Methodenartikel

Verbesserte Methode für die Einrichtung einer In-vitro- Blut - Hirn-Schranke Modell auf porcinen Endothelzellen Gehirnzellen basiert

DOI:

10.3791/56277

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24. September 2017

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1Lundbeck Foundation Research Initiative on Brain Barriers and Drug Delivery, Department of Biomedicine, Aarhus University, 2Institute of Pharmaceutical Science, King's College London, 3HICoE Centre for Drug Research, Universiti Sains Malaysia

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Ziel des Protokolls ist eine optimierte Verfahren für die Einrichtung eines in-vitro- Blut - Hirn-Schranke (BBB) Modells basierend auf primäre porcinen Gehirn endothelial Zellen (pBECs) zu präsentieren. Das Modell zeigt hohe Reproduzierbarkeit, hohe Dichtigkeit und eignet sich für Studien der Transport- und intrazellulären Menschenhandel in der Wirkstoffforschung.

Zusammenfassung

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Das Ziel dieses Protokolls stellt eine optimierte Verfahren für die Reinigung und Pflege der pBECs und in-vitro- Blut - Hirn-Schranke (BBB) Modelle basierend auf pBECs in Mono-Kultur (MC), MC mit Astrozyten konditioniertes Medium (ACM), zu etablieren und berührungslose Kokulturen (NCC) mit Astrozyten von Schweinen oder Ratte Herkunft. pBECs waren isoliert und kultiviert aus Fragmenten der Kapillaren aus dem Gehirn Cortex von Hausschweinen ca. 5-6 Monate alt. Diese Fragmente wurden durch sorgfältige Entfernung der Hirnhaut, Isolation und Homogenisierung der grauen Substanz, Filtration, enzymatischen Verdauung und Zentrifugation gereinigt. Um weitere kontaminierende Zellen zu beseitigen, wurden die Kapillare Fragmente mit Puromycin-haltigen kultiviert Medium. Bei 60-95 % Zusammenfluss pBECs wächst aus der Kapillare Fragmente zu passagiert wurden durchlässige Membranfilter fügt und die Modelle gegründet. Um Barrier Dichtigkeit und BBB charakteristischen Phänotyp der pBECs zu erhöhen, wurden die Zellen mit folgenden Differenzierungsfaktoren behandelt: Membran permeationsfähigen 8-CPT-Zaatari (hier abgekürzt), Hydrocortison und ein Phosphodiesterase-Hemmer, RO-20-1724 (RO). Das Verfahren erfolgte über einen Zeitraum von 9-11 Tage, und bei der Festlegung der NCC-Modell waren die Astrozyten 2 bis 8 Wochen im Voraus kultiviert. Einhaltung der beschriebenen Verfahren des Protokolls ermöglichte die Errichtung der endothelialen Schichten mit stark eingeschränkter parazellulär Durchlässigkeit, mit NCC Modell zeigt einen durchschnittliche Transendothelial elektrischen Widerstand (TEER) 1249 ± 80 Ω cm 2, und parazellulär Durchlässigkeit (Papp) für Luzifer gelb 0,90 10-6 ± 0,13 10-6 cm s-1 (meine ± SEM, n = 55). Weitere Auswertung dieser pBEC Phänotyp zeigte guten Ausdruck der engen Knoten Proteine Claudin 5, ZO-1, occludin und Adherens Junction Proteins p120-Catenin. Das vorgestellte Modell eignet sich für eine Vielzahl von Studien der BBB in Gesundheit und Krankheit, und mit der sehr restriktive parazellulär Durchlässigkeit, eignet sich dieses Modell für Studien von Verkehr und Handel mit intrazellulären.

Einleitung

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Zelluläre Struktur und Funktion der Blut - Hirn-Schranke

An der Schnittstelle von Herz-Kreislauf und zentrales Nervensystem (ZNS) wirkt die BBB als eine wichtige regulatorische Seite für Volumenstörungen Kontrolle über die CNS Mikroumgebung, was für einwandfreie Funktion und Schutz des Nervensystems unerlässlich ist. Die Website der BBB ist die Auskleidung der Blutgefäße Lumen Endothelzellen. Im Gehirn Kapillaren Endothelzellen bilden komplexe interzelluläre enge Kreuzungen und stark polarisierten Expressionsmuster von bestimmten Zustrom und Efflux-Transporter sorgen für hochspezifische molekularen Transport zwischen dem Blut und der Gehirn- 1. Die tragenden Teile der engen Kreuzung komplexe enthalten Proteine aus der Familie occludin und Claudin, Zonula Occludens (ZO) Proteine, Cingulin und verbundenen Knoten Adhäsionsmoleküle (JAMs). Claudin-5 ist besonders wichtig in der parazellulär Knoten Einschränkung. Induktion und Wartung von diesem charakteristischen BBB endotheliale Phänotyp beinhalten dynamische Wechselwirkungen mit umgebenden Zellen, einschließlich Perizyten, Astrozyten, Neuronen und die Keller-Membranen, die zusammen mit Gehirn endothelial Zellen Form der neurovaskuläre Einheit (NVU)2,3. Die Mechanismen dieser Interaktionen beteiligt sind noch nicht vollständig geklärt, aber gehören der chemischen Signale zwischen Zellen, die Modulation der BBB Permeabilität kurzfristig und langfristig BBB Funktionen4induziert. Vor allem Astrozyten sind dafür bekannt, zu dem Gehirn endothelial Zelle Phänotyp beitragen und sind eine Quelle von regulatorischen Faktoren wie Glia-derived Neurotrophic Factor (tritt bei intrazellulären cAMP)5, grundlegende Fibroblasten-Wachstumsfaktor-6, Hydrocortison7und transformierende Wachstumsfaktor β (TGF-β)8. Die Wirkung von TGF-β, wurde jedoch diskutierten9.

Von In Vivo , In Vitro BBB

In Vivo Studien weiterhin wertvolle Informationen über BBB Biologie. Zellmodelle Kultur können jedoch zusätzliche Einblicke und stellen nützliche Werkzeuge für detaillierte molekulare und funktionelle Aspekte der BBB in Gesundheit und Krankheit zu verstehen. Obwohl die komplexen Wechselwirkungen zwischen der Zelltypen und Bestandteile der BBB in in-vitro- Modelle vollends schwierig sind, gibt es seit, die erste Reinigung des Gehirn endothelial Zellen und Anwendung dieser in Mono-Kulturen 10 , 11 , 12, umfangreiche Entwicklung der Reinigung Verfahren und Wachstumsbedingungen der BBB Zell-Kultur-Modelle, wodurch größere Ähnlichkeit mit der in-Vivo -Barriere. Die häufig verwendete in-vitro- BBB-Modelle basieren auf Primärzellen Nagetier, Schweinen und Rindern Ursprungs und auf immortalisierte Zelllinien. Jedes Modell hat verschiedene vor- und Nachteile. Für Vergleich und Modell Wahl sind Validierung Markierungen wie Ausdruck der BBB-Enzyme, Transporter, Rezeptoren und Strukturproteinen verwendet, um Übersichten über die aktuellen Modelle1zu erstellen.

Ziel des Protokolls

Ein wichtiges Merkmal der BBB Barrier Dichtigkeit und hohe TEER, aber eine große Anzahl der verfügbaren Modelle spiegeln nicht gut in Vivo -Level. Integration von Entwicklung und Optimierung Beiträge von mehreren Labors, ist das Ziel dieses Protokolls, eine Methode für den Aufbau eines hohen TEER in-vitro- BBB Modells basierend auf primäre pBECs in MC mit oder ohne ACM oder NCC mit primären präsentieren Astrozyten Ratte oder porcinen Ursprungs. Die dabei angewandten Verfahren und Etablierung des Modells gehören Bemühungen kontaminierende Zellen zu eliminieren und Differenzierung der pBECs in einem BBB-Phänotyp zu verbessern. Diese Arbeit führte zu die Einrichtung von zuverlässigen, TEER-Modelle mit niedrigen parazellulär Durchlässigkeit und gute funktionelle Expression des wichtigsten festen Knoten Proteine, Transporter und Rezeptoren. Wie die Astrozyten ein beitragender Faktor zum Gehirn endothelial Zelle Phänotypus, stellen die drei unterschiedlichen Bedingungen der Kultur jedoch drei unterschiedliche Phänotypen der Gehirn endothelial Zellen dar. Das NCC-Modell eignet sich speziell für Studien bestimmte spezielle Mechanismen in der Drogeentdeckung, Transportstudien und intrazellulären Menschenhandel, sowie für die Untersuchung von Zell-Zell-Interaktionen wo ist maximale Ausdruck der BBB-Funktionen vorteilhaft.

Ursprung und Geschichte des Protokolls

Das hier beschriebene pBEC-Modell basiert weitgehend auf dem porcinen Modell Eisai Laboratories (London) entwickelt von Dr. Louise Morgan und Kollegen, ist anhand einer erfolgreichen früheren bovine Gehirn Endothelzellen Modell13. Die ursprüngliche Methode der Zelle Vorbereitung war eine zwei-Stufen-Filtration mit Nylon Maschen um den Mikrogefäßen, gefolgt von einem subculturing Schritt zur Verbesserung der Reinheit zu fangen. In der früheren Entwicklung der Methode wurden durch Zunahme der ergänzten Form, u. a. ACM optimale BBB Phänotyp und Barrier Dichtigkeit erreicht. Weitere Änderungen an der Methode wurden von R. Skinner Prof N. Rothwell Lab in Manchester UK14,15. Die Methode wurde von Abbott Labor, KCL London angenommen wo Patabendige es deutlich einfacher machte, durch den Verzicht von Astrozyten oder ACM und durch den Wegfall von kontaminierenden Zellen wie Perizyten mit Puromycin vorzubereiten. Die ersten Papiere bestätigt, dass das MC-Modell einige wichtige Merkmale des in Vivo BBB erhalten, einschließlich der effektiven engen Kreuzungen, Membran Verkehrssysteme und Rezeptor-vermittelten Transcytosis16,17 , 18 , 19 , 20. später S. Yusof wieder Astrozyten Kokultur getestet und fand es TEER, deutlich verbessert, so ist dies die bevorzugte Variante, die derzeit in der Abbott Labor21verwendet. Das Modell wurde erfolgreich übertragen, M. Nielsen Lab in Aarhus, wo weitere Änderungen wurden eingeführt (das Protokoll), einschließlich der Vereinfachung grau Rolle, Extraktion, mit nur einem Netz von Filtrationsschritt und einen einzelnen Filter Beschichtung Schritt Kombination von Kollagen und Fibronektin. Das angewandte Verfahren zur Isolierung von porcinen Astrozyten (dieses Protokoll) beruhte auf Protokolle von T. Moos Labor in Aalborg, beschrieben von Thomsen Et al.22entwickelt. Der TEER und andere Eigenschaften des Modells erzeugt in London und Aarhus sind ähnlich, die verleiht Vertrauen auf den Begriff, den das Modell ohne weiteres zwischen Labors übertragen und reagiert gut auf die sorgfältige Beobachtung und Rationalisierung der Verfahrensschritte. In der Tat hat S. Yusof jetzt das MC-Modell in einem tropischen Land (Malaysia)23, die weitere Anpassung für die örtlichen Gegebenheiten und Gewebe Quellen beteiligt.

Vorteile gegenüber alternativen Methoden und derzeit etablierte Modelle

Im Vergleich zum Gehirn endothelial Zellen Nagetier und bovinen Ursprungs, bieten pBECs den Vorteil, dass eine niedrigere Rate des Verlustes der in Vivo BBB-Phänotyp nach Isolierung24. Darüber hinaus sind pBECs in der Lage, relativ enge endotheliale Barrieren zu bilden, auch wenn Sie in MC (800 Ω cm2)16 im Vergleich zu den häufigsten berichteten Kosten von Monolagen Zell-Linien wie bEND.5 und bEND.3 (50 Ω cm2) angebaut 25 , 26 , 27, dende (300-800 Ω cm2)28,29,30, und CerebEND (500 Ω cm2)29,31,32und primäre Gehirn endothelial Zellen der Maus (100-300 Ω cm2)SS = "Xref" > 33,34,35,36 und Ratte (100-300 Ω cm2)37,38. Allerdings hat der TEER Abhängigkeit auf die Reinigung und Kultur Verfahren dargestellt. In den meisten Fällen zeigt die Zugabe von ACM oder Kokultur mit Astrozyten differenzierende Wirkung auf die Endothelzellen und eine Erhöhung in Dichtigkeit der endothelialen Schichten1. Trotzdem, mit Bemühungen um die Kultivierung Bedingungen zu optimieren, nur die Rinder-basierte Modelle haben gezeigt TEER Werten vergleichbar mit der Schweine-basierte Modelle (Durchschnitt von 800 Ω cm2 MC, bis zu 2500 Ω cm2 in Astrozyten Kokultur)13 ,39,40,41,42,43,44,45. Wie die Modelle basierend auf primäre bovine Gehirn haben endotheliale Zellen gezeigt große Unterschiede, sowohl zwischen als auch innerhalb von Laboratorien14,45,46,47,48, Reproduzierbarkeit könnte ein Problem sein. Im pBEC Modell hier berichtet haben der beteiligten Laboratorien mit geringer Variabilität, sowohl in als auch zwischen den Labors sehr ähnlich wie TEER und parazellulär Permeabilität Werte erreicht. Daher sollte es für andere Labors, ein robustes Modell mit geringer Variabilität, mit der hier vorgestellten Methode möglich. Neben enge endotheliale Schichten bilden, wurden Modelle mit pBECs vorher durch Expression von tight Junction-Proteine, funktionale BBB-Transporter, Rezeptoren und Enzymen und nachgewiesene Eignung für verschiedenste Studien15 validiert , 16 , 17 , 19 , 20 , 22 , 49 , 50 , 51 , 52 , 53 , 54 , 55 , 56 , 57 , 58 , 59. Außerdem unveröffentlichte Transkriptom-Daten auf die Ko-Kulturen von pBECs zeigt eine erwartete Profil der BBB-Transportern und Rezeptoren (unveröffentlichte Ergebnisse, Nielsen Et Al.).

Schweine-basiertes BBB-Modell hat einen weiteren Vorteil als Genom, Anatomie, Physiologie und Fortschreiten der Krankheit des Schweins reflektieren die Humanbiologie in höherem Maße als andere etablierte Modelle verfügt über60, die günstig sind für die pharmazeutischen Industrie. Da Schweine Gehirne gemeinsame Nebenprodukt der Fleischindustrie sind, bilden sie eine leicht zugängliche Quelle des Gehirns Endothelzellen, minimieren die Anzahl der Tiere für die Experimente benötigt, und bietet einen hohen Reinigung Ertrag aus einem porcinen Gehirn. Obwohl Reinigung und Pflege von Primärzellen ist etwas zeitaufwändig und erfordert Know-how für Standardisierung bei der Einrichtung des Modells, generieren Primärzellen die zuverlässigste BBB-Modelle. Immortalisierte Zelllinien können nicht Ersatz, als wichtige Eigenschaften sein, wie z. B. Barriere Engegefühl, Transporter Expressionsprofile und Mikroumgebung Verordnung nicht entsprechen die experimentelle Befunde in Vivo61, 62. in-vitro- Modelle bieten den Vorteil von live-Cell imaging mit höherer Auflösung, die Visualisierung von intrazellulären Prozessen ermöglichen dadurch, dass einen unmittelbarer Nähe Ansatz für die Stichproben oder beobachteten Zellen, mit Zielen mit höheren Vergrößerung und bessere optische Qualität63. Dies gilt nicht für die Verwendung von zwei-Photonen-Mikroskopie in lebenden Tieren. Des weiteren bieten in-vitro- Modelle die Möglichkeit, Zellen, erlaubt Visualisierung von tagged Proteine und Untersuchung ihrer Menschenhandel transfizieren.

Anwendungen des Modells

Die Funktion der BBB ist nicht festgelegt und kann dynamisch in Physiologie und Pathologie moduliert werden. Bei vielen neurologischen Krankheiten, einschließlich Neurodegenerative entzündliche und infektiöse Erkrankungen, Störungen und erhöhte Durchlässigkeit der BBB beobachtet64,65,66,67 . Um zu verringern und Fortschreiten der Krankheit und Folgeschäden zu verhindern, sind die Identifizierung und Charakterisierung der molekularen Mechanismen der Modulation der BBB von großer Bedeutung. In diesem Zusammenhang zuverlässige in-vitro- Modelle sind in der hohen Nachfrage durch die pharmazeutische Industrie, und außerdem eine wichtige Rolle bei der Vorhersage des BBB Permeabilität von Drogen an die CNS. Jedes in-vitro- Modell als eine Durchlässigkeit Bildschirm sollte eine restriktive parazellulär Weg, eine physiologisch realistische Zellarchitektur und funktionelle Expression von Transporter Mechanismen68anzeigen. Zeigte, in früheren Studien16,17,57, und durch parazellulär Durchlässigkeit und Ausdruck der TJ und AJ Proteine hier das vorgestellte Modell erfüllt alle diese Kriterien und eignet sich für eine Reihe von BBB Studien in beiden normalen Physiologie und Pathologie. Die Stärken der die vorgestellte Methode der Reinigung und Pflege sind eine Kombination aus Einfachheit und Reproduzierbarkeit und die Möglichkeit, astrocytic zu beeinflussen, mit einem daraus resultierenden robust und zuverlässig hohe TEER in-vitro- BBB-Modell. Für diesen Zweck, Astrozyten von Schweinen und Ratte Ursprung haben gezeigt, dass die BBB-Phänotyp der pBECs in einer ähnlichen Art und Weise22ergänzen.

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Protokoll

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porcinen Gehirne wurden als Nebenprodukte der dänischen Lebensmittelindustrie erhalten. Dänischen Schlachthöfen sind unter strenger Überwachung und Beobachtung durch das dänische Ministerium für Umwelt und Lebensmittel.

Ratten für die Isolierung von Astrozyten verwendet wurden gezüchtet und in den lokalen Tierhaus bei einer Umgebungstemperatur von 22 ° C - 23 ° C und auf einem 12/12 h hell/dunkel-Zyklus unter Kontrolle des Tierarztes und nach Dänisch Gruppe untergebracht Vorschriften für Labortiere. Die Ratten wurden eingeschläfert, bevor sie nach internationalen Richtlinien für die ethische Verwendung von Tieren (Richtlinie Europäischen Gemeinschaften der 24. November 1986; 86/609/EWG) und dänische Richtlinien geopfert wurden. Keine in-Vivo-Experimente an Tieren oder menschlichen Material wurden in diesen Experimenten verwendet.

Hinweis: im folgenden ist ein pBEC wichtigsten Protokoll beschreiben (Schritt 1) Reinigung, Anbau (Schritt2) und (Schritt 3) TEER Messungen. Für die Einrichtung von NCC mit Astrozyten, eine Alternative Protcol (Schritt 4) beschreiben, Reinigung und Pflege von Ratten und Schweinen Astrozyten vorgestellt.

1. Reinigung von porcinen Gehirn Kapillaren

  1. 8-10 Gehirne von 5-6-Monate-alten Hausschweine (z.B. aus einem nahe gelegenen Schlachthof) sammeln und transportieren sie auf dem Eis ins Labor. Wir empfehlen die folgenden Reinigungsprozedur innerhalb 2-3 h nach Beendigung des Tieres ab.
  2. Die Köpfe in einer sterilen Fluss Bank legen und vorsichtig waschen mit PBS 1 L in ein Becherglas auf Eis gelegt
  3. Sorgfältig entfernen Hirnhaut aus einem Gehirn zu einem Zeitpunkt mit feinen Spitze Pinzette und übertragen die Hirnhaut-freie Köpfe auf einem anderen 1 L Becher mit PBS auf Eis gelegt. Verlängert die Verarbeitungszeit kann die Entfernung erschweren. Die ungefähre Zeit für jedes Gehirn sollte 10-15 min.
  4. Mit einem Skalpell, abkratzen grauen Zellen aus einem Gehirn gleichzeitig und übertragen das isolierte Material auf Petrischalen (8,8 cm 2) mit 20 mL DMEM Nährstoff Gemisch f-12 (DMEM/F-12) auf Eis gelegt. Wie viel grauen Substanz wie möglich ohne Aberkennung der weißen Substanz Material isolieren. Durchlaufen Sie für erste Fragmentierung die grauen Zellen Material eine 50 mL Spritze ohne Nadel. Weiter um die Köpfe und die gesammelten grauen Material zu bündeln. Verlängert die Verarbeitungszeit kann die Entfernung erschweren. Die ungefähre Zeit für jedes Gehirn sollte 10-15 min.
  5. Übertragung der isolierten grauen Material mit dem Schleifer-Rohr von einem Handheld Gewebe Homogenisator in einem Verhältnis von 50/50 mit DMEM/F-12 Medien. Das Material durch die 8 nach oben und unten Striche mit einem losen Stößel, gefolgt von 8 nach oben und unten Striche mit einem engen Stößel zu homogenisieren. Weiter bis alle isoliert Material homogenisiert worden, dann übertragen Sie das Homogenat auf eine 500-mL-Flasche und verdünnen mit DMEM/F-12 auf ca. 450 mL Gesamtvolumen.
  6. Filtern das Homogenat über eine 500-mL-blau-Cap-Flasche mit Filterhalter und 140 µm Filter-Mesh und Kapillaren zu isolieren, indem man das Gewebe durch den Filter. Verwenden Sie einen Filter pro 50 mL Homogenat und waschen Sie danach jeden Filter mit DMEM/F-12.
  7. Ort der Kapillare mit Filter in Petrischalen mit einem Aufschlusslösung Trypsin/EDTA (2,5 % Trypsin, 0,1 nM EDTA mit PBS-Puffer), Kollagenase CLS2 (2.000 U/mL) und DNase 1 (3.400 U/mL) in DMEM/F-12. Verwenden Sie 1 Petrischale (8,8 cm 2, 20 mL Lösung) pro 3 Filter Netze.
  8. Legen Sie die Petrischalen bei 37 ° C für 1 h auf einem Orbitalschüttler mit 180 u/min oder rühren Sie sie vorsichtig alle 10 Minuten. Nach 1 h, die Kapillaren von den Filtern mit Suspension aus der Petrischale mit einer 1 mL-Pipette abwaschen.
  9. 2 50-mL-Tuben die Suspension aus 3 Platten aufgeteilt und die Verdauung zu stoppen, indem Sie 10 mL DMEM/F-12 zu je 50-mL-Tube.
  10. Der Zellsuspensionen Zentrifuge bei 250 X g, 4 ° C für 5 min. aspirieren Sie die Überstände und hängen Sie wieder jedes Pellet in 10 mL DMEM/F-12. Jedes Rohr eine weitere 20 mL DMEM/F12 hinzufügen. Wiederholen Sie diese Schritt, Zentrifuge zweimal.
  11. Lassen Sie die Röhren für 5 min auf Eis abgekühlt und übertragen Sie die Lösungen auf 2 neue 50 mL Röhrchen.
  12. Zellsuspensionen bei 250 X g, 4 ° C für 5 Minuten Zentrifugieren, und hängen Sie wieder jedes Pellet in 8-10 mL (ca. 1 mL/Gehirn verwendet) Einfrieren Lösung bestehend aus 10 % DMSO in FBS.
  13. Übertragen die Zellsuspension auf Cryovials, mit 1 mL pro Cryoröhrchen. Im Durchschnitt führt eine Reinigung 1 Fläschchen pro Gehirn verwendet, im Durchschnitt die Endothelzellen für 12-16 Einsätze. Legen Sie die Fläschchen in einer eisigen Box bei-80 ° C für mindestens 4 h bis zur Übernachtung. Danach die Cryovials in eine Cryotank mit flüssigem Stickstoff aufbewahren.
    Achtung: Flüssigstickstoff hat extrem niedrige Temperaturen. Bitte tragen Sie geeignete Schutzmaßnahmen.

2. Anbau von primären pBECs (8-10 Tage)

  1. Ursprüngliche Kultur (3-5 Tage)
    Tag1
    1. die Voraussetzungen für die Befestigung der pBECs, Optimierung durchführen Beschichtung einer T75 Flasche durch Hinzufügen einer Lösung mit Finale Konzentrationen von Kollagen IV (150 µg/mL) und Fibronektin (50 µg/mL) in DdH 2 O in den Kolben, um sicherzustellen, dass die Lösung die ganze Oberfläche bedeckt. Verwenden Sie 10 mL für jedem T75 Kolben. Inkubation bei 37 ° C für 2 h
      Hinweis: Die Beschichtung kann kurz vor dem Einsatz oder bis zu einer Woche vor durchgeführt und mit PBS bei 4 ° c gelagert Die Beschichtung darf nicht austrocknen, oder es wird nicht mehr eine geeignete Anlage und Wachstum Oberfläche bilden.
    2. PBEC Wachstum vorbereiten 16 mL Medium bestehend aus DMEM/F-12 ergänzt mit 10 % Plasma gewonnenen Serum (PDS), Penicillin (100 U/mL), Streptomycin (100 µg/mL) und Heparin (15 U/mL). Ergänzen Sie das Medium mit Puromycin (4 µg/mL) für endothelial Zellen auswählen. Beachten Sie, dass die Puromycin-Behandlung nur für maximal 5 Tage verwendet werden kann.
    3. Aliquot das vorbereitete Medium in 6 mL und 10 mL Volumen in zwei 15 mL-Tuben.
    4. Bringen Sie ein Fläschchen mit Kapillaren von flüssigem Stickstoff (Schritt 1.13) und tauen die Kapillaren durch Verwendung von 37 ° C Wasserbad oder durch Hinzufügen von 750 µL des Mediums vorbereitet von der 6-mL-aliquoten. Wenn Auftauen durch Zugabe von Medium, pipette vorsichtig rauf und runter zu tauen und die Aussetzung zu homogenisieren. Wenn aufgetaut, übertragen die Zellsuspension auf 6 mL Medium aliquