Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Sekvens-specifikke og selektiv anerkendelse af dobbelt-strenget RNA'er over enkeltstrenget RNA'er af kemisk modificerede peptid nukleinsyrer

Published: September 21, 2017 doi: 10.3791/56221
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Division of Chemistry and Biological Chemistry, School of Physical and Mathematical Sciences, Nanyang Technological University
* These authors contributed equally

Summary

Vi rapporterer protokoller til syntese og rensning af peptid nukleinsyre (PNA) oligomerer indarbejde ændrede restkoncentrationer. De biokemiske og biofysiske metoder til karakterisering af anerkendelse af RNA dobbelthuse af de modificerede PNAs er beskrevet.

Abstract

RNA'er fremvækst som vigtige biomarkører og terapeutiske mål. Der er således stort potentiale i at udvikle kemiske sonder og terapeutiske ligander til anerkendelse af RNA-sekvens og struktur. Kemisk modificerede peptid nukleinsyre (PNA) oligomerer har udarbejdet for nylig, kan genkende RNA dobbelthuse i en sekvens-specifikke måde. PNAs er kemisk stabile med en neutral peptid-lignende rygrad. PNAs kan syntetiseres relativt nemt ved metoden med manuel Boc-kemi faststadie syntese. PNAs er renset med omvendt-fase HPLC, efterfulgt af molekylvægt karakterisering af matrix assisted laser desorption/Ionisation-tidspunktet for flyvning (MALDI-TOF). Non-denatureringen polyacrylamid gel elektroforese (side) teknik letter billeddannelse af triplex dannelsen, fordi omhyggeligt designet gratis RNA duplex konstruktioner og PNA bundet triplexes ofte viser forskellige migration priser. Non-denatureringen side med ethidium bromid post farvning er ofte en nemme og informativ teknik til kendetegner bindende tilhørsforhold og særegenheder af PNA oligomerer. Typisk, flere RNA Hårnåle eller dobbelthuse med enkelt basepar mutationer kan bruges til at karakterisere PNA bindende egenskaber, såsom bindende tilhørsforhold og særpræg. 2-Aminopurine er en isomer af adenin (6-aminopurine); 2-aminopurine fluorescens intensitet er følsomme over for lokale strukturelle ændringer, og er velegnet til overvågning af triplex dannelse med den 2-aminopurine rest indarbejdet i nærheden af PNA bindingssted. 2-Aminopurine fluorescens titrering kan også bruges til at bekræfte den bindende selektivitet af modificerede PNAs mod målrettede dobbelt-strenget RNA'er (dsRNAs) over enkeltstrenget RNA'er (ssRNAs). UV-absorbans-fundet termisk smeltende eksperimenter tillader måling af termisk stabilitet PNA-RNA dobbelthuse og PNA· RNA2 triplexes. Her, vi beskrive syntesen og rensning af PNA oligomerer indarbejde ændrede restkoncentrationer, og beskrive biokemiske og biofysiske metoder til karakterisering af anerkendelse af RNA dobbelthuse af de modificerede PNAs.

Introduction

RNA'er fremvækst som vigtige biomarkører og terapeutiske mål, på grund af de seneste fremskridt i opdagelser af RNA'er roller i forordningen og katalyse af forskellige biologiske processer1,2,3. Traditionelt, har antisense-strenge været brugt til at binde til ssRNAs gennem Watson-Crick duplex dannelse3,4,5,6,7,8, 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27. for nylig, triplex-dannende peptid nukleinsyrer (TFPNAs) er blevet designet til at binde til dsRNAs via Hoogsteen brint limning (figur 1)3,28,29. dsRNA regioner er til stede i fleste af de traditionelle antisensstoffer-målrettet RNA'er, herunder pre-mRNAs og mRNAs, før eller pri-miRNAs3, og mange andre ikke-kodende RNA'er1,26,27. Målretning dsRNAs gennem triple helix dannelse ved hjælp af TFPNAs kan være en fordel på grund af dens struktur specificitet og er med stort potentiale for brug i genoprette de normale funktioner af RNA'er, som er dysregulated i sygdomme, f.eks.

Den nyligt offentliggjorte arbejde af Rozners et al., og os3,28,29,30,31,32,33, 34,35,36,37,38,39,40,41, rapporterede bestræbelser på at forbedre selektiv bindingen af modificerede TFPNAs mod dsRNAs med øget affinitet. Vi har udviklet syntese metoder for rationelt designet PNA monomerer (figur 2), herunder thio-pseudoisocytosine (L) monomer30 og guanidin modificerede 5-methyl cytosin (Q) monomer31. Gennem forskellige biokemiske og biofysiske karakterisering metoder, har vi bevist, at relativt korte PNAs (6-10 restkoncentrationer) indarbejde L og Q restkoncentrationer vis forbedret anerkendelse af Watson-Crick G-C og C-G basepar, henholdsvis i dsRNAs. Derudover Vis sammenlignet med umodificerede PNAs, PNAs med L og Q restkoncentrationer mere selektive bindende mod dsRNA over ssRNA og dsDNA. Guanidin funktionalitet42 i Q base giver PNAs at indtaste HeLa celler31.

I vores laboratorium, vi syntetisere PNAs af den manuelle Boc-kemi (Boc eller t- Boc står for tert-butyloxycarbony (Se figur 2) faststadie syntese metode4. Syntesen af PNA monomer med Boc som Amin beskytte gruppe er praktisk som gruppen Boc er sterically mindre pladskrævende i forhold til fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) Amin beskytte gruppe, som kan være gavnlige i PNA monomer kobling den solid støtte. Gruppen Boc er syre-labil og kan nemt fjernes med solid støtte ved 20-50% trifluoreddikesyre (TFA) i dichlormethan (DCM) under PNA syntese. En automatiseret peptid synthesizer kan være ansat til at syntetisere PNA oligomerer; dog er 3-5-fold overskydende af PNA monomer behov for en automatiseret peptid synthesizer. Manuel syntese kræver betydeligt mindre PNA monomer (2-3-fold overskydende), med hver kobling let overvåges af Kaiser test43. Desuden, mange automatiserede synthesizere er ikke kompatible med Boc strategi syntesen fra anvendelse af ætsende TFA under Boc fjernelse trin.

PNA oligomerer kan renses ved omvendt fase højtydende væskekromatografi (RP-HPLC) efterfulgt af molekylvægt karakterisering af MALDI-TOF (figur 3 og 4)30, 31. vi ansætter ikke-denatureringen side at overvåge triplex dannelse, skyldes, at frie RNA duplex konstruktioner og PNA bundet triplexes ofte viser forskellige migration satser (figur 5)30,31 . Ingen mærkning er nødvendig, hvis effektive efter farvning kan opnås for begge RNA duplex og PNA· RNA2 triplex bands. En forholdsvis lille mængde af prøven er nødvendig for ikke-denatureringen side eksperimenter. Dog kan lastning (inkubation) buffere og de kører buffere (pH 8.3) ikke være det samme, hvilket resulterer i målinger er begrænset til de kinetisk stabil triplexes, fordi en relativt høj pH-værdi på 8,3 kan betydeligt destabilisere en triplex.

2-Aminopurine er en isomer af adenin (6-aminopurine); 2-aminopurine fluorescens intensitet (med en emission peak på omkring 370 nm) er følsomme over for lokale strukturelle ændringer, og er velegnet til overvågning af triplex dannelse med 2-aminopurine resten indarbejdet i nærheden af PNA bindende () websted Figur 6) 31. i modsætning til mange andre farvestoffer, der viser fluorescens emission i det synlige spektrum, 2-aminopurine-mærket RNA kan blive udsat for rumbelysning uden foto blegning. I modsætning til side eksperiment, hvor en kørende buffer til pH 8.3 er ofte nødvendig, 2-aminopurine baseret fluorescens titrering tillader måling af bindende i én løsning ved en bestemt pH, og således kan tillade måling og registrering af relativt svag og kinetisk ustabil binding ved ligevægt.

UV-absorbans-fundet termisk smeltende eksperimenter tillader måling af termisk stabilitet dobbelthuse (figur 7)31 og triplexes30,32,44,45. Afhængigt af længden og sekvens sammensætning, smeltning af triplexes kan eller kan ikke vise en tydelig overgang. Termodynamiske parametre kan fås, hvis opvarmning og afkøling kurver overlapper hinanden. Nøjagtig termodynamiske parametre kan fås af isotermisk titrering kalorimetri (ITC)32; dog er forholdsvis store mængder af prøver generelt kræves for ITC.

Protocol

1. manuel fast-fase peptid syntese af PNAs ved hjælp af Boc kemi

Bemærk: For succes og lethed af den ønskede PNA oligomer syntese, alle opløsningsmidler og reagenser skal være vandfri. Tilføj de relevante molekylære sigter (4A, 1-2 mm diameter træpiller) og lejlighedsvis purge tør nitrogen gas i flasker. Syntesen af modificerede PNA monomerer, kan de rapporterede protokoller i respektive referencer 30 , 31 bruges. Uforandret PNA monomerer kan købes fra kommercielle kilder. I hvert af skridt, vask, tilføjes den passende mængde opløsningsmiddel harpiks, danner en gylle, før det er drænet ud

  1. Indlæsning af den første monomer og loft over de overskydende gratis primære aminer på harpiks
    1. vejer 30 mg af 4-methylbenzhydrylamine hydrochlorid (MBHA·HCl) polystyren harpiks (kommercielt tilgængelige; lastning værdien 0,7-1,4 mmol/g; maskestørrelse på 100-200), og overførsel til en 5 mL faste fase peptid reaktion fartøj udstyret med en stophane og glas prop.
    2. Blød harpiks i en passende mængde af DCM for 1 time, så harpiks til at svulme op og udsætte aminer (HCl salt).
      Bemærk: Resin perler bør altid være fuldt neddykket i opløsningsmidler i hele syntesen.
    3. Afløb fra DCM ved at anvende en blid flow af tør nitrogen gas over toppen af kolben. Der tilsættes 1 mL 50% (v/v), N, N-diisopropylethylamine (DIPEA) i DCM og lad det i 15 min. Dette neutraliserer HCl salt knyttet til de gratis aminer på harpiks.
    4. Gentag trin 1.1.3. I mellemtiden, vejer 6 µmol af monomere og 6 µmol af (benzotriazol-1-yl-oxy) tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBOP), og overføre til en 1,5 mL tube. Tilføje 200 µL af dimethylformamid (DMF) og 12 µmol af DIPEA. Vortex kobling løsning for 3-5 min.
      Bemærk: Ønskede lastning værdi bruges er 0,2 mmol/g. Den første monomer tilføjet er monomer på C-terminal i den ønskede PNA sekvens. Lastning værdien af den første aminosyre kan beregnes af picrinsyre syre metode 46.
    5. Afløb fra DIPEA fra DCM løsning. Vask i resin med DCM (x 3), efterfulgt af DMF (x 3), og lukke hanen. Tilføj den forberedte kobling løsning til harpiks og Ryst forsigtigt. Skubbe harpiks langs de indvendige vægge af fartøjet til kobling løsning med anvendelse af en ren rustfri spatel. Vedhæfte glas prop og sikre fartøj i en inkubator shaker i 3 timer ved 40 ° C.
      Bemærk: Alternativt reaktion fartøj kan holdes konstant ved stuetemperatur i 6-8 timer at tillade gennemfoerelsen af peptid kobling reaktion.
    6. Forbereder den takstlofter løsning ved at blande 240 µmol af eddikesyreanhydrid og 360 µmol af DIPEA i 200 µL af DCM. Afløb fra kobling løsning og vaske harpiks med DMF (x 3) og DCM (x 3). Tilføj i opløsningen takstlofter og forlader skibet for 30 min, lejlighedsvis omrystning fartøjet forsigtigt. Loft over masker overskydende gratis primære amine grupper på harpiks af acetylation.
    7. Gentag trin 1.1.6. Dræn den takstlofter løsning og vaske harpiks med DCM (x 3).
    8. Fjerne en lille alikvot af resin perler ved hjælp af en tynd kapillarrør, og placere dem i en lille 1,5 mL hætteglas. Udføre Kaiser test 43. Tilføj 15 µL af hver af Kaiser test-opløsninger i glasset hætteglasset og varme ved hjælp af en varmepistol. Observere farven på perlerne efter opvarmning. Farven på perlerne bør forblive uændret, som angiver manglen frie amine grupper på harpiks.
      Bemærk: Kaiser testkit er kommercielt tilgængelige eller kan tilberedes efter rapporterede protokol. Opløsning A: ninhydrin i ethanol; opløsning B: fenol i ethanol; opløsning C: kalium cyanid (KCN) i pyridin.
      Forsigtig: KCN er meget giftigt; korrekt beskyttelsestøj skal bæres og opvarmning bør udføres i et velventileret stinkskab, i mangel af brandfarlige opløsningsmidler eller reagenser.
    9. Gentag trin 1.1.6 Hvis resin perler vise blå eller svag blå farve.
  2. Fjernelse af N-terminale Amin beskytte gruppe
    1. afløb opløsningsmidler fra reaktion fartøj og tilsættes en opløsning på 50% (v/v) af trifluoreddikesyre (TFA) i DCM, at sikre, at harpiks er fuldt neddykket. Forlade skibet for 15 min, lejlighedsvis omrystning for at lette deprotection af amine grupper. Gentag 2 flere cyklusser.
      Forsigtig: TFA er stærkt ætsende. Korrekt beskyttelsestøj bør bæres, når du håndterer.
    2. Vaske harpiks med DCM (x 3), DMF (x 3) og DCM (x 3). Tilsættes en opløsning på 5% DIPEA i DCM. Forlade skibet for 15 min. Dette trin aktiverer de gratis aminer ved at neutralisere TFA counter anioner. Gentag endnu.
    3. Skylle ud DIPEA fra DCM-løsningen. Vask harpiks med DCM (x 3). Udføre Kaiser test (trin 1.1.8).
      Bemærk: Vellykket deprotection af amine grupper vil give blå misfarvning af perlerne. Når deprotection er vellykket, efterfølgende kobling af monomerer af peptid kobling kan foretages.
  3. Kobling af efterfølgende monomerer
    1. vejer 18 µmol af ønskede monomer (for Boc-PNA-Q-OH monomeren, bestemt 13,2 mg af monomere vejes) og 18 µmol af PyBOP ind i en 1,5 mL rør. Tilføje 200 µL af DMF og 36 µmol af DIPEA ind i 1,5 mL rør. Vortex indtil alle faste forbindelser er opløst.
    2. Vask i resin med DMF (x 3). Tilføje kobling løsning i reaktion fartøj og Ryst forsigtigt. Skubbe harpiks langs de indvendige vægge af fartøjet til kobling løsning med anvendelse af en ren rustfri spatel. Vedhæfte glas prop og sikre fartøj i en inkubator shaker i 3 timer ved 40 ° C.
    3. Afløb fra kobling løsning og vask harpiks med DMF (x 3) og DCM (x 3). Udføre trin 1.1.8. Hvis farven på perlerne forbliver uændret, Gentag skridt 1.2.1-1.3.3, indtil den ønskede PNA sekvens er afsluttet. Hvis blå misfarvning af perler er observeret efter kobling af en monomer, skal du gentage trin 1.3.1-1.3.3. Hvis misfarvning stadig fortsætter, udføre de udjævningen igen (trin 1.1.6).
      Bemærk: Udvidet kobling tid (3-12 h) og/eller anvendelse af overskydende svarer til monomere og kobling reagenser anbefales hvis der opstår problemer med kobling.
    4. Når den ønskede PNA sekvens er afsluttet, vaske harpiks med DMF (x 3) og DCM (x 3). Helt tørre harpiks ved at anvende en kontinuerlig strøm af tør nitrogen gas for 15 min. Dette tør harpiks kan opdele og anvendes til at fastgøre lysin eller en fluorescerende tag som cyanine 3 (Cy3) og carboxyfluorescein på N-terminus af PNA.
  4. Fastgørelse af lysin eller fluorescerende tag (Cy3, Cy5, eller carboxyfluorescein) til N-terminus af PNA
    1. vejer 10 mg af harpiks, pre-belæsset hos den ønskede PNA sekvens. Overføres til et 5 mL reaktion fartøj. Blød harpiks i DCM i 1 h.
    2. Til fastgørelse af lysin, udføre trin 1.2.1-1.3.3, erstatter monomeren med enten Boc-Lys (Z) - OH eller Fmoc-Lys (Boc) - OH.
    3. Til fastgørelse af carboxyfluorescein, udføre trin 1.2.1-1.3.3, med 10-fold overskud af 5 (6)-carboxyfluorescein som monomer, og N, N '-diisopropylcarbodiimide (DIPC) og hydroxybenzotriazole (HOBt) som kobling reagenser i DMF. Lad koblingen reaktion natten i inkubator shaker ved 40 ° C.
      Bemærk: Carboxyfluorescein er lysfølsomt, reaktion fartøj skal dækkes med alufolie.
    4. Til fastgørelse af Cy3 eller Cy5 farvestof, etiket af metoden Klik kemi udføre trin 1.2.1-1.3.3, erstatter monomeren med N-Boc-2-propargyl-L-glycine. Dette functionalizes N-terminus af PNA med en alkyn gruppe. Udføre klik med kobber-katalyserede reaktion for at vedhæfte den indeholder-holdige Cy3 eller Cy5 fluorescerende farve 12 , 47 , 48 , 49
  5. PNA kavalergang fra solid støtte, rensning, og karakterisering
    Bemærk: Hvis nogen Amin gruppe er beskyttet med Fmoc beskytte gruppe, først deprotect Amin-gruppen ved at behandle med 20% piperdine i DMF løsning for 15 min (2 cykler). Vask harpiks grundigt med DMF (x 3) efterfulgt af DCM (x 3). Tørre harpiks fuldstændigt ved at anvende en kontinuerlig strøm af tør nitrogen gas for 15 min.
    1. Overføre 5 mg af tørre harpiks i en lille hætteglas. Tilsæt 10 µL af thioanisole og 4 µL af 1,2-ethanedithiol, at sikre, at harpiks er neddykket i reagenserne. Forlader røret ved stuetemperatur i 5 min.
      Bemærk: Disse reagenser fungere som skyllevæsker, som fælde reaktive kationiske arter, der er dannet under fjernelse af beskyttelse af grupper i PNA. Passende skraldemanden kan vælges baseret på den sidekæde beskytter grupper.
    2. Tilsættes 100 µL af TFA ind i røret, der indeholder harpiks og skyllevæsker. Forsigtigt vortex blandingen og emne til kort centrifugering. Forlader røret ved stuetemperatur i 10 min.
      Forsigtig: TFA er stærkt ætsende. Korrekt beskyttelsestøj bør bæres, når du håndterer.
    3. Tilføje omhyggeligt 20 µL af trifluoromethanesulfonic syre (TFMSA) til røret. Forsigtigt agitere reaktionsmiljøet før udsætter til kort centrifugering ved stuetemperatur. Forlader røret stabil ved stuetemperatur til 2 h.
      Forsigtig: TFMSA er stærkt ætsende. Korrekt beskyttelsestøj bør bæres, når du håndterer.
    4. Filter off kavalergang cocktail i en 5 mL runde-bunden kolbe (RBF) med brug af et glas Pasteur pipette monteret med bomuld. Bruge en lille mængde af TFA for at vaske harpiksen.
    5. Rense tør nitrogen gas til de indsamlede filtratet indtil alle flygtige opløsningsmidler er fordampet. Tilsæt 1 mL koldt dietylaeter i RBF.
      Bemærk: Dietylaeter vil forårsage PNA at udfælde.
      1. Skylles RBF med diethyletheren afdampes flere gange før du overfører overskyet løsningen ind i et 1,5 mL rør. Emnet tube til centrifugering tillade PNA bundfaldet at bilægge. Dekanteres opløsningsmidler og tilføje 300-500 µL autoklaveres vand til bundfaldet. Vortex grundigt for at opløse PNA.
    6. Rense den rå PNA prøve via RP-HPLC ved hjælp af water-acetonitrile-0.1% TFA som den mobile fase. Indsamle de tilsvarende fraktioner, fordampe alle opløsningsmidler ved hjælp af et vakuum koncentrator før re opløse den renset PNA i autoklaveres vand.
    7. Karakteriserer den renset PNA via MALDI-TOF analyse med brugen af α-cyano-4-hydroxycinnamic syre (CHCA) som krystallisering prøvematrixen.
    8. Måle UV-absorbans (260 nm) af PNA på 65 ° C. Beregn koncentrationen af PNA med ligningen:
      Equation 1
      NOTE: her c er koncentrationen, A er absorbansen læsning opnået, ε er udslettelse koefficient for RNA-sekvens, og l er lysvej af kuvette (1 cm). extinction PNA sekvens lig summen af udryddelse koefficient af enkelte monomerer 50. Extinction koefficienter af adenin, cytosin, guanin og thymin er 15,4, 7.3, 11,7 og 8,8 mL/µmol·cm, henholdsvis. Extinction koefficient for de L og Q monomerer bruges antages for at være den samme som den cytosin (C) base.

2. Non-denatureringen side

  1. udarbejdelse af nødvendig buffer løsninger
    1. forberede inkubation buffer (10 mL) ved hjælp af 116.88 mg NaCl (200 mM), 50 µL af 100 mM ethylendiamintetra syre (EDTA) (0,5 mM), 200 µL 1 M materiel HEPES (20 mM), 9.75 m H 2 O; justere buffer til pH 7,5.
    2. Forbered 1 x Tris-Borat-EDTA (TBE) kører buffer (1 L) ved hjælp af 100 mL 10 x Tris-Borat-EDTA til pH 8.3 og 900 mL H 2 O.
    3. Forbered 10% Ammonium persulfat (APS) løsning (300 µL) bruger 30 mg ammonium persulfat, og 300 µL H 2 O.
  2. Forberedelse af 12% polyacrylamid gel
    1. Rens godt danner kam, støbning glasplader og afstandsstykker med ethanol; godt danner kam og afstandsstykker er 1 mm tyk. Oprettet gel forsamlingen og forsegle med gel-forsegling tape.
    2. For en polyacrylamid gel på 22 cm x 16,5 cm x 1 mm dimension, 50 mL af gelopløsning er tilstrækkelig. Afvejes 5,7 g af acrylamid og 0,3 g i N, N '-methylenebisacrylamide (19:1) og overførsel til en 50 mL centrifugeres tube.
      Forsigtig: Acrylamid er kræftfremkaldende. Undgå at indånde støv dampe fra acrylamid og sørge for at korrekt beskyttende tøj er slidt ved håndtering af.
    3. Opløses solid forbindelser i 50 mL 1 X TBE kører buffer ved at placere centrifugeglasset i vandbad i 50 ° C i 15 min, eller indtil alle faste forbindelser har opløst. Udføre centrifugering (3.000 omdr. / min., 5 min., 25 ° C) til at fjerne alle luftbobler i løsningen. Tillade løsning køle af til rumtemperatur.
    4. Tilføje 250 µL af 10% APS løsning og 50 µL af tetramethylethylenediamine (TEMED) i gelopløsning og bland forsigtigt med en spatel. Straks hælde løsning mellem glasplader, og sørg for ikke at indføre eventuelle luftbobler. Indsæt den godt danner kam og forlade gel setup ved stuetemperatur i mindst 60 min tillade polymerisering at forekomme, før opbevaring ved 4 ° C indtil klar til brug.
  3. Forberedelse af prøver
    1. fjerne påkrævede antal af RNA hårnål (1 µM) fra den vigtigste bestand i en ren 1,5 mL tube. Tørre RNA løsning ved hjælp af et vakuum koncentrator.
      Bemærk: Hver prøve indeholder 1 µM af RNA i 20 µL inkubation buffer. Typisk, 13 prøver af RNA er forberedt til én side eksperimentere. RNA for alle prøver kan tilberedes sammen i et enkelt rør.
    2. Fjerne de nødvendige mængder af målrettet PNA (med den endelige koncentration af op til 50 µM) fra den vigtigste bestand og overførsel til separate 1,5 mL rør. Fordampe vand af PNA løsninger ved hjælp af et vakuum koncentrator.
    3. Tilføje 260 µL af inkubation buffer til 1,5 mL rør indeholdende tørrede RNA og bland grundigt for at sikre alle RNA er dissolved. Emne RNA for at fastgøre køling: sted rør til varme blok (forvarmet til 95 ° C) i 5 min. umiddelbart overføres til isbad og orlov til 10 min.
    4. Tilføje 20 µL af RNA i hver af 1,5 mL rør indeholdende tørrede PNA og bland grundigt. Udfører udglødning: placere røret indeholdende RNA og PNA blanding til en varme blok (forvarmet til 65 ° C) for 10 min. Turn off power af varme blok og lad prøverne afkøles langsomt til stuetemperatur. Inkuber prøver ved 4 ° C natten.
  4. Kører og forarbejdning af gel
    1. fjerner gel-forsegling bånd på undersiden af glaspladen. Montere og sikre glasplade på den lodrette gel stå ved hjælp af plast klemmer.
      Bemærk: Gel kører er udført i et koldt rum på ca. 4 ° C. Alt det udstyr, prøver og buffere er nedkølet ved 4 ° C før du kører gel.
    2. Fylder den lavere buffer reservoir med 1 x TBE kører buffer, indtil pladen er nedsænket i ca 1-2 cm af kører buffer. Fyld den øverste buffer reservoir med kører buffer, indtil bufferen overstiger toppen af gelen af 1-2 cm. langsomt og forsigtigt fjerne godt danner kammen, så den kørende buffer til at fylde brøndene.
    3. Tilsluttes en strømforsyning gel standeren. Pre Kør gelen i mindst 30 min med en konstant spænding af 250 V, som er optimeret til en 22 cm x 16,5 cm x 1 mm gel.
    4. i mellemtiden tilføje 4 µL (20% af stikprøven volumen) af 35% glycerol løsning til hver af prøverne og bland forsigtigt. Når pre-Run er afsluttet, indlæse 20 µL af hver prøve (herunder en RNA alene prøve plus prøver indeholdende RNA og PNA blanding) omhyggeligt i bunden af en brønd med en mikropipette og gel ladning tips, og sørg for ikke at indføre eventuelle luftbobler. Kør gelen på en konstant spænding på 250 V, svarende til pre-Run, for 5 h.
    5. Stoppe strømforsyningen efter 5 h og fjerne glasplade fra standeren. Fjern de resterende gel-forsegling tape og demontere glasplade. Forsigtigt fjerne og fordybe gel i en container fyldt med 350 mL deioniseret vand. Forsigtigt tilføje 35 µL af ethidiumbromid (10 mg/mL) og beholderen anbringes på en platform shaker (lav hastighed) for 30 min.
      Forsigtig: Ethidiumbromid er et mutagen. Korrekt beskyttelsestøj bør bæres, når du håndterer.
    6. Afhænde ethidium bromid løsning til en udpeget spildbakken. Skyl gel med 1,5-2 L destilleret vand. Skan gel ved hjælp af en imager (Se Tabel af materialer) med en grøn laser af 532 nm og emission filter sæt på 610 nm.
  5. Gel analyse
    1. kvantificere gel band intensiteter med en gratis software, GelQuant.NET (http://www.biochemlabsolutions.com/GelQuantNET.html). Normalisere band støtteintensiteter i henhold til:
      Equation 2
      NOTE: her jeg duplex max er bandet intensiteten af RNA hårnål alene uden tilsætning af PNA, og jeg Triplex max triplex band intensitet med den højeste koncentration af PNA tilføjet.
      1. Beregne brøkdel af triplex dannelse ifølge:
        Equation 3
    2. Plot brøkdel af triplex dannelsen (Y) mod koncentrationen af PNA tilføjet () ΜM). Passer data til ligning at opnå dissociationskonstant (K d):
      Equation 4
      NOTE: her R 0 er RNA hårnål koncentration (1 µM). Her Y 0 og B er oprindelige og den maksimale ændring af triplex fraktion, henholdsvis. Y er fraktion af triplex på varieret PNA koncentration. X er den samlede PNA koncentration og K d er dissociationskonstant.

3. 2-Aminopurine fluorescens bindende Assay

  1. forberedelse af prøver (der indeholder dsRNA)
    1. fjerne den krævede mængde 2-aminopurine (2AP) hedder dsRNA (1 µM for hver strand) fra den vigtigste bestand i en ren 1,5 mL tube. Fordampe vand i RNA løsninger ved hjælp af et vakuum koncentrator.
      Bemærk: Hver prøve indeholder 1 µM af RNA i 75 µL inkubation buffer. Typisk, 13 prøver af RNA er forberedt. RNA for alle prøver kan tilberedes sammen i et enkelt rør.
    2. Fjerne de krævede mængder af den målrettede PNA for forskellige koncentrationer fra den vigtigste bestand og overførsel til separate 1,5 mL rør. Fordampe vand af PNA løsninger ved hjælp af et vakuum koncentrator.
    3. Tilføje 975 µL af inkubation buffer til 1,5 mL rør indeholdende tørrede RNA og bland grundigt for at sikre alle RNA er opløst. Centrifugeres RNA løsning kort og udsættes for glødning: placere røret i en varme blok (forvarmet til 95 ° C) i 10 min. Turn off power af varme blok og lad prøverne afkøles langsomt til stuetemperatur.
    4. Tilføje 75 µL af RNA i hver af 1,5 mL rør indeholdende tørrede PNA og bland grundigt. Lad prøverne ved stuetemperatur for mindst 1 h. Incubate prøverne ved 4 ° C natten.
  2. Forberedelse af prøver (der indeholder ssRNA)
    1. fjerne krævede mængde af 2AP-mærket ssRNA (1 µM) fra den vigtigste bestand i ren 1,5 mL rør. Udtrække de nødvendige mængder af målrettet PNA for forskellige koncentrationer fra den vigtigste bestand og overførsel til de respektive 1,5 mL rør, der indeholder ssRNA. Tørre RNA og PNA blandingen ved hjælp af et vakuum koncentrator.
    2. Tilføje 75 µL inkubation buffer ind i hver af 1,5 mL rør og blandes grundigt. Udglødning er underlagt blandingen: placere røret i en varme blok (forvarmet til 95 ° C) til 10 min. Turn off den magt og lad prøverne afkøles langsomt til stuetemperatur. Inkuber prøver ved 4 ° C natten.
  3. Måling og analyse
    1. bruge et fluorescens Spektrofotometer til måling af emissionen over en bølgelængdeområdet af 330-550 nm. Bruge en excitation boelgelaengden 303 nm.
      Bemærk: Prøverne er målt ved stuetemperatur og hver prøve er målt 3 gange, hvor gennemsnittet er taget.
    2. Overføre 70 µL inkubation buffer i 1 cm firkantet kuvette. Start måling.
    3. Fjerne bufferen fra kuvette. Skyl kuvette med destilleret vand og rense nitrogen gas til tørre. Gentag for alle prøver. Subtrahere buffer målinger fra alle prøver.
    4. Plot fluorescens-intensiteten (a.u.) mod bølgelængde (nm). Optage fluorescens-intensiteten på 370 nm for alle prøver. Plot fluorescens-intensiteten på 370 nm (a.u.) mod den tilsvarende koncentrationen af PNA tilføjet (µM).
    5. Passer til data til ligningen fra trin 2.5.2 at opnå dissociationskonstant (K d): Y = Y 0 + (B / (2R 0)) (R 0 + X + K d-((R 0 + X + K d) 2 -4R 0 X) 1/2), hvor R 0 er 2AP-mærket dsRNA koncentration (1 µM).
      Bemærk: Her Y 0 og B er den første og maksimale ændring af fluorescens intensitet på 370 nm, henholdsvis. Y er fluorescens-intensiteten på 370 nm på varieret PNA koncentration. X er den samlede PNA koncentration og K d er dissociationskonstant.

4. UV-absorbans-fundet termisk smeltende eksperimenter

  1. forberedelse af prøver
    Bemærk: måle UV-absorbans (260 nm) af RNA ved 95 ° C (for at sikre RNA sekundære strukturer er afbrudt). Beregne koncentrationen af RNA med ligningen:
    Equation 5
    ​ hvor c er koncentrationen, A er absorbansen læsning opnået, ε er udslettelse koefficient af RNA-sekvens, og l er lysvej af kuvette (1 cm). Extinction koefficient af RNA beregnes baseret på nærmeste nabo model ved hjælp af MeltWin 51 , 52. Programpakken kan bestilles.
    1. Fjern det påkrævede antal af ssRNA (5 µM) fra den vigtigste bestand i ren 1,5 mL rør. Fjern de nødvendige mængder af målrettet PNA (5 µM) fra den vigtigste bestand og overførsel til de respektive 1,5 mL rør, der indeholder ssRNA. Tørre RNA og PNA blandingen ved hjælp af et vakuum koncentrator.
    2. Tilføje 130 µL inkubation buffer ind i hver af 1,5 mL rør og blandes grundigt. Udglødning er underlagt blandingen: placere røret i en varme blok (forvarmet til 95 ° C) til 10 min. Turn off den magt og lad prøverne afkøles langsomt til stuetemperatur. Inkuber prøver ved 4 ° C natten.
  2. Måling og analyse
    1. bruge et UV-Vis Spektrofotometer til måling af absorbans ved 260 nm med en 8-mikrocelle kuvette med en lysvej på 1 cm. måle prøverne ' absorptioner ved stigende temperatur fra 15 til 95 ° C, efterfulgt af faldende temperatur fra 95 til 15 ° C på en rampe på 0,5 ° C/min.
    2. Overføre 130 µL af prøven i hver af de godt, og sørg for, at en godt indeholder inkubation buffer. Start måling. Gentag som nødvendigt.
    3. Normalisere absorbans værdier med den høje temperatur læsning normaliseret til enhed og plot normaliseret absorbansen læsning mod temperatur (° C). Afbilde den første afledede af kurver. Opnå de smeltende temperatur ved at montere de første afledte kurver til en Gaussisk funktion.

Representative Results

Omvendt-fase HPLC giver mulighed for rensning af PNA oligomerer. Vi kan få ren PNA oligomerer med to runder af HPLC rensning (figur 3). PNAs identitet kan bekræftes ved MALDI-TOF analyse (figur 4).

Non-denatureringen side er en nemme og informativ teknik til kendetegner bindende tilhørsforhold og særegenheder af PNA oligomerer. Vi bruger typisk flere RNA Hårnåle eller dobbelthuse med enkelt basepar mutationer til at karakterisere bindende egenskaber (figur 5). Ikke-denatureringen sidedata vist i figur 5 klart foreslå at den Q - og L-ændring af PNA kan genkende en dsRNA region med en C-G par (fig. 5B, nederste panel) men ikke den ene uden en C-G par (fig. 5B, top panel). Denne specifikke og øget anerkendelse er gennem T· A-U, L· G-C og Q· C-G PNA· RNA2 base triple (figur 1A, C, D) dannelse. Forskellige PNAs med én eller flere mutationer kan også bruges til at påvise forbedret bindende egenskaber af en modificeret PNA. Vi har vist, at tilføje 2 mM Mg2 + i inkubation bufferen ikke påvirker bindingen betydeligt31.

Vi har demonstreret ved 2-aminopurine fluorescens titrering, som en Q - og L-ændring PNA binder til en målrettet dsRNA region (figur 6A, 6 C, 6 D) men ikke ssRNA (fig. 6B, 6E 6F). PNA P3 binder sig til den 2-aminopurine-mærket dsRNA med en Kd værdi på 0,8 ± 0,1 µM. Fluorescens-intensiteten på 370 nm for den 2-aminopurine-mærket ssRNA forbliver relativt konstant med varieret P3 koncentration, som angiver manglen binding af PNA P3 til ssRNA.

PNAs indeholdende Q restkoncentrationer (P2 og P3) Vis ingen termisk smeltende overgange (figur 7), foreslår ingen binding til ssRNA. Dette er på grund af sterisk sammenstød stede i Watson-Crick som Q-G par. Sammenlignet med umodificerede PNA P1, PNAs P4 og P5 indeholdende ændret L rester, men ingen Q restkoncentrationer, Vis faldt smeltende temperaturer til de tilsvarende RNA-PNA dobbelthuse på grund af sterisk sammenstød stede i Watson-Crick ligesom L-G par. De UV-absorbans-fundet termisk smeltende data er i overensstemmelse med 2-aminopurine fluorescens titrering data, som viser også, at en PNA med Q og L restkoncentrationer ikke binde til ssRNA mærkbart (figur 6B, 6E 6F). Indarbejde en Q base er mere destabiliserende end en L base, som en Q base har en mere betydelig sterisk sammenstød i dannelsen af en Watson-Crick-lignende Q-G par (figur 1F) i forhold til en Watson-Crick-lignende L-G par (figur 1E ).

Figure 1
Figur 1 : Kemiske strukturer af stabil base tredobbelt og ustabile basepar strukturer. (A-D) Major-groove PNA· RNA2 base tripler af T· A-U (A), C+· G-C (B), L· G-C (C), og Q· C-G (D). (E, F) Ustabile Watson-Crick som PNA-RNA basepar af L-G (E) og Q-G (F). Bogstavet R repræsenterer sukker-fosfat rygraden i RNA. Hydrogenbindinger er angivet med sort stiplede linjer. Tallet er gengivet fra reference31. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Kemiske strukturer af PNA monomerer. Fire PNA monomerer (T, C, L og Q) er vist. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Kemiske struktur af en PNA oligomer og rensning af RP-HPLC. (A) kemiske struktur af PNA sekvens P3. (B, C) RP-HPLC data af rå PNA P3 (B) og igen renset PNA P3 (C). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 : MALDI-TOF spektrum af renset PNA P3. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5 : RNA hårnål og PNA sekvenser og bindende karakterisering af ikke-denatureringen side. (A) RNA Hårnåle (rHP1 og rHP2), PNA P3, og en PNA· RNA2 triplex dannet mellem PNA P3 og rHP2. (B) ikke-denatureringen side (12%) resultater af rHP1 og rHP2 binding til PNA P3. Inkubation buffer er 200 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 20 mM HEPES, pH 7,5. De indlæste RNA Hårnåle (rHP1 og rHP2) er på 1 µM i 20 µL. PNA koncentrationer i baner fra venstre mod højre er 0, 0,2, 0,4, 1, 1.6, 2, 4, 10, 16, 20, 28, og 50 µM. PNA P3 binder sig ikke til rHP1 (toppanelet) men binder sig til rHP2 (nederste panel). (C) Kd bestemmelse for P3 binding til rHP2. Brøkdel af triplex dannelse (Y) var plottes PNA koncentration. Tallet er tilpasset fra reference31. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6 : Fluorescens titrering undersøgelse af PNA P3 bindendetil 2-aminopurine-mærket RNA'er. 2-aminopurine resten er udpeget som '2' i RNA-sekvens. Inkubation buffer er 200 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 20 mM HEPES, pH 7,5. (A) en PNA· RNA2 triplex dannet mellem P3 og en 2-aminopurine-mærket dsRNA (dsRNA2-2AP). (B) en hypotetisk PNA-RNA duplex dannet mellem P3 og en 2-aminopurine-mærket ssRNA (ssRNA2-2AP). (C, E) Fluorescens emission spectra 2-aminopurine-mærket RNA duplex (1 µM) og ssRNA (1 µM), henholdsvis varieret med P3 koncentration på pH 7,5. Peak på omkring 475 nm er på grund af svag fluorescens emission af L base i PNA. (D, F) K d bestemmelse baseret på parceller af 2-aminopurine fluorescens intensitet (på 370 nm) af RNA duplex og ssRNA, henholdsvis versus PNA P3 koncentration. Tallet er tilpasset fra reference31. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7 : Thermal smeltende resultater for RNA-PNA dobbelthuse. Inkubation buffer er 200 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 20 mM NaH2PO4, pH 7,5. Alle prøver indeholder 5 µM enkeltstrenget RNA (ssRNA1) og PNA i 130 µL. (A) enkeltstrenget RNA (ssRNA1), PNAs (P1, P2, P3, P4 og P5) og en hypotetisk PNA-RNA duplex dannet mellem PNA P3 og ssRNA1 i en parallel orientering. Sterisk sammenstød er indiceret til Watson-Crick som Q-G og L-G par. (B) smeltende kurver for forskellige PNAs binding til ssRNA1. De smeltende temperatur er vist for kurver med smeltende overgange. Tallet er tilpasset fra reference31.

Discussion

RNA duplex-bindende PNA oligomerer (f.eks, 10-mers) er mellemstore molekyler og dermed kan vise elektroforese mobilitet Skift ved binding til RNA'er med en sammenlignelig eller lidt større størrelse (fx, 50-mer eller mindre). Hvis en RNA er betydeligt større end PNA, kan titrering af PNA i RNA ikke arbejde på grund af en begrænset gel mobilitet Skift. Således, den store RNA kan afkortes for ikke-denatureringen side assays. Titrering af en stor RNA i en fluorophore-mærket PNA giver mulighed for overvågning af triplex dannelsen af en ikke-denatureringen agarosegel med eksemplet indlæses i midten af gel40.

For en titrering eksperiment af ikke-denatureringen side med en konstant total koncentration af RNA bruger vi typisk en umærket RNA-koncentration på 1 µM til effektiv post farvning af gratis RNA og triplex bands af ethidiumbromid. En RNA koncentration så lavt som 0,2 µM kan også være tilstrækkelige afhængigt af RNA konstruere31. Koncentrationen af den umærkede RNA (0,2 µM) bestemmer, at Kd værdier, der kan måles præcist bør være omkring 0,2 µM eller større. Andre farvning farvestoffer kan bruges til at effektivisere farvning. Alternativt, vores ikke-offentliggjorte data tyder på, at Cy3 dye-mærket RNA'er kan anvendes til ikke-denatureringen side forsøg til at måle tight bindende begivenheder.

At 2-aminopurine er kun moderat fluorescerende, er 2-aminopurine fluorescens titrering også begrænset til måling af bindende med Kd værdier tæt på eller over 0,2 µM31. RNA eller PNA kan være mærket med en forholdsvis lys farve til kvantificering af en forholdsvis stram bindende løsning gennem fluorescens titrering, hvis bindende resulterer i ændringer i fluorescens signaler53,54,, 55.

Strategien med at målrette RNA strukturer af dsRNA-bindende PNAs er blevet testet for et begrænset antal RNA'er. Det er sandsynligt, at bindende egenskaber kan variere for dsRNAs med forskellige sekvenser og basepar kompositioner. Man kan altid vælge purin-rige strand af en duplex for udformningen af TFPNAs. Det er vigtigt at forstå, hvordan træk Q· C-G tredobler kan påvirke stabiliteten i en triplex. Mere omfattende sekvens-afhængige undersøgelser er klart behov for at forstå sekvens-afhængige bindende egenskaber af TFPNAs.

Bindende affinitet af TFPNAs kan forbedres yderligere ved at øge længden og/eller yderligere ændring af baser og rygbenet56,57 af TFPNAs. Men en kontinuerlig duplex region må ikke ofte bestå af mere end 10 på hinanden følgende basepar uden forstyrrelsen af ikke-Watson-Crick strukturer. Man kan konjugerede TFPNAs med små molekyler til anerkendelse af ikke-Watson-Crick strukturer støder op til dsRNA regioner. I princippet forventes en TFPNA-lille molekyle konjugat at have forbedret bindende affinitet og specificitet i forhold til en TFPNA eller lille molekyle alene. Imidlertid de kemiske og fysiske egenskaber af linker til konjugation58,59,60,61,62,63,64 skal optimeres.

Det faktum, at TFPNAs kan selektivt binde til dsRNAs over ssRNAs og dsDNAs antyder, at det er muligt at udvikle TFPNAs som meget nyttige kemiske sonder og potentielle terapeutiske ligander gennem regulering af RNA strukturdynamik og interaktioner med proteiner og metabolitter. Cellulære optagelse af TFPNAs kan lettes gennem konjugering med celle-gennemtrængende fraspaltning som små molekyler, peptider, og nanopartikler eller kompleks med Supramolekylær strukturer såsom Liposomer5,6 ,12,17,25,31,41,65,66. Yderligere kan functionalization af TFPNAs med bioimaging tags som fluorophores og radioisotoper lette afsløringen, billedbehandling, og målretning af funktionelle RNA strukturer i levende organismer.

Disclosures

En patentansøgning (PAT/179/14/15/PCT) baseret på det arbejde, der er rapporteret her er indgivet.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af Singapore Ministeriet for uddannelse (MOE) Tier 1 (RGT3/13 og RG42/15-G.C.) og MOE Tier 2 (MOE2013-T2-2-024 og MOE2015-T2-1-028 til G.C.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Molecular sieves, 4A, 1-2 mm diameter pellets  Alfa Aesar 87956
4-Methylbenzhydrylamine hydrochloride (MBHAŸHCl) Sigma-Aldrich 532444
N,N-diisopropylethylamine (DIPEA) Alfa Aesar A11801
(Benzotriazol-1-yl-oxy)tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBOP) Alfa Aesar B25251
Acetic anhyride Sigma-Aldrich 320102
Kaiser Test Kit  Sigma-Aldrich 60017
Trifluoroacetic acid (TFA) Alfa Aesar L06374
Unmodified PNA monomers ASM Research Chemicals GmbH 5004007, 5004008, 5004009, 5004010
Boc-Lys(Z)-OH / Fmoc-Lys(Boc)-OH Sigma-Aldrich B8389 / 47624
Thioanisole Alfa Aesar A14846
1,2-Ethanedithiol Alfa Aesar L12865
Trifluoromethanesulfonic acid Alfa Aesar A10173
LiChrosper® 100 RP-18 endcapped (5 µm) LiChroCART® 250-4 Merck Millipore 150838
RNA Oligos  Sigma-Aldrich Customized 
α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) Sigma-Aldrich 39468
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Alfa Aesar J15694
HEPES  Lonza 17-737E
Acrylamide Sigma-Aldrich A8887
N.N'-methylenebisacrylamide Sigma-Aldrich  146072
Ammonium persulfate (APS) Bio-rad 161-0700
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Bio-rad 161-0800
10X Tris-Borate-EDTA (TBE) Buffer, pH 8.3 1st Base BUF-3010-10X1L
Glycerol  Promega  H5433
Ethidium bromide (10 mg/mL) Bio-rad  161-0433
High Precision Cell (Quartz Suprasil, 200-2500 nm) Hellma Analytics  105.250-QS

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cech, T. R., Steitz, J. A. The noncoding RNA revolution-trashing old rules to forge new ones. Cell. 157 (1), 77-94 (2014).
  2. Velagapudi, S. P., Gallo, S. M., Disney, M. D. Sequence-based design of bioactive small molecules that target precursor microRNAs. Nat Chem Biol. 10, 291-297 (2014).
  3. Patil, K. M., Chen, G. Modified Nucleic Acids in Biology and Medicine. Jurga, S., Erdmann, V. A., Barciszewski, J. , Springer International Publishing. 299-317 (2016).
  4. Hyrup, B., Nielsen, P. E. Peptide nucleic acids (PNA): synthesis, properties and potential applications. Bioorg Med Chem. 4 (1), 5-23 (1996).
  5. Shiraishi, T., Nielsen, P. E. Improved cellular uptake of antisense peptide nucleic acids by conjugation to a cell-penetrating peptide and a lipid domain. Methods Mol Biol. 751, 209-221 (2011).
  6. Shiraishi, T., Nielsen, P. E. Nanomolar cellular antisense activity of peptide nucleic acid (PNA) cholic acid ("umbrella") and cholesterol conjugates delivered by cationic lipids. Bioconjugate Chem. 23 (2), 196-202 (2012).
  7. Khoo, B., Roca, X., Chew, S. L., Krainer, A. R. Antisense oligonucleotide-induced alternative splicing of the APOB mRNA generates a novel isoform of APOB. BMC Mol Biol. 8, 3 (2007).
  8. Stein, C. A., et al. Efficient gene silencing by delivery of locked nucleic acid antisense oligonucleotides, unassisted by transfection reagents. Nucleic Acids Res. 38 (1), 3 (2010).
  9. Kole, R., Krainer, A. R., Altman, S. RNA therapeutics: beyond RNA interference and antisense oligonucleotides. Nat Rev Drug Discov. 11 (2), 125-140 (2012).
  10. Peacey, E., Rodriguez, L., Liu, Y., Wolfe, M. S. Targeting a pre-mRNA structure with bipartite antisense molecules modulates tau alternative splicing. Nucleic Acids Res. 40 (19), 9836-9849 (2012).
  11. Stenvang, J., Petri, A., Lindow, M., Obad, S., Kauppinen, S. Inhibition of microRNA function by antimiR oligonucleotides. Silence. 3 (1), 1 (2012).
  12. Ma, X., et al. Intracellular delivery of antisense peptide nucleic acid by fluorescent mesoporous silica nanoparticles. Bioconjugate Chem. 25 (8), 1412-1420 (2014).
  13. Wojtkowiak-Szlachcic, A., et al. Short antisense-locked nucleic acids (all-LNAs) correct alternative splicing abnormalities in myotonic dystrophy. Nucleic Acids Res. 43 (6), 3318-3331 (2015).
  14. Lenartowicz, E., et al. Antisense Oligonucleotides Targeting Influenza A Segment 8 Genomic RNA Inhibit Viral Replication. Nucleic Acid Ther. 26 (5), 277-285 (2016).
  15. Avitabile, C., et al. Targeting pre-miRNA by peptide nucleic acids: a new strategy to interfere in the miRNA maturation. Artif DNA PNA XNA. 3 (2), 88-96 (2012).
  16. Barczak, A. K., et al. RNA signatures allow rapid identification of pathogens and antibiotic susceptibilities. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (16), 6217-6222 (2012).
  17. Das, I., et al. A peptide nucleic acid-aminosugar conjugate targeting transactivation response element of HIV-1 RNA genome shows a high bioavailability in human cells and strongly inhibits tat-mediated transactivation of HIV-1 transcription. J Med Chem. 55 (13), 6021-6032 (2012).
  18. Fabani, M. M., et al. Efficient inhibition of miR-155 function in vivo by peptide nucleic acids. Nucleic Acids Res. 38 (13), 4466-4475 (2010).
  19. Riguet, E., et al. A peptide nucleic acid-neamine conjugate that targets and cleaves HIV-1 TAR RNA inhibits viral replication. J Med Chem. 47 (20), 4806-4809 (2004).
  20. Torres, A. G., et al. Chemical structure requirements and cellular targeting of microRNA-122 by peptide nucleic acids anti-miRs. Nucleic Acids Res. 40 (5), 2152-2167 (2012).
  21. Upadhyay, A., Dixit, U., Manvar, D., Chaturvedi, N., Pandey, V. N. Affinity capture and identification of host cell factors associated with hepatitis C virus (+) strand subgenomic RNA. Mol Cell Proteomics. 12 (6), 1539-1552 (2013).
  22. Wesolowski, D., et al. Basic peptide-morpholino oligomer conjugate that is very effective in killing bacteria by gene-specific and nonspecific modes. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (40), 16582-16587 (2011).
  23. Armitage, B. A. The impact of nucleic acid secondary structure on PNA hybridization. Drug Discov Today. 8 (5), 222-228 (2003).
  24. Thomas, S. M., et al. Antitumor effects of EGFR antisense guanidine-based peptide nucleic acids in cancer models. ACS Chem Biol. 8 (2), 345-352 (2013).
  25. Bahal, R., McNeer, N. A., Ly, D. H., Saltzman, W. M., Glazer, P. M. Nanoparticle for delivery of antisense gammaPNA oligomers targeting CCR5. Artif DNA PNA XNA. 4 (2), 49-57 (2013).
  26. Adams, B. D., Parsons, C., Walker, L., Zhang, W. C., Slack, F. J. Targeting noncoding RNAs in disease. J. Clin. Invest. 127 (3), 761-771 (2017).
  27. Matsui, M., Corey, D. R. Non-coding RNAs as drug targets. Nat Rev Drug Discov. 16 (3), 167-179 (2017).
  28. Devi, G., Zhou, Y., Zhong, Z., Toh, D. -F. K., Chen, G. RNA triplexes: from structural principles to biological and biotech applications. Wiley Interdiscip Rev RNA. 6 (1), 111-128 (2015).
  29. Rozners, E. Recent Advances in Chemical Modification of Peptide Nucleic Acids. J Nucleic Acids. 2012, 8 (2012).
  30. Devi, G., Yuan, Z., Lu, Y., Zhao, Y., Chen, G. Incorporation of thio-pseudoisocytosine into triplex-forming peptide nucleic acids for enhanced recognition of RNA duplexes. Nucleic Acids Res. 42 (6), 4008-4018 (2014).
  31. Toh, D. K., et al. Incorporating a guanidine-modified cytosine base into triplex-forming PNAs for the recognition of a C-G pyrimidine-purine inversion site of an RNA duplex. Nucleic Acids Res. 44 (19), 9071-9082 (2016).
  32. Li, M., Zengeya, T., Rozners, E. Short peptide nucleic acids bind strongly to homopurine tract of double helical RNA at pH 5.5. J Am Chem Soc. 132 (25), 8676-8681 (2010).
  33. Gupta, P., Zengeya, T., Rozners, E. Triple helical recognition of pyrimidine inversions in polypurine tracts of RNA by nucleobase-modified PNA. Chem Commun. 47 (39), 11125-11127 (2011).
  34. Zengeya, T., Li, M., Rozners, E. PNA containing isocytidine nucleobase: synthesis and recognition of double helical RNA. Bioorg Med Chem Lett. 21 (7), 2121-2124 (2011).
  35. Gupta, P., Muse, O., Rozners, E. Recognition of double-stranded RNA by guanidine-modified peptide nucleic acids. Biochemistry. 51 (1), 63-73 (2012).
  36. Zengeya, T., Gupta, P., Rozners, E. Triple-helical recognition of RNA using 2-aminopyridine-modified PNA at physiologically relevant conditions. Angew Chem Int Ed. 51 (50), 12593-12596 (2012).
  37. Muse, O., et al. Sequence selective recognition of double-stranded RNA at physiologically relevant conditions using PNA-peptide conjugates. ACS Chem Biol. 8 (8), 1683-1686 (2013).
  38. Hnedzko, D., Cheruiyot, S. K., Rozners, E. Using Triple Helix Forming Peptide Nucleic Acids for Sequence-selective Recognition of Double-stranded RNA. Curr Protoc Nucleic Acid Chem. 58, 61-64 (2014).
  39. Zengeya, T., Gupta, P., Rozners, E. Sequence selective recognition of double-stranded RNA using triple helix-forming peptide nucleic acids. Methods Mol Biol. 1050, 83-94 (2014).
  40. Endoh, T., Hnedzko, D., Rozners, E., Sugimoto, N. Nucleobase-Modified PNA Suppresses Translation by Forming a Triple Helix with a Hairpin Structure in mRNA In Vitro and in Cells. Angew Chem Int Ed. 55 (3), 899-903 (2016).
  41. Hnedzko, D., McGee, D. W., Karamitas, Y. A., Rozners, E. Sequence-selective recognition of double-stranded RNA and enhanced cellular uptake of cationic nucleobase and backbone-modified peptide nucleic acids. RNA. 23 (1), 58-69 (2017).
  42. Wexselblatt, E., Esko, J. D., Tor, Y. On guanidinium and cellular uptake. J Org Chem. 79 (15), 6766-6774 (2014).
  43. Kaiser, E., Colescott, R. L., Bossinger, C. D., Cook, P. I. Color test for detection of free terminal amino groups in the solid-phase synthesis of peptides. Anal. Biochem. 34 (2), 595-598 (1970).
  44. Roberts, R. W., Crothers, D. M. Stability and properties of double and triple helices: dramatic effects of RNA or DNA backbone composition. Science. 258 (5087), 1463-1466 (1992).
  45. Zhou, Y., et al. Recognition of RNA duplexes by chemically modified triplex-forming oligonucleotides. Nucleic Acids Res. 41 (13), 6664-6673 (2013).
  46. Gisin, B. F. The monitoring of reactions in solid-phase peptide synthesis with picric acid. Anal. Chim. Acta. 58 (1), 248-249 (1972).
  47. Gogoi, K., Mane, M. V., Kunte, S. S., Kumar, V. A. A versatile method for the preparation of conjugates of peptides with DNA/PNA/analog by employing chemo-selective click reaction in water. Nucleic Acids Res. 35 (21), 139 (2007).
  48. Shabanpoor, F., Gait, M. J. Development of a general methodology for labelling peptide-morpholino oligonucleotide conjugates using alkyne-azide click chemistry. Chem Commun. 49 (87), 10260-10262 (2013).
  49. Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. A Stepwise Huisgen Cycloaddition Process: Copper(I)-Catalyzed Regioselective "Ligation" of Azides and Terminal Alkynes. Angew Chem Int Ed. 41 (14), 2596-2599 (2002).
  50. Haaima, G., Hansen, F. H., Christensen, L., Dahl, O., Nielsen, P. E. Increased DNA binding and sequence discrimination of PNA oligomers containing 2,6-diaminopurine. Nucleic Acids Res. 25 (22), 4639-4643 (1997).
  51. Schroeder, S. J., Turner, D. H. Methods Enzymol. 468, Academic Press. 371-387 (2009).
  52. McDowell, J. A., Turner, D. H. Investigation of the Structural Basis for Thermodynamic Stabilities of Tandem GU Mismatches: Solution Structure of (rGAGGUCUC)2 by Two-Dimensional NMR and Simulated Annealing. Biochemistry. 35 (45), 14077-14089 (1996).
  53. Sato, T., Sato, Y., Nishizawa, S. Triplex-Forming Peptide Nucleic Acid Probe Having Thiazole Orange as a Base Surrogate for Fluorescence Sensing of Double-stranded RNA. J Am Chem Soc. 138 (30), 9397-9400 (2016).
  54. Cheruiyot, S. K., Rozners, E. Fluorescent 2-Aminopyridine Nucleobases for Triplex-Forming Peptide Nucleic Acids. ChemBioChem. 17 (16), 1558-1562 (2016).
  55. Sato, T., Sato, Y., Nishizawa, S. Optimization of the Alkyl Linker of TO Base Surrogate in Triplex-Forming PNA for Enhanced Binding to Double-Stranded RNA. Chem Eur J. 23 (17), 4079-4088 (2017).
  56. Virta, P. M., Tahtinen, V., Granqvist, L., Murtola, M., Stromberg, R. 19F NMR spectroscopic analysis of the binding modes in triple helical PNA/microRNA-complexes. Chem Eur J. , (2017).
  57. Zengeya, T., Gindin, A., Rozners, E. Improvement of sequence selectivity in triple helical recognition of RNA by phenylalanine-derived PNA. Artif DNA PNA XNA. 4 (3), 69-76 (2013).
  58. Moses, A. C., Huang, S. W., Schepartz, A. Inhibition of Rev.RRE complexation by triplex tethered oligonucleotide probes. Bioorg Med Chem. 5 (6), 1123-1129 (1997).
  59. Ben Gaied, N., Zhao, Z., Gerrard, S. R., Fox, K. R., Brown, T. Potent triple helix stabilization by 5',3'-modified triplex-forming oligonucleotides. ChemBioChem. 10 (11), 1839-1851 (2009).
  60. Grimm, G. N., Boutorine, A. S., Lincoln, P., Norden, B., Helene, C. Formation of DNA triple helices by an oligonucleotide conjugated to a fluorescent ruthenium complex. ChemBioChem. 3 (4), 324-331 (2002).
  61. Tran, T., et al. Targeting the r(CGG) Repeats That Cause FXTAS with Modularly Assembled Small Molecules and Oligonucleotides. ACS Chem Biol. , (2014).
  62. Gianolio, D. A., Segismundo, J. M., McLaughlin, L. W. Tethered naphthalene diimide-based intercalators for DNA triplex stabilization. Nucleic Acids Res. 28 (10), 2128-2134 (2000).
  63. Rumney, S., Kool, E. T. Structural Optimization of Non-Nucleotide Loop Replacements for Duplex and Triplex DNAs. J Am Chem Soc. 117, 5635-5646 (1995).
  64. Stafford, R. L., Dervan, P. B. The reach of linear protein-DNA dimerizers. J Am Chem Soc. 129 (45), 14026-14033 (2007).
  65. Gupta, A., Bahal, R., Gupta, M., Glazer, P. M., Saltzman, W. M. Nanotechnology for delivery of peptide nucleic acids (PNAs). J Control Release. 240, 302-311 (2016).
  66. Avitabile, C., et al. Incorporation of Naked Peptide Nucleic Acids into Liposomes Leads to Fast and Efficient Delivery. Bioconjugate Chem. 26 (8), 1533-1541 (2015).

Tags

Genetik sag 127 PNA triplex RNA struktur RNA duplex RNA-bindende ligander faststadie syntese ikke-denatureringen side 2-Aminopurine UV termisk smeltning Molekylær anerkendelse bindingsaffinitet store groove
Sekvens-specifikke og selektiv anerkendelse af dobbelt-strenget RNA'er over enkeltstrenget RNA'er af kemisk modificerede peptid nukleinsyrer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Toh, D. F. K., Patil, K. M., Chen,… More

Toh, D. F. K., Patil, K. M., Chen, G. Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids. J. Vis. Exp. (127), e56221, doi:10.3791/56221 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter