Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Volgorde-specifieke en selectieve erkenning van Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs van chemisch gewijzigd Peptide nucleïnezuren

Published: September 21, 2017 doi: 10.3791/56221
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Division of Chemistry and Biological Chemistry, School of Physical and Mathematical Sciences, Nanyang Technological University
* These authors contributed equally

Summary

We melden de protocollen voor de synthese en zuivering van Peptide Nucleic Acid (PNA) oligomeren opnemen gewijzigd residuen. De biochemische en Biofysische methoden voor de karakterisatie van de erkenning van RNA duplexen door de gewijzigde PNAs worden beschreven.

Abstract

RNAs zijn opkomst als belangrijke biomarkers en therapeutische doelen. Er is dus groot potentieel bij de ontwikkeling van chemische sondes en therapeutische liganden voor de erkenning van RNA volgorde en structuur. Chemisch gewijzigd Peptide Nucleic Acid (PNA) oligomeren onlangs hebben ontwikkeld die RNA duplexen op een reeks specifieke wijze kan worden herkend. PNAs zijn chemisch stabiel met een neutrale peptide-achtige backbone. PNAs kunnen gesynthetiseerd worden relatief gemakkelijk door de handmatige Boc-chemie solid-phase peptide synthese methode. PNAs zijn gezuiverd door omgekeerde-fase HPLC, gevolgd door de karakterisering van het molecuulgewicht van laser matrix-bijgewoonde desorptie/ionisatie-tijd van de vlucht (MALDI-TOF). Non-denaturering polyacrylamide-gel elektroforese (pagina) techniek vergemakkelijkt de beeldvorming van de triplex vorming, omdat zorgvuldig ontworpen gratis RNA dubbelzijdig construeert en PNA triplexes vaak gebonden Toon verschillende migratie tarieven. Non-denaturering pagina met ethidium bromide (en) bericht kleuring is vaak een eenvoudig en informatief techniek voor de karakterisering van de bindende affiniteiten en specifieke eigenschappen van PNA oligomeren. Meestal kunnen meerdere RNA haarspelden of duplexen met enkelvoudige basenpaar mutaties worden gebruikt om te karakteriseren PNA bindende eigenschappen, zoals de bindende affiniteiten en specifieke kenmerken. 2-Aminopurine is een isomeer van adenine (6-aminopurine); de intensiteit van de fluorescentie 2-aminopurine is gevoelig voor plaatselijke structurele omgevingswijzigingen, en is geschikt voor de monitoring van triplex vorming met het residu van de 2-aminopurine opgenomen in de buurt van de PNA bindende site. 2-Aminopurine fluorescentie titratie kan ook worden gebruikt ter bevestiging van de bindende selectiviteit van gemodificeerde PNAs naar gerichte double-stranded RNAs (dsRNAs) over single-stranded RNAs (ssRNAs). UV-absorptie-gedetecteerd thermische smeltende experimenten toestaan de meting van de thermische stabiliteit van PNA-RNA duplexen en PNA· RNA2 triplexes. Hier beschrijven we de synthese en zuivering van PNA oligomeren opnemen gewijzigd van residuen, en beschrijven van de biochemische en Biofysische methoden voor karakterisering van de erkenning van RNA duplexen door de gewijzigde PNAs.

Introduction

RNAs zijn opkomst als belangrijke biomarkers en therapeutische doelen, vanwege de recente vooruitgang in de ontdekkingen van de RNAs rollen in de verordening en katalyse van uiteenlopende biologische processen1,2,3. Van oudsher, antisense strengen hebben gebruikt om te binden aan de ssRNAs t/m Watson-Crick dubbelzijdig vorming3,4,5,6,7,8, 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27. onlangs, triplex-vormende peptide nucleïnezuren (TFPNAs) zijn ontworpen om aan dsRNAs via Hoogsteen waterstof binding (Figuur 1)3,28,29te binden. dsRNA regio's zijn aanwezig in de meerderheid van de traditionele antisense-gerichte RNAs, met inbegrip van pre-mRNAs en mRNAs, pre of pri-miRNAs3, en vele andere niet-coderende RNAs1,26,27. Gericht op dsRNAs door triple helix vorming met behulp van TFPNAs kan nuttig zijn, als gevolg van de specificiteit van haar structuur en is van groot potentieel voor gebruik bij het herstel van de normale functies van de RNAs, die dysregulated in ziekten, bijvoorbeeld zijn.

De onlangs gepubliceerde werken door Rozners et al., en ons3,28,29,30,31,32,33, 34,35,36,,37,38,39,40,41, meldde de inspanningen op het verbeteren van de selectieve binding van gemodificeerde TFPNAs naar dsRNAs met uitgebreide affiniteit. We hebben methodes van de synthese voor rationeel ontworpen PNA monomeren (Figuur 2) met inbegrip van thio-pseudoisocytosine (L) monomeer30 en31monomeer guanidine gemodificeerde 5-methyl cytosine (Q) ontwikkeld. Via verschillende biochemische en biofysische karakteriseringsmethoden, hebben wij aangetoond dat relatief korte PNAs (6-10 residuen) waarin L en Q residuen verbeterde erkenning van Watson-Crick G-C en C-G basenparen, respectievelijk, in dsRNAs tonen. Bovendien Toon in vergelijking met ongewijzigde PNAs, PNAs L en Q residuen bevatten meer selectieve binding naar dsRNA over ssRNA en dsDNA. De guanidine functionaliteit42 in de Q-base kunt PNAs HeLa cellen31invoeren.

In ons laboratorium, synthetiseren we PNAs door de handmatige Boc-chemie (Boc of t- Boc staat voor tert-butyloxycarbony (Zie Figuur 2) solid-phase peptide synthese methode4. De synthese van de PNA monomeer met Boc als de bescherming van de groep amine is handig als de Boc-groep sterically minder omvangrijk in vergelijking met fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) amine bescherming van de groep, die kan zinvol zijn tijdens PNA monomeer koppelingshelft is op de stevige steun. De Boc group is zuur-labiele en kan gemakkelijk worden verwijderd op de solide steun door trifluorazijnzuur 20-50% (TFA) in dichloormethaan (DCM) tijdens PNA synthese. Een geautomatiseerde peptide synthesizer kan worden gebruikt voor het synthetiseren van PNA oligomeren; 3-5-voudige overmaat van PNA monomeer is echter nodig voor een geautomatiseerde peptide synthesizer. Handmatige synthese vereist aanzienlijk minder PNA monomeer (2-3-voudige overschot), met elke koppeling gemakkelijk gecontroleerd door de Kaiser test43. Bovendien, vele geautomatiseerde synthesizers zijn niet compatibel met de Boc-strategie-synthese als gevolg van het gebruik van bijtende TFA tijdens de Boc verwijdering stap.

De PNA oligomeren kunnen worden gezuiverd door omgekeerde-fase krachtige vloeibare chromatografie (RP-HPLC) gevolgd door de karakterisering van het moleculair gewicht door MALDI-TOF (figuren 3 en 4)30, 31. we gebruiken niet-denaturering pagina triplex vorming volgen, te wijten aan het feit dat gratis RNA duplex construeert en PNA triplexes vaak gebonden tonen verschillende migratie tarieven (Figuur 5)30,31 . Geen etikettering nodig is als efficiënte na kleuring kan worden bereikt voor beiden het RNA dubbelzijdig en PNA· RNA2 triplex bands. Een relatief kleine hoeveelheid monster nodig is voor niet-denaturering pagina experimenten. Echter de buffers laden (incubatie) en de lopende buffers (pH 8.3) mogelijk niet hetzelfde, wat resulteert in de metingen wordt beperkt tot het kinetisch stabiele triplexes, omdat een relatief hoge pH van 8,3 kan een triplex aanzienlijk destabiliseren.

2-Aminopurine is een isomeer van adenine (6-aminopurine); de intensiteit van de fluorescentie 2-aminopurine (met een uitstoot piek op ongeveer 370 nm) is gevoelig voor plaatselijke structurele omgevingswijzigingen, en is geschikt voor de bewaking van triplex vorming met het residu gedroogd 2-aminopurine opgenomen in de buurt van de bindende site (PNA Figuur 6) 31. in tegenstelling tot vele andere kleurstoffen die fluorescentie emissie in het zichtbare bereik weergeven, 2-aminopurine-geëtiketteerden RNA kan worden blootgesteld aan licht kamer zonder foto bleken. In tegenstelling tot pagina experiment waarin een actieve buffer met pH 8.3 is vaak nodig, 2-aminopurine gebaseerd fluorescentie titratie maakt het meten van bindende in één oplossing met een pH van een opgegeven, en dus mogelijk de meet- en detectie van relatief zwak en kinetisch unstable inbinden in evenwicht.

