽在130µL. (a) 单绞 rna (ssRNA1)、PNAs (P1、P2、P3、P4 和 P5) 以及在 P3 和 ssRNA1 之间以平行方向形成的假想的肽-rna 双工。对像 Q g 和 l-g 对的沃森-克里克的空间位场冲突进行了说明。(B) 为不同的 PNAs 绑定到 ssRNA1 的熔融曲线。熔化的温度在熔化的转折的曲线显示。该图是从引用31改编的。

Discussion

RNA 双结合肽寡聚物 (例如, 10-市场汇率) 是中型分子, 因此可以显示电泳移动性转移后, 与 rna 具有可比或稍大的大小 (如, 50-或更小)。如果 rna 的数量明显大于肽核酸, 那么由于凝胶迁移率的变化, 肽核酸在 rna 中的滴定可能不起作用。因此, 大的 RNA 可能被截断的变性页的化验。一个大的 RNA 的滴定到一个荧光标记的巴肽允许对三重形成的监视由变性琼脂糖凝胶与样品装载在中间的胶凝体40。

对于一个恒定的总 rna 浓度的变性页的滴定实验, 我们通常使用1µM 的无标记 rna 浓度的有效后染色的自由 rna 和三重带溴溴。rna 浓度低至0.2 µM 也可能是足够的取决于 rna 构造31。未标记 RNA (0.2 µM) 的浓度决定了可以精确测量的Kd值应该是大约0.2 µM 或更大。其他染色染料可用于提高染色效率。另外, 我们未公布的数据表明, Cy3 染料标记 rna 可用于变性页实验, 以测量紧密结合事件。

由于 2-嘌呤是仅适度萤光的事实, 2-嘌呤荧光滴定也被限制到绑定的测量与Kd值接近或高于0.2 µM31。RNA 或肽核酸可以用相对鲜艳的染料标记, 通过荧光滴定来量化溶液中相对紧密的结合, 如果该结合导致荧光信号的变化53,54,55。

针对 rna 结构的 dsRNA 结合 PNAs 的策略已经测试了有限数量的 rna。具有不同序列和基对组合的 dsRNAs 的绑定属性可能会有所不同。一个人可能总是选择 TFPNAs 的设计的双相嘌呤丰富的股。了解连续 Q·三重可能会影响三倍的稳定性。显然需要更广泛的序列依赖性研究来理解 TFPNAs 的序列依赖性结合特性。

通过增加长度和/或进一步修改基和主干5657的 TFPNAs, 可以进一步增强 TFPNAs 的绑定关联性。但是, 连续的双工区域可能不经常包含超过10连续的基对, 而不受非沃森-克里克结构的干扰。一个可以共轭 TFPNAs 与小分子, 以识别非沃森-克里克结构毗邻 dsRNA 地区。原则上, 一个 TFPNA-小分子共轭有望增强结合亲和力和特异性相比, 单 TFPNA 或小分子。但是, 链接器的化学和物理属性为共轭58,59,60,61,62,63,64必须优化。

事实上, TFPNAs 可以有选择地绑定到 dsRNAs 超过 ssRNAs 和 dsDNAs 表明, 它可以发展 TFPNAs 作为非常有用的化学探针和潜在的治疗配体通过调节 RNA 结构动力学和相互作用与蛋白质和代谢物。细胞摄取 TFPNAs 可通过与细胞穿透基, 如小分子, 多肽, 和纳米颗粒, 或与超分子结构的络合物, 如脂质体5,6 进行共轭. ,12,17,25,31,4165,66。进一步功能化的 TFPNAs 与 bioimaging 标签, 如荧光和放射性同位素可能有助于检测, 成像, 并在活生物体的 RNA 结构的目标。

Disclosures

基于此处所报告的工作的专利申请 (PAT/179/14/15/PCT) 已提交。

Acknowledgments

这项工作得到了新加坡教育部 (教育部) 1 级 (RGT3/13 和 RG42/15 至 gc) 和教育部2级 (MOE2013-T2-2-024 和 MOE2015-T2-1-028 至 gc) 的支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Molecular sieves, 4A, 1-2 mm diameter pellets  Alfa Aesar 87956
4-Methylbenzhydrylamine hydrochloride (MBHAŸHCl) Sigma-Aldrich 532444
N,N-diisopropylethylamine (DIPEA) Alfa Aesar A11801
(Benzotriazol-1-yl-oxy)tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBOP) Alfa Aesar B25251
Acetic anhyride Sigma-Aldrich 320102
Kaiser Test Kit  Sigma-Aldrich 60017
Trifluoroacetic acid (TFA) Alfa Aesar L06374
Unmodified PNA monomers ASM Research Chemicals GmbH 5004007, 5004008, 5004009, 5004010
Boc-Lys(Z)-OH / Fmoc-Lys(Boc)-OH Sigma-Aldrich B8389 / 47624
Thioanisole Alfa Aesar A14846
1,2-Ethanedithiol Alfa Aesar L12865
Trifluoromethanesulfonic acid Alfa Aesar A10173
LiChrosper® 100 RP-18 endcapped (5 µm) LiChroCART® 250-4 Merck Millipore 150838
RNA Oligos  Sigma-Aldrich Customized 
α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) Sigma-Aldrich 39468
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Alfa Aesar J15694
HEPES  Lonza 17-737E
Acrylamide Sigma-Aldrich A8887
N.N'-methylenebisacrylamide Sigma-Aldrich  146072
Ammonium persulfate (APS) Bio-rad 161-0700
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Bio-rad 161-0800
10X Tris-Borate-EDTA (TBE) Buffer, pH 8.3 1st Base BUF-3010-10X1L
Glycerol  Promega  H5433
Ethidium bromide (10 mg/mL) Bio-rad  161-0433
High Precision Cell (Quartz Suprasil, 200-2500 nm) Hellma Analytics  105.250-QS

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遗传学 问题 127 肽受体 三重 rna 结构 rna 双相 rna 结合配体 固相肽合成 变性页 2-嘌呤 UV 热熔 分子识别 结合亲和性 主要沟槽
化学修饰肽核酸对单链 rna 双链 rna 的序列特异和选择性识别
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Toh, D. F. K., Patil, K. M., Chen,… More

Toh, D. F. K., Patil, K. M., Chen, G. Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids. J. Vis. Exp. (127), e56221, doi:10.3791/56221 (2017).

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