UV-absorptie-gedetecteerd thermische smeltende experimenten toestaan de meting van de thermische stabiliteit van duplexen (Figuur 7)31 en trisamenstellingen30,32,44,45. Afhankelijk van de lengte en volgorde samenstelling, het smelten van triplexes kan of kan niet tonen een duidelijke overgang. Thermodynamische parameters kunnen worden verkregen als de warmte- en koelingsector bochten elkaar overlappen. Nauwkeurige thermodynamische parameters kunnen worden verkregen door isothermische titratie calorimetrie (ITC)32; relatief grote hoeveelheid monsters zijn echter in het algemeen vereist voor ITC.

Protocol

1. handmatige Solid-phase Peptide Synthese van PNAs met behulp van Boc chemie

Opmerking: voor het succes en het gemak van de gewenste PNA oligomeren synthese, alle oplosmiddelen en reagentia moeten watervrij. Voeg de juiste moleculaire zeven (4A, 1-2 mm diameter pellets) en af en toe het zuiveren van droge stikstofgas in flessen. Voor de synthese van gemodificeerde PNA monomeren, kunnen de gerapporteerde protocollen in de respectieve verwijzingen 30 , 31 worden gebruikt. Ongewijzigde PNA monomeren kunnen uit commerciële bronnen worden gekocht. In elk van de stappen wassen, de juiste hoeveelheid oplosmiddel wordt toegevoegd aan de hars, vormen een drijfmest, voordat het wordt afgevoerd af

  1. Laden van het eerste monomeer en de aftopping van de overtollige gratis primaire amines op de hars
    1. weegt 30 mg 4-methylbenzhydrylamine-hydrochloride (MBHA·HCl) polystyreen resin (Los verkrijgbaar; laden waarde 0,7-1.4 mmol/g; maaswijdte van 100-200), en overdracht aan een 5 mL vaste fase peptide reactievat is voorzien van een afsluiter, glazen stop.
    2. Geniet de hars in een passend bedrag van DCM voor 1 h, waardoor de hars te zwellen en bloot de amines (HCl-zout).
      Opmerking: Harsparels moeten altijd worden volledig ondergedompeld in oplosmiddelen gedurende de synthese.
    3. Afvoer uit het DCM door toepassing van een zachte stroom van droge stikstofgas over de bovenkant van de kolf. Voeg vervolgens 1 mL van 50% (v/v) N, N-diisopropylethylamine (DIPEA) in DCM en laat het gedurende 15 minuten. Dit neutraliseert het HCl-zout aangesloten op de gratis amines op het hars.
    4. Herhaal stap 1.1.3. Ondertussen, weeg 6 µmol van monomeer en 6 µmol van (benzotriazol-1-yl-oxy) tripyrrolidinophosphonium hexafluorfosfaat (PyBOP), en breng kwantitatief over in een 1,5 mL-buis. Voeg 200 µL van dimethylformamide (DMF) en 12 µmol van DIPEA. Vortex de koppeling oplossing voor 3-5 min.
      Opmerking: Gewenste laden waarde gebruikt is 0,2 mmol/g. Het eerste monomeer toegevoegd is het monomeer op de C-terminal van de gewenste PNA-reeks. De waarde van het laden van het eerste aminozuur kan worden berekend door de pikrinezuur methode 46.
    5. Afvoer uit het DIPEA van de DCM oplossing. De hars met DCM (x 3), gevolgd door de DMF (x 3), wassen en de afsluiter te sluiten. De oplossing bereid koppeling toevoegen aan het hars en schud voorzichtig. Duw de hars langs de binnenmuren van het vaartuig in de oplossing van de koppeling met het gebruik van een schone RVS spatel. Bevestig de glazen stop en veilig het schip in een shaker incubator voor 3 h bij 40 ° C.
      Opmerking: U kunt ook het reactievat houdbaar gestage bij kamertemperatuur gedurende 6-8 uur om de voltooiing van de peptide coupling reactie.
    6. Bereid de overkoepelende oplossing door het mengen van 240 µmol azijnzuur-anhydride en 360 µmol van DIPEA in 200 µL van DCM. Afvoer van de koppeling-oplossing en wassen van de hars met DMF (x 3) en DCM (x 3). Voeg in de overkoepelende oplossing en laat het schip gedurende 30 minuten, af en toe voorzichtig schudden het vaartuig. Aftopping maskeert de overtollige gratis primaire amine-groepen op de harsen door acetylation.
    7. Herhaal stap 1.1.6. Afvoer van de overkoepelende oplossing en wassen van de hars met DCM (x 3).
    8. Verwijderen van een kleine hoeveelheid harsparels met behulp van een dun capillair, en plaats ze in een 1,5 mL kleine glazen flesje. De Kaiser test 43 uitvoeren Voeg 15 µL van elk van de Kaiser testoplossingen in de glazen ampul en verwarmen met behulp van een warmte-pistool. Let op de kleur van de kralen na Verwarming. De kleur van de kralen moet ongewijzigd blijven, met vermelding van het gebrek aan vrije amine groepen op de hars.
      Opmerking: De testkit Kaiser is commercieel beschikbaar of kan worden bereid volgens de gerapporteerde protocol. Oplossing A: ninhydrine in ethanol; oplossing B: fenol in ethanol; oplossing C: kaliumcyanide (KCN) in pyridine.
      Let op: KCN is zeer giftig; juiste beschermende kleding moet gedragen worden en verwarming moet worden uitgevoerd in een goed geventileerde zuurkast, bij gebrek aan brandbare oplosmiddelen of reagentia.
    9. Herhaal stap 1.1.6 als blauwe of vage blauwe kleur wordt weergegeven door de harsparels.
  2. Verwijdering van bescherming aminegroep N-terminal
    1. de oplosmiddelen van het reactievat Drain en een oplossing van 50% (v/v) van trifluorazijnzuur (TFA) toe te voegen in DCM, ervoor te zorgen dat de harsen zijn volledig ondergedompeld. Laat het vaartuig gedurende 15 minuten, af en toe schudden om de deprotection van de amine-groepen. Herhaal 2 meer cycli.
      Let op: De TFA is zeer corrosief. Juiste beschermende kleding moet gedragen worden bij het verwerken van.
    2. Wassen de hars met DCM (x 3) DMF (x 3) en DCM (x 3). Toevoegen van een oplossing van 5% DIPEA in DCM. Laat het vaartuig gedurende 15 minuten. Deze stap activeert de gratis amines door het neutraliseren van de anionen TFA teller. Herhaal nogmaals.
    3. Spoelen van de DIPEA van de DCM-oplossing. Wassen van de hars met DCM (x 3). Het uitvoeren van de Kaiser-test (stap 1.1.8).
      Opmerking: Succesvolle deprotection van de amine groepen zal opleveren blauwe verkleuring van de kralen. Zodra deprotection succesvol is, latere koppeling van monomeren door peptide koppeling kan worden uitgevoerd.
  3. Koppeling van latere monomeren
    1. wegen 18 µmol van gewenst monomeer (voor de Boc-PNA-Q-OH monomeer, 13.2 mg monomeer wordt gewogen) en 18 µmol van PyBOP in een 1,5 mL-buis. Voeg 200 µL DMF en 36 µmol van DIPEA in de 1,5 mL-buis. Vortex totdat alle vaste stoffen zijn opgelost.
    2. Wassen de hars met DMF (x 3). Voeg de oplossing van de koppeling in het reactievat en schud voorzichtig. Duw de hars langs de binnenmuren van het vaartuig in de oplossing van de koppeling met het gebruik van een schone RVS spatel. Bevestig de glazen stop en veilig het schip in een shaker incubator voor 3 h bij 40 ° C.
    3. Afvoer uit de koppeling oplossing en wassen van de hars met DMF (x 3) en DCM (x 3). Voer stap 1.1.8. Als de kleur van de kralen onveranderd, herhaal stappen 1.2.1-1.3.3 blijft totdat de gewenste volgorde voor PNA is voltooid. Als blauwe verkleuring van de kralen wordt waargenomen na de koppeling van een monomeer, herhaalt u stappen 1.3.1-1.3.3. Als verkleuring nog steeds niet is opgelost, voert u de aftopping opnieuw (stap 1.1.6).
      Opmerking: Uitgebreide koppeling tijd (3-12 h) en/of gebruik van overtollige equivalent van het monomeer en het koppelen van de reagentia worden aanbevolen als met koppeling problemen.
    4. Zodra de gewenste volgorde voor PNA is voltooid, was de hars met DMF (x 3) en DCM (x 3). Volledig droog de hars door het toepassen van een continue stroom van droog stikstofgas gedurende 15 minuten. Deze droge hars kan worden splitsen en kan worden gebruikt om hechten van lysine of een fluorescerende tag zoals cyanine 3 (Cy3) en carboxyfluorescein in de N-terminus van de PNA.
  4. Bijlage van lysine of TL tag (Cy3 en Cy5, carboxyfluorescein) aan de N-terminus van PNA
    1. Weeg 10 mg hars, vooraf geladen met de gewenste volgorde van PNA. Pipetteer in een reactievat 5 mL. Geniet van de hars in DCM voor 1 h.
    2. Voor de bevestiging van lysine, uit te voeren stappen 1.2.1-1.3.3, ter vervanging van het monomeer met beide Boc-Lys (Z) - OH of Fmoc-Lys (Boc) - OH.
    3. Voor de bevestiging van carboxyfluorescein, uit te voeren stappen 1.2.1-1.3.3, met 10-fold overmaat van 5 (6)-carboxyfluorescein als het monomeer, en N, N '-diisopropylcarbodiimide (DIPC) en hydroxybenzotriazole (HOBt) als de koppeling reagentia in DMF. Laat de koppeling reactie 's nachts in de incubator shaker op 40 ° C.
      Opmerking: Zoals carboxyfluorescein lichtgevoelig is, moet het reactievat worden bedekt met aluminiumfolie.
    4. Uitvoeren voor de bevestiging van Cy3 of Cy5 kleurstof, etiket door de klik-chemie-methode, stappen 1.2.1-1.3.3, ter vervanging van het monomeer met N-Boc-2-propargyl-L-glycine. Dit functionalizes de N-terminus van de PNA met een alkyn-groep. De reactie van de koper-gekatalyseerde Klik als u wilt koppelen de azide-bevattende Cy3 uitvoeren of Cy5 fluorescerende kleurstof 12 , 47 , 48 , 49
  5. PNA splijten van solide ondersteuning, zuivering, en karakterisering
    Opmerking: als een aminegroep is beveiligd met de bescherming van de groep Fmoc, eerst de amine-groep door te behandelen met 20% piperdine in DMF deprotect oplossing voor 15 min (2 cycli). De hars met DMF (x 3) gevolgd door DCM (x 3) grondig te wassen. De hars volledig drogen door het toepassen van een continue stroom van droog stikstofgas gedurende 15 minuten.
    1. Transfer 5 mg droog hars in een klein flesje. Voeg 10 µL van thioanisole en 4 µL van 1,2-ethanedithiol, ervoor te zorgen dat het hars wordt ondergedompeld in de reagentia. Laat de buis bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten
      Opmerking: Deze reagentia fungeren als aaseters, die val van reactieve kationische soorten die zijn gevormd tijdens het verwijderen van de bescherming van groepen in de PNA. Passende aaseters kunnen worden gekozen op basis van de bescherming van groepen zijketen.
    2. Voeg 100 µL van TFA in de buis met de hars en de aaseters. Zachtjes vortex het mengsel en onder kort centrifugeren. Laat de buis bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten
      Let op: De TFA is zeer corrosief. Juiste beschermende kleding moet gedragen worden bij het verwerken van.
    3. Voeg voorzichtig 20 µL van trifluormethaansulfonzuur (TFMSA) aan de buis. Zachtjes doorroeren het reactiemengsel alvorens voor te leggen aan kort centrifugeren bij kamertemperatuur. Laat de buis stabiel bij kamertemperatuur voor 2 h.
      Let op: De TFMSA is zeer corrosief. Juiste beschermende kleding moet gedragen worden bij het verwerken van.
    4. Filter uit het splijten cocktail in een 5 mL Rondbodemkolf (RBF) met het gebruik van een glas Pasteur Pipet is voorzien van katoen. Gebruik een kleine hoeveelheid TFA te spoelen van het hars.
    5. Zuiveren het droge stikstofgas aan de verzamelde filtraat totdat alle vluchtige oplosmiddelen zijn verdampt. Voeg 1 mL koude diethylether in de RBF.
      Opmerking: De diethylether zal leiden tot de PNA neerslaan.
      1. Spoelen de RBF met de diethyl ether meerdere malen vóór de overbrenging van de bewolkt oplossing in een 1,5 mL-buis. Onderwerp de buis te centrifugeren om de PNA neerslag bezinken. Decanteer de oplosmiddelen en 300-500 µL van gesteriliseerde met autoclaaf water toevoegen aan het neerslag. Vortex grondig te ontbinden de PNA.
    6. Zuiveren het ruwe PNA monster via RP-HPLC met behulp van water-acetonitrile-0.1% TFA als de mobiele fase. Verzamelen van de overeenkomstige fracties, alle oplosmiddelen met behulp van een vacuüm concentrator voordat opnieuw de ontbinding van de gezuiverde PNA in gesteriliseerde met autoclaaf water verdampen.
    7. Karakteriseren de gezuiverde PNA via MALDI-TOF analyse met het gebruik van α-cyano-4-hydroxycinnamic zuur (CHCA) als de kristallisatie van de monstermatrix.
    8. Meet de extinctie van UV (260 nm) van de PNA op 65 ° C. Bereken de concentratie van de PNA met de vergelijking:
      Equation 1
      Opmerking: hier c is de concentratie, A de lezing van de extinctie verkregen, ε is de coëfficiënt van de extinctie van de opeenvolging van RNA, en l de optische weglengte van de Cuvet (1 cm). de coëfficiënt van de extinctie van de PNA-reeks is de sommatie van de coëfficiënt van uitsterven van individuele monomeren 50. De coëfficiënten uitsterven van adenine, cytosine, guanine en thymine zijn 8,8, 15,4, 7.3 en 11,7 mL/µmol·cm, respectievelijk. Het uitsterven coëfficiënt van de L en Q monomeren gebruikt wordt uitgegaan van dezelfde zijn als die van de cytosine (C) base.

2. Non-denaturering pagina

  1. voorbereiding van vereiste bufferoplossingen
    1. bereiden incubatie buffer (10 mL) met behulp van 116.88 mg NaCl (200 mM), 50 µL van 100 mM ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA) (0.5 mM), 200 µL van 1 M voorraad HEPES (20 mM), 9,75 m H 2 O; aanpassen van de buffer met pH 7.5.
    2. Voorbereiden 1 x Tris-boraat-EDTA (FSME) lopende buffer (1 L) met behulp van 100 mL 10 x Tris-boraat-EDTA op pH 8.3 en 900 mL H 2 O.
    3. Voorbereiden 10% ammoniumnitraat persulfate (APS)-oplossing (300 µL) met behulp van 30 mg ammoniumnitraat persulfate, en 300 µL H 2 O.
  2. Voorbereiding van 12% polyacrylamidegel
    1. schoon de kam goed uitmaken, gieten glasplaten en afstandhouders met ethanol; het goed zelftappende kam en spacers zijn 1 mm dik. Instellen van de vergadering van de gel en verzegelen met gel-afdichting tape.
    2. Voor een polyacrylamidegel van 22 cm x 16.5 cm x 1 mm dimensie, van gel 50 mL is voldoende. Weeg 5,7 g van acrylamide en 0,3 g van N, N '-methylenebisacrylamide (19:1) en de overdracht in een centrifuge 50 mL tube.
      Let op: Acrylamide is kankerverwekkend. Vermijd inademen van stof dampen van acrylamide en ervoor te zorgen dat de juiste beschermende kleding wordt gedragen bij het verwerken van.
    3. Los stevige verbindingen in 50 mL 1 X TBE lopende buffer door het plaatsen van de centrifugebuis in een waterbad van 50 ° C gedurende 15 minuten of totdat alle vaste verbindingen hebben opgelost. Verrichten van centrifugeren (3000 rpm, 5 min, 25 ° C) te verwijderen van alle luchtbellen binnen de oplossing. Laat de oplossing afkoelen tot kamertemperatuur.
    4. Voeg 250 µL van 10% APS-oplossing en 50 µL van tetramethylethylenediamine (TEMED) in de oplossing van de gel en meng voorzichtig met behulp van een spatel. Giet onmiddellijk de oplossing tussen de glasplaten, om ervoor te zorgen niet om eventuele luchtbellen. Plaats de kam goed vorming en laat de gel setup bij kamertemperatuur gedurende ten minste 60 minuten toe polymerisatie optreden, alvorens bij 4 ° C tot klaar voor gebruik op te slaan.
  3. Bereiding van de monsters
    1. verwijderen van de vereiste hoeveelheid RNA haarspeld (1 µM) uit de voornaamste voorraad in een schone 1,5 mL-buis. Droog de RNA-oplossing met behulp van een vacuüm concentrator.
      Opmerking: Elk monster bevat 1 µM van RNA in 20 µL incubatie buffer. 13 monsters van RNA worden meestal bereid voor één pagina experimenteren. Het RNA voor alle monsters kan samen worden voorbereid in een enkele buis.
    2. Verwijder de vereiste hoeveelheid gerichte PNA (met de uiteindelijke concentratie van maximaal 50 µM) uit de voornaamste voorraad en overdracht in aparte 1,5 mL buizen. Verdampen van het water van de PNA-oplossingen met behulp van een vacuüm concentrator.
    3. Toevoegen 260 µL van incubatie buffer in de 1,5 mL tube bevattende gedroogd RNA en meng grondig om ervoor te zorgen alle RNA dissolved. Onderwerp van het RNA als u wilt vastklikken koeling: plaats de buis in een blok van de warmte (voorverwarmd tot 95 ° C) voor 5 min. onmiddellijk breng kwantitatief over in een ijsbad en laat gedurende 10 min.
    4. Voeg toe 20 µL van RNA in elk van de 1,5 mL tubes met gedroogde PNA en meng grondig. Uitvoeren gloeien: plaats de buis met RNA en PNA mengsel in een blok van de warmte (voorverwarmd tot 65 ° C) voor 10 min. beurt uit de macht van de warmte blok en laat de monsters koel langzaam tot kamertemperatuur. Na een nacht bebroeden de monsters bij 4 ° C.
  4. Uitgevoerd en verwerking van gel
    1. verwijderen van de gel-afdichting band aan de onderzijde van de glasplaat. Monteren en beveiligen van de glasplaat op de stand van de verticale gel met kunststof klemmen.
      Opmerking: De gel uitgevoerd wordt verricht in een koelruimte bij ongeveer 4 ° C. Alle apparatuur, monsters, en buffers zijn bij 4 ° C afgekoeld voordat u de gel.
    2. Vul het onderste reservoir van de buffer met 1 x TBE lopende buffer totdat de plaat wordt ondergedompeld in ongeveer 1-2 cm van het runnen van de buffer. Vul het bovenste buffer reservoir met buffer draaien totdat het niveau van de buffer groter is dan de bovenkant van de gel door 1-2 cm. langzaam en voorzichtig verwijderen de goed zelftappende kam, waardoor de lopende buffer te vullen de putjes.
    3. Sluit de gel-stand op een stroomvoorziening. Vooraf uitvoeren de gel gedurende ten minste 30 minuten met een constante spanning van 250 V, die is geoptimaliseerd voor een 22 x 16.5 cm x 1 mm gel.
    4. Ondertussen 4 µL (20% van monstervolume) van 35% glycerol-oplossing toevoegen aan elk van de monsters en meng voorzichtig. Zodra de pre run is voltooid, laden van 20 µL van elk monster (met inbegrip van RNA alleen monster plus monsters die RNA en PNA mengsel) zorgvuldig in de bodem van het goed met behulp van een micropipet en gel laden van tips, om ervoor te zorgen niet om eventuele luchtbellen. Stel de gel bij een constante spanning van 250 V, vergelijkbaar met de pre run, voor 5 h.
    5. De voeding stoppen na 5 h en verwijderen van de glasplaat van de stand. Verwijder de resterende gel-afdichting tape en demonteren van de glasplaat. Voorzichtig verwijderen en dompel de gel in een container gevuld met 350 mL gedeïoniseerd water. Zorgvuldig Voeg 35 µL van ethidiumbromide (10 mg/mL) en plaats de container op een platform shaker (lage snelheid) voor 30 min.
      Let op: Ethidiumbromide is een mutagene stof. Juiste beschermende kleding moet gedragen worden bij het verwerken van.
    6. Beschikken over de oplossing van ethidium bromide (en) in een aangewezen afval container. Spoel de gel met 1,5-2 L van gedestilleerd water. Scan de gel met een imager (Zie Tabel van materialen) met een groene laser van 532 nm en de uitstoot filter set bij 610 nm.
  5. Gel analyse
    1. kwantificeren van de gel band intensiteiten met behulp van een gratis software, GelQuant.NET (http://www.biochemlabsolutions.com/GelQuantNET.html). Normaliseren van de band intensiteiten volgens:
      Equation 2
      Opmerking: hier ik dubbelzijdig max is de intensiteit van de band van de RNA haarspeld alleen zonder de toevoeging van PNA, en ik triplex max is de intensiteit van de triplex band met de hoogste concentratie van PNA toegevoegd.
      1. De breuk van triplex formatie volgens berekenen:
        Equation 3
    2. Plot de Fractie van de triplex vorming (Y) tegen de concentratie van PNA toegevoegd () ΜM). Passen de gegevens aan de vergelijking te verkrijgen van de dissociatieconstante (K d):
      Equation 4
      Opmerking: hier R 0 is de RNA haarspeld concentratie (1 µM). Hier zijn Y 0 en B de eerste en de maximale verandering van de triplex breuk, respectievelijk. Y is de Fractie van triplex met gevarieerde PNA concentratie. X is de totale concentratie van PNA en K d is de dissociatieconstante.

3. 2-Aminopurine fluorescentie bindende Assay

  1. bereiding van de monsters (met dsRNA)
    1. de vereiste hoeveelheid 2-aminopurine (2AP) dsRNA (1 µM voor elk label verwijderen onderdeel) uit de voornaamste voorraad in een schone 1,5 mL-buis. Verdampen van water in de RNA-oplossingen met behulp van een vacuüm concentrator.
      Opmerking: Elk monster bevat 1 µM van RNA in 75 µL incubatie buffer. Meestal worden 13 monsters van RNA bereid. RNA voor alle monsters kan samen worden voorbereid in een enkele buis.
    2. Verwijder de vereiste omvang van de gerichte PNA voor verschillende concentraties van de belangrijkste voorraad en overdracht in aparte 1,5 mL buizen. Verdampen van het water van de PNA-oplossingen met behulp van een vacuüm concentrator.
    3. Toevoegen 975 µL van incubatie buffer in de 1,5 mL tube bevattende gedroogd RNA en meng grondig om ervoor te zorgen dat alle RNA wordt ontbonden. De RNA-oplossing kort centrifugeren en onder voorbehoud het gloeien: de buis in een blok van de warmte (voorverwarmd tot 95 ° C) plaatsen voor 10 min. beurt uit de macht van de warmte blok en laat de monsters koel langzaam tot kamertemperatuur.
    4. Toevoegen 75 µL van RNA in elk van de 1,5 mL tubes met gedroogde PNA en meng grondig. Laat de monsters bij kamertemperatuur voor ten minste 1 h. Incubate de monsters bij 4 ° C's nachts.
  2. Bereiding van de monsters (met ssRNA)
    1. verwijderen van de vereiste hoeveelheid 2AP-label ssRNA (1 µM) uit de voornaamste voorraad in schone 1,5 mL buizen. Pak de vereiste hoeveelheid gerichte PNA voor verschillende concentraties van de belangrijkste voorraad en overdracht in de respectieve 1,5 mL-buizen die de ssRNA bevatten. Drogen van het mengsel van het RNA en PNA met behulp van een vacuüm concentrator.
    2. Toevoegen 75 µL van incubatie buffer in elk van de buizen 1,5 mL en meng. Het mengsel onverminderd gloeien: de buis in een blok van de warmte (voorverwarmd tot 95 ° C) plaatsen voor 10 min. beurt uit de kracht en laat de monsters langzaam tot kamertemperatuur afkoelen. Na een nacht bebroeden de monsters bij 4 ° C.
  3. Meting en analyse
    1. een fluorescentie spectrofotometer gebruiken voor het meten van de uitstoot over een golflengtebereik van 330-550 nm. Gebruik een golflengte van de excitatie van 303 nm.
      Opmerking: De monsters bij kamertemperatuur worden gemeten en elk monster gemeten 3 keer, waarbij het gemiddelde wordt genomen.
    2. Transfer 70 µL van incubatie buffer in de vierkante cuvette van 1 cm. Start de meting.
    3. Verwijder de buffer van de Cuvet. Spoel de Cuvet met gedestilleerd water en purge stikstofgas om te drogen. Herhaal voor alle monsters. Aftrekken van de metingen van de buffer van alle monsters.
    4. Plot de intensiteit van de fluorescentie (a.u.) tegen golflengte (nm). Opnemen van de intensiteit van de fluorescentie op 370 nm voor alle monsters. Uitzetten van de intensiteit van de fluorescentie op 370 nm (a.u.) tegen de overeenkomstige concentraties van de PNA toegevoegd (µM).
    5. Grootte van de gegevens voor de vergelijking van stap 2.5.2 te verkrijgen van de dissociatieconstante (K d): Y = Y 0 + (B / (2R 0)) (R 0 + X + K d-((R 0 + X + K d) 2 -4R 0 X) 1/2), waarbij R 0 de 2AP-geëtiketteerden dsRNA concentratie (1 µM).
      Opmerking: Hier Y 0 en B zijn de begingrootte en maximale verandering van de intensiteit van de fluorescentie op 370 nm, respectievelijk. Y is de intensiteit van de fluorescentie op 370 nm bij gevarieerde PNA concentratie. X is de totale concentratie van PNA en K d is de dissociatieconstante.

4. UV-absorptie-gedetecteerd thermische smelten experimenten

  1. bereiding van de monsters
    Opmerking: meten van de absorptie van UV (260 nm) van het RNA bij 95 ° C (om ervoor te zorgen de secondaire structuren van RNA worden verstoord). Bereken de concentratie van het RNA met de vergelijking:
    Equation 5
    ​ waar c is de concentratie, A is de lezing van de extinctie verkregen, ε is de coëfficiënt uitsterven van de opeenvolging van RNA, en l is de optische weglengte van de Cuvet (1 cm). De coëfficiënt van de extinctie van de RNA is berekend op basis van een model van de dichtstbijzijnde-buurman met behulp van MeltWin 51 , 52. Het programmapakket kan op verzoek worden verstrekt.
    1. Verwijderen de vereiste hoeveelheid ssRNA (5 µM) uit de voornaamste voorraad in schone 1,5 mL tubes. Verwijderen van de vereiste hoeveelheid gerichte PNA (5 µM) van de belangrijkste voorraad en overdracht in de respectieve 1,5 mL-buizen die de ssRNA bevatten. Drogen van het mengsel van het RNA en PNA met behulp van een vacuüm concentrator.
    2. Toevoegen 130 µL van incubatie buffer in elk van de buizen 1,5 mL en meng. Het mengsel onverminderd gloeien: de buis in een blok van de warmte (voorverwarmd tot 95 ° C) plaatsen voor 10 min. beurt uit de kracht en laat de monsters langzaam tot kamertemperatuur afkoelen. Na een nacht bebroeden de monsters bij 4 ° C.
  2. Meting en analyse
    1. een UV-Vis spectrofotometer gebruiken voor het meten van de absorptie bij 260 nm in een cuvet van 8-microcell met een weglengte van 1 cm. meten de monsters ' verticaal absorptie te verhogen van de temperatuur van 15 tot 95 ° C, gevolgd door het verlagen van de temperatuur van 95 tot 15 ° C bij een oprit tarief van 0,5 ° C/min.
    2. Transfer 130 µL van monster af in elk van de put, ervoor te zorgen dat een goed de incubatie buffer bevat. Start de meting. Herhaal zonodig.
    3. De extinctie waarden normaliseren met de hoge temperatuurmetingen genormaliseerd naar eenheid en uitzetten van de genormaliseerde extinctie lezen tegen temperatuur (° C). Het plot van de eerste afgeleide van de curven. Verkrijgen van de smeltende temperaturen door het aanbrengen van de eerste afgeleide bochten naar een Gauss functie.

Representative Results

Omgekeerde-fase HPLC staat de zuivering van PNA oligomeren. We kunnen het verkrijgen van zuivere PNA oligomeren met twee rondes van HPLC zuivering (Figuur 3). De identiteit van de PNAs kan worden bevestigd door de analyse van de MALDI-TOF (Figuur 4).

Non-denaturering pagina is een eenvoudige en informatieve techniek voor de karakterisering van de bindende affiniteiten en specifieke eigenschappen van PNA oligomeren. Wij gebruiken meestal meerdere RNA haarspelden of duplexen met enkelvoudige basenpaar mutaties om karakteriseren bindende eigenschappen (Figuur 5). De niet-denaturering paginagegevens afgebeeld in Figuur 5 duidelijk blijkt dat de Q en L-gemodificeerde PNA een dsRNA-regio met een C-G paar (Figuur 5B, onderste paneel herkent) maar niet zonder een paar van de C-G (Figuur 5B, top deelvenster). Deze specifieke en verbeterde erkenning is door middel van de T· A-U, L· G-C en Q· C-G PNA· De vorming van RNA2 basis triple (Figuur 1A, C, D). Verschillende PNAs met enkelvoudige of meervoudige mutaties kunnen ook worden gebruikt om aan te tonen van de verbeterde bindende eigenschappen van een gemodificeerde PNA. We hebben aangetoond dat het toevoegen van 2 mM Mg2 + in het incubatie-buffer heeft geen invloed op de binding aanzienlijk31.

We hebben aangetoond door 2-aminopurine fluorescentie titratie die een Q en L-gemodificeerde PNA aan een gerichte dsRNA regio (Figuur 6A, 6 C, 6 D) maar niet ssRNA (Figuur 6B, 6E, 6F bindt). PNA P3 bindt aan de 2-aminopurine-geëtiketteerden dsRNA met een K-d -waarde van 0,8 ± 0.1 µM. De intensiteit van de fluorescentie op 370 nm voor de ssRNA 2-aminopurine-label blijft relatief constant met gevarieerde P3 concentratie, die aangeeft het gebrek aan binding van PNA P3 aan de ssRNA.

PNAs met Q residuen (P2 en P3) Toon geen thermische smelten overgangen (Figuur 7), suggereren geen binding met de ssRNA. Dit is te wijten aan de sterische botsing aanwezig in Watson-Crick, zoals Q-G paar. Vergeleken met ongewijzigde PNA P1, PNAs P4 en P5 met gemodificeerde L residuen maar geen Q-residuen, Toon daalde smeltende temperaturen voor de overeenkomstige RNA-PNA duplexen als gevolg van de sterische botsing aanwezig in Watson-Crick, zoals L-G paar. De UV-absorptie-gedetecteerd thermische smeltende gegevens in overeenstemming zijn met de 2-aminopurine fluorescentie titratie gegevens, waaruit ook blijkt dat een PNA Q en L residuen bevatten niet aan de ssRNA aanzienlijk bindt (Figuur 6B, 6E, 6F). Opnemen van een Q-base is meer destabiliserende dan de boekwaarde van een L, zoals een Q-base een belangrijkere sterische botsing in de vorming van een paar met Watson-Crick-achtige Q-G (Figuur 1F is) vergeleken met een paar Watson-Crick-achtige L-G (Figuur 1E ).

Figure 1
Figuur 1 : Chemische structuren van stabiele basis triple en onstabiele basenpaar structuren. (A-D) Majoor-groef PNA· RNA2 basis triples van T· A-U (A), C+· G-C (B), L· G-C (C), en Q· C-G (D). (E, F) Unstable Watson-Crick zoals PNA-RNA basenparen van L-G (E) en Q-G (F). De letter R vertegenwoordigt de suiker-fosfaat ruggegraat van RNA. Waterstofbruggen worden aangegeven door zwarte onderbroken lijnen. De afbeelding is gereproduceerd verwijzing €31. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2 : Chemische structuren van PNA monomeren. Vier PNA monomeren (T, C, L en Q) worden weergegeven. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3 : Chemische structuur van een PNA oligomeren en zuivering door RP-HPLC. (A) chemische structuur van de PNA reeks P3. (B, C) RP-HPLC-gegevens van ruwe PNA P3 (B) en opnieuw gezuiverd PNA P3 (C). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4 : MALDI-TOF spectrum van gezuiverde PNA P3. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5 : RNA haarspeld en PNA sequenties en bindende karakterisering door niet-denaturering pagina. (A) RNA haarspelden (rHP1 en rHP2), PNA P3, en een PNA· RNA2 triplex gevormd tussen PNA P3 en rHP2. (B) niet-denaturering pagina (12%) resultaten voor rHP1 en rHP2 binding aan PNA P3. De incubatie-buffer is 200 mM NaCl, 0.5 mM EDTA, 20 mM HEPES, pH 7.5. De geladen RNA haarspelden (rHP1 en rHP2) zijn op 1 µM in 20 µL. De concentraties van de PNA in banen van links naar rechts zijn 0, 0.2, 0.4, 1, 1.6, 2, 4, 10, 16, 20, 28, en 50 µM. PNA P3 bindt niet aan rHP1 (bovenzijde) maar bindt aan rHP2 (onderste paneel). (C) Kd bepaling over P3 binding aan rHP2. De Fractie van triplex vorming (Y) was uitgezet tegen de concentratie van PNA. De figuur wordt aangepast van referentie31. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 6
Figuur 6 : Fluorescentie titratie studie van PNA P3 bindendetot 2-aminopurine-geëtiketteerden RNAs. Het 2-aminopurine-residu is aangewezen als '2' in de opeenvolging van RNA. De incubatie-buffer is 200 mM NaCl, 0.5 mM EDTA, 20 mM HEPES, pH 7.5. (A) een PNA· RNA2 triplex gevormd tussen P3 en een 2-aminopurine-geëtiketteerden dsRNA (dsRNA2-2AP). (B) een hypothetische PNA-RNA duplex gevormd tussen P3 en een ssRNA van 2-aminopurine-label (ssRNA2-2AP). (C, E) Fluorescentie emissie spectra voor de 2-aminopurine-geëtiketteerden RNA dubbelzijdig (1 µM) en ssRNA (1 µM), respectievelijk met gevarieerd P3 concentratie bij pH 7.5. De piek op ongeveer 475 nm is te wijten aan de zwakke fluorescentie-emissie van de L-basis in de PNA. (D, F) K d bepaling op basis van de percelen van 2-aminopurine fluorescentie intensiteit (op 370 nm) van het RNA duplex- en ssRNA, respectievelijk versus PNA P3 concentratie. De figuur wordt aangepast van referentie31. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 7
Figuur 7 : Thermische smelten resultaten voor RNA-PNA duplexen. De incubatie-buffer is 200 mM NaCl, 0.5 mM EDTA, 20 mM NaH2PO4, pH 7.5. Alle monsters bevatten 5 µM van PNA in 130 µL. (A) Single-stranded RNA (ssRNA1), PNAs (P1, P2, P3, P4 en P5) single-stranded RNA (ssRNA1) en een hypothetische PNA-RNA duplex gevormd tussen PNA P3 en ssRNA1 in een parallelle oriëntatie. De sterische botsing is geïndiceerd voor de Watson-Crick zoals Q-G en L-G paren. (B) Melting buigt voor verschillende PNAs binden aan ssRNA1. De smeltende temperaturen worden weergegeven voor de krommen met het smelten van overgangen. De figuur wordt aangepast van referentie31.

Discussion

RNA duplex-bindende PNA oligomeren (bijv., 10-mers) zijn kleine en middelgrote moleculen en dus kan laten zien elektroforetische mobiliteit verschuiving op bindende aan RNAs met een vergelijkbaar of lichtjes grotere grootte (b.v., 50-mer of kleiner). Als een RNA aanzienlijk groter dan de PNA is, kan titratie van PNA in RNA niet werken als gevolg van een verschuiving van de mobiliteit beperkt gel. Zo kan de grote RNA voor de niet-denaturering pagina testen worden afgekapt. Titratie van een grote RNA in een fluorophore-geëtiketteerden PNA zorgt voor de monitoring van de triplex vorming door een niet-denaturering agarose gel met het monster dat is geladen in het midden van de gel-40.

Voor een titratie experiment door niet-denaturering pagina met een constante totale concentratie van RNA gebruiken we meestal een labelloze RNA concentratie 1 µm voor efficiënte post kleuring van de gratis RNA en triplex bands door ethidiumbromide. Een RNA concentratie zo laag als 0,2 µM volstaan ook afhankelijk van de RNA construct31. De concentratie van de labelloze RNA (0,2 µM) bepaalt dat de Kd waarden die nauwkeurig kunnen worden gemeten over 0,2 µM of groter moeten zijn. Andere kleuring kleurstoffen kunnen worden gebruikt om de kleuring efficiëntie te vergroten. U kunt ook suggereren onze niet-gepubliceerde gegevens dat Cy3 kleurstof-geëtiketteerden RNAs in niet-denaturering pagina experimenten kunnen worden gebruikt voor het meten van de strakke bindende gebeurtenissen.

Wijten aan het feit dat de 2-aminopurine is slechts matig TL, is 2-aminopurine fluorescentie titratie ook beperkt tot het meten van de binding met Kd waarden dicht bij of boven 0,2 µM31. Het RNA of de PNA kan worden aangeduid met een relatief lichte kleurstof voor het kwantificeren van een vrij krap bindend in oplossing door middel van fluorescentie titratie, als de binding in veranderingen in de fluorescentie signalen53,54, resulteert 55.

De strategie van gerichte RNA structuren door dsRNA-bindende PNAs is getest voor een beperkt aantal RNAs. Het is waarschijnlijk dat bindende eigenschappen voor dsRNAs met verschillende reeksen en basenpaar composities variëren kan. Men kan altijd kiezen voor de purine-rijke onderdeel van een duplex voor het ontwerp van TFPNAs. Het is van cruciaal belang om te begrijpen hoe opeenvolgende Q· C-G triples invloed kunnen zijn op de stabiliteit van een triplex. Meer uitgebreide reeks-afhankelijke studies zijn duidelijk nodig om te begrijpen van de reeks-afhankelijke bindende eigenschappen van TFPNAs.

De bindende affiniteit van TFPNAs kan verder worden verbeterd door verhoging van de lengte en/of verdere wijziging van de grondslagen en backbones56,,57 van TFPNAs. Echter kan een continu dubbelzijdig regio niet vaak bestaan uit meer dan 10 opeenvolgende basenparen zonder de verstoring door niet-Watson-Crick structuren. Een kan TFPNAs conjugaat met kleine molecules voor de erkenning van niet-Watson-Crick structuren aan dsRNA regio's grenzen. In principe een TFPNA-kleine molecule conjugaat verwachting bindende affiniteit en specificiteit ten opzichte van een TFPNA of een klein molecuul alleen hebben verbeterd. Echter, de chemische en fysische eigenschappen van de linker voor de vervoeging58,59,60,,61,62,,63,64 moet worden geoptimaliseerd.

Het feit dat TFPNAs selectief aan dsRNAs over ssRNAs en dsDNAs binden kunt vermoeden dat het mogelijk is te ontwikkelen TFPNAs als zeer nuttig chemische sondes en potentiële therapeutische liganden door middel van de verordening van RNA structurele dynamica en interacties met eiwitten en metabolieten. Cellulaire opname van TFPNAs kan worden vergemakkelijkt door de vervoeging met cel-penetrating wordt zoals kleine molecules, peptiden, en nanodeeltjes of complexvorming met supramoleculaire structuren zoals liposomen5,6 ,12,17,25,31,41,65,66. Verder kan functionalization van TFPNAs met bioimaging codes zoals fluorophores en radio-isotopen vergemakkelijken de detectie, imaging, en doelgerichtheid van functionele structuren van het RNA in levende organismen.

Disclosures

Een octrooiaanvraag (PAT/179/14/15/pct's) gebaseerd op het werk hier gemeld is ingediend.

Acknowledgments

Dit werk werd gesteund door de Singapore ministerie van onderwijs (MOE) Tier 1 (RGT3/13 en RG42/15 tot G.C.) en MOE fase 2 (MOE2013-T2-2-024 en MOE2015-T2-1-028 aan G.C.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Molecular sieves, 4A, 1-2 mm diameter pellets  Alfa Aesar 87956
4-Methylbenzhydrylamine hydrochloride (MBHAŸHCl) Sigma-Aldrich 532444
N,N-diisopropylethylamine (DIPEA) Alfa Aesar A11801
(Benzotriazol-1-yl-oxy)tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBOP) Alfa Aesar B25251
Acetic anhyride Sigma-Aldrich 320102
Kaiser Test Kit  Sigma-Aldrich 60017
Trifluoroacetic acid (TFA) Alfa Aesar L06374
Unmodified PNA monomers ASM Research Chemicals GmbH 5004007, 5004008, 5004009, 5004010
Boc-Lys(Z)-OH / Fmoc-Lys(Boc)-OH Sigma-Aldrich B8389 / 47624
Thioanisole Alfa Aesar A14846
1,2-Ethanedithiol Alfa Aesar L12865
Trifluoromethanesulfonic acid Alfa Aesar A10173
LiChrosper® 100 RP-18 endcapped (5 µm) LiChroCART® 250-4 Merck Millipore 150838
RNA Oligos  Sigma-Aldrich Customized 
α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) Sigma-Aldrich 39468
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Alfa Aesar J15694
HEPES  Lonza 17-737E
Acrylamide Sigma-Aldrich A8887
N.N'-methylenebisacrylamide Sigma-Aldrich  146072
Ammonium persulfate (APS) Bio-rad 161-0700
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Bio-rad 161-0800
10X Tris-Borate-EDTA (TBE) Buffer, pH 8.3 1st Base BUF-3010-10X1L
Glycerol  Promega  H5433
Ethidium bromide (10 mg/mL) Bio-rad  161-0433
High Precision Cell (Quartz Suprasil, 200-2500 nm) Hellma Analytics  105.250-QS

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cech, T. R., Steitz, J. A. The noncoding RNA revolution-trashing old rules to forge new ones. Cell. 157 (1), 77-94 (2014).
  2. Velagapudi, S. P., Gallo, S. M., Disney, M. D. Sequence-based design of bioactive small molecules that target precursor microRNAs. Nat Chem Biol. 10, 291-297 (2014).
  3. Patil, K. M., Chen, G. Modified Nucleic Acids in Biology and Medicine. Jurga, S., Erdmann, V. A., Barciszewski, J. , Springer International Publishing. 299-317 (2016).
  4. Hyrup, B., Nielsen, P. E. Peptide nucleic acids (PNA): synthesis, properties and potential applications. Bioorg Med Chem. 4 (1), 5-23 (1996).
  5. Shiraishi, T., Nielsen, P. E. Improved cellular uptake of antisense peptide nucleic acids by conjugation to a cell-penetrating peptide and a lipid domain. Methods Mol Biol. 751, 209-221 (2011).
  6. Shiraishi, T., Nielsen, P. E. Nanomolar cellular antisense activity of peptide nucleic acid (PNA) cholic acid ("umbrella") and cholesterol conjugates delivered by cationic lipids. Bioconjugate Chem. 23 (2), 196-202 (2012).
  7. Khoo, B., Roca, X., Chew, S. L., Krainer, A. R. Antisense oligonucleotide-induced alternative splicing of the APOB mRNA generates a novel isoform of APOB. BMC Mol Biol. 8, 3 (2007).
  8. Stein, C. A., et al. Efficient gene silencing by delivery of locked nucleic acid antisense oligonucleotides, unassisted by transfection reagents. Nucleic Acids Res. 38 (1), 3 (2010).
  9. Kole, R., Krainer, A. R., Altman, S. RNA therapeutics: beyond RNA interference and antisense oligonucleotides. Nat Rev Drug Discov. 11 (2), 125-140 (2012).
  10. Peacey, E., Rodriguez, L., Liu, Y., Wolfe, M. S. Targeting a pre-mRNA structure with bipartite antisense molecules modulates tau alternative splicing. Nucleic Acids Res. 40 (19), 9836-9849 (2012).
  11. Stenvang, J., Petri, A., Lindow, M., Obad, S., Kauppinen, S. Inhibition of microRNA function by antimiR oligonucleotides. Silence. 3 (1), 1 (2012).
  12. Ma, X., et al. Intracellular delivery of antisense peptide nucleic acid by fluorescent mesoporous silica nanoparticles. Bioconjugate Chem. 25 (8), 1412-1420 (2014).
  13. Wojtkowiak-Szlachcic, A., et al. Short antisense-locked nucleic acids (all-LNAs) correct alternative splicing abnormalities in myotonic dystrophy. Nucleic Acids Res. 43 (6), 3318-3331 (2015).
  14. Lenartowicz, E., et al. Antisense Oligonucleotides Targeting Influenza A Segment 8 Genomic RNA Inhibit Viral Replication. Nucleic Acid Ther. 26 (5), 277-285 (2016).
  15. Avitabile, C., et al. Targeting pre-miRNA by peptide nucleic acids: a new strategy to interfere in the miRNA maturation. Artif DNA PNA XNA. 3 (2), 88-96 (2012).
  16. Barczak, A. K., et al. RNA signatures allow rapid identification of pathogens and antibiotic susceptibilities. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (16), 6217-6222 (2012).
  17. Das, I., et al. A peptide nucleic acid-aminosugar conjugate targeting transactivation response element of HIV-1 RNA genome shows a high bioavailability in human cells and strongly inhibits tat-mediated transactivation of HIV-1 transcription. J Med Chem. 55 (13), 6021-6032 (2012).
  18. Fabani, M. M., et al. Efficient inhibition of miR-155 function in vivo by peptide nucleic acids. Nucleic Acids Res. 38 (13), 4466-4475 (2010).
  19. Riguet, E., et al. A peptide nucleic acid-neamine conjugate that targets and cleaves HIV-1 TAR RNA inhibits viral replication. J Med Chem. 47 (20), 4806-4809 (2004).
  20. Torres, A. G., et al. Chemical structure requirements and cellular targeting of microRNA-122 by peptide nucleic acids anti-miRs. Nucleic Acids Res. 40 (5), 2152-2167 (2012).
  21. Upadhyay, A., Dixit, U., Manvar, D., Chaturvedi, N., Pandey, V. N. Affinity capture and identification of host cell factors associated with hepatitis C virus (+) strand subgenomic RNA. Mol Cell Proteomics. 12 (6), 1539-1552 (2013).
  22. Wesolowski, D., et al. Basic peptide-morpholino oligomer conjugate that is very effective in killing bacteria by gene-specific and nonspecific modes. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (40), 16582-16587 (2011).
  23. Armitage, B. A. The impact of nucleic acid secondary structure on PNA hybridization. Drug Discov Today. 8 (5), 222-228 (2003).
  24. Thomas, S. M., et al. Antitumor effects of EGFR antisense guanidine-based peptide nucleic acids in cancer models. ACS Chem Biol. 8 (2), 345-352 (2013).
  25. Bahal, R., McNeer, N. A., Ly, D. H., Saltzman, W. M., Glazer, P. M. Nanoparticle for delivery of antisense gammaPNA oligomers targeting CCR5. Artif DNA PNA XNA. 4 (2), 49-57 (2013).
  26. Adams, B. D., Parsons, C., Walker, L., Zhang, W. C., Slack, F. J. Targeting noncoding RNAs in disease. J. Clin. Invest. 127 (3), 761-771 (2017).
  27. Matsui, M., Corey, D. R. Non-coding RNAs as drug targets. Nat Rev Drug Discov. 16 (3), 167-179 (2017).
  28. Devi, G., Zhou, Y., Zhong, Z., Toh, D. -F. K., Chen, G. RNA triplexes: from structural principles to biological and biotech applications. Wiley Interdiscip Rev RNA. 6 (1), 111-128 (2015).
  29. Rozners, E. Recent Advances in Chemical Modification of Peptide Nucleic Acids. J Nucleic Acids. 2012, 8 (2012).
  30. Devi, G., Yuan, Z., Lu, Y., Zhao, Y., Chen, G. Incorporation of thio-pseudoisocytosine into triplex-forming peptide nucleic acids for enhanced recognition of RNA duplexes. Nucleic Acids Res. 42 (6), 4008-4018 (2014).
  31. Toh, D. K., et al. Incorporating a guanidine-modified cytosine base into triplex-forming PNAs for the recognition of a C-G pyrimidine-purine inversion site of an RNA duplex. Nucleic Acids Res. 44 (19), 9071-9082 (2016).
  32. Li, M., Zengeya, T., Rozners, E. Short peptide nucleic acids bind strongly to homopurine tract of double helical RNA at pH 5.5. J Am Chem Soc. 132 (25), 8676-8681 (2010).
  33. Gupta, P., Zengeya, T., Rozners, E. Triple helical recognition of pyrimidine inversions in polypurine tracts of RNA by nucleobase-modified PNA. Chem Commun. 47 (39), 11125-11127 (2011).
  34. Zengeya, T., Li, M., Rozners, E. PNA containing isocytidine nucleobase: synthesis and recognition of double helical RNA. Bioorg Med Chem Lett. 21 (7), 2121-2124 (2011).
  35. Gupta, P., Muse, O., Rozners, E. Recognition of double-stranded RNA by guanidine-modified peptide nucleic acids. Biochemistry. 51 (1), 63-73 (2012).
  36. Zengeya, T., Gupta, P., Rozners, E. Triple-helical recognition of RNA using 2-aminopyridine-modified PNA at physiologically relevant conditions. Angew Chem Int Ed. 51 (50), 12593-12596 (2012).
  37. Muse, O., et al. Sequence selective recognition of double-stranded RNA at physiologically relevant conditions using PNA-peptide conjugates. ACS Chem Biol. 8 (8), 1683-1686 (2013).
  38. Hnedzko, D., Cheruiyot, S. K., Rozners, E. Using Triple Helix Forming Peptide Nucleic Acids for Sequence-selective Recognition of Double-stranded RNA. Curr Protoc Nucleic Acid Chem. 58, 61-64 (2014).
  39. Zengeya, T., Gupta, P., Rozners, E. Sequence selective recognition of double-stranded RNA using triple helix-forming peptide nucleic acids. Methods Mol Biol. 1050, 83-94 (2014).
  40. Endoh, T., Hnedzko, D., Rozners, E., Sugimoto, N. Nucleobase-Modified PNA Suppresses Translation by Forming a Triple Helix with a Hairpin Structure in mRNA In Vitro and in Cells. Angew Chem Int Ed. 55 (3), 899-903 (2016).
  41. Hnedzko, D., McGee, D. W., Karamitas, Y. A., Rozners, E. Sequence-selective recognition of double-stranded RNA and enhanced cellular uptake of cationic nucleobase and backbone-modified peptide nucleic acids. RNA. 23 (1), 58-69 (2017).
  42. Wexselblatt, E., Esko, J. D., Tor, Y. On guanidinium and cellular uptake. J Org Chem. 79 (15), 6766-6774 (2014).
  43. Kaiser, E., Colescott, R. L., Bossinger, C. D., Cook, P. I. Color test for detection of free terminal amino groups in the solid-phase synthesis of peptides. Anal. Biochem. 34 (2), 595-598 (1970).
  44. Roberts, R. W., Crothers, D. M. Stability and properties of double and triple helices: dramatic effects of RNA or DNA backbone composition. Science. 258 (5087), 1463-1466 (1992).
  45. Zhou, Y., et al. Recognition of RNA duplexes by chemically modified triplex-forming oligonucleotides. Nucleic Acids Res. 41 (13), 6664-6673 (2013).
  46. Gisin, B. F. The monitoring of reactions in solid-phase peptide synthesis with picric acid. Anal. Chim. Acta. 58 (1), 248-249 (1972).
  47. Gogoi, K., Mane, M. V., Kunte, S. S., Kumar, V. A. A versatile method for the preparation of conjugates of peptides with DNA/PNA/analog by employing chemo-selective click reaction in water. Nucleic Acids Res. 35 (21), 139 (2007).
  48. Shabanpoor, F., Gait, M. J. Development of a general methodology for labelling peptide-morpholino oligonucleotide conjugates using alkyne-azide click chemistry. Chem Commun. 49 (87), 10260-10262 (2013).
  49. Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. A Stepwise Huisgen Cycloaddition Process: Copper(I)-Catalyzed Regioselective "Ligation" of Azides and Terminal Alkynes. Angew Chem Int Ed. 41 (14), 2596-2599 (2002).
  50. Haaima, G., Hansen, F. H., Christensen, L., Dahl, O., Nielsen, P. E. Increased DNA binding and sequence discrimination of PNA oligomers containing 2,6-diaminopurine. Nucleic Acids Res. 25 (22), 4639-4643 (1997).
  51. Schroeder, S. J., Turner, D. H. Methods Enzymol. 468, Academic Press. 371-387 (2009).
  52. McDowell, J. A., Turner, D. H. Investigation of the Structural Basis for Thermodynamic Stabilities of Tandem GU Mismatches: Solution Structure of (rGAGGUCUC)2 by Two-Dimensional NMR and Simulated Annealing. Biochemistry. 35 (45), 14077-14089 (1996).
  53. Sato, T., Sato, Y., Nishizawa, S. Triplex-Forming Peptide Nucleic Acid Probe Having Thiazole Orange as a Base Surrogate for Fluorescence Sensing of Double-stranded RNA. J Am Chem Soc. 138 (30), 9397-9400 (2016).
  54. Cheruiyot, S. K., Rozners, E. Fluorescent 2-Aminopyridine Nucleobases for Triplex-Forming Peptide Nucleic Acids. ChemBioChem. 17 (16), 1558-1562 (2016).
  55. Sato, T., Sato, Y., Nishizawa, S. Optimization of the Alkyl Linker of TO Base Surrogate in Triplex-Forming PNA for Enhanced Binding to Double-Stranded RNA. Chem Eur J. 23 (17), 4079-4088 (2017).
  56. Virta, P. M., Tahtinen, V., Granqvist, L., Murtola, M., Stromberg, R. 19F NMR spectroscopic analysis of the binding modes in triple helical PNA/microRNA-complexes. Chem Eur J. , (2017).
  57. Zengeya, T., Gindin, A., Rozners, E. Improvement of sequence selectivity in triple helical recognition of RNA by phenylalanine-derived PNA. Artif DNA PNA XNA. 4 (3), 69-76 (2013).
  58. Moses, A. C., Huang, S. W., Schepartz, A. Inhibition of Rev.RRE complexation by triplex tethered oligonucleotide probes. Bioorg Med Chem. 5 (6), 1123-1129 (1997).
  59. Ben Gaied, N., Zhao, Z., Gerrard, S. R., Fox, K. R., Brown, T. Potent triple helix stabilization by 5',3'-modified triplex-forming oligonucleotides. ChemBioChem. 10 (11), 1839-1851 (2009).
  60. Grimm, G. N., Boutorine, A. S., Lincoln, P., Norden, B., Helene, C. Formation of DNA triple helices by an oligonucleotide conjugated to a fluorescent ruthenium complex. ChemBioChem. 3 (4), 324-331 (2002).
  61. Tran, T., et al. Targeting the r(CGG) Repeats That Cause FXTAS with Modularly Assembled Small Molecules and Oligonucleotides. ACS Chem Biol. , (2014).
  62. Gianolio, D. A., Segismundo, J. M., McLaughlin, L. W. Tethered naphthalene diimide-based intercalators for DNA triplex stabilization. Nucleic Acids Res. 28 (10), 2128-2134 (2000).
  63. Rumney, S., Kool, E. T. Structural Optimization of Non-Nucleotide Loop Replacements for Duplex and Triplex DNAs. J Am Chem Soc. 117, 5635-5646 (1995).
  64. Stafford, R. L., Dervan, P. B. The reach of linear protein-DNA dimerizers. J Am Chem Soc. 129 (45), 14026-14033 (2007).
  65. Gupta, A., Bahal, R., Gupta, M., Glazer, P. M., Saltzman, W. M. Nanotechnology for delivery of peptide nucleic acids (PNAs). J Control Release. 240, 302-311 (2016).
  66. Avitabile, C., et al. Incorporation of Naked Peptide Nucleic Acids into Liposomes Leads to Fast and Efficient Delivery. Bioconjugate Chem. 26 (8), 1533-1541 (2015).

Tags

Genetica kwestie 127 PNA triplex RNA structuur RNA duplex RNA-bindende liganden solid-phase peptide synthese niet-denaturering pagina 2-Aminopurine UV thermische smelten moleculaire erkenning bindende affiniteit grote groef
Volgorde-specifieke en selectieve erkenning van Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs van chemisch gewijzigd Peptide nucleïnezuren
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Toh, D. F. K., Patil, K. M., Chen,… More

Toh, D. F. K., Patil, K. M., Chen, G. Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids. J. Vis. Exp. (127), e56221, doi:10.3791/56221 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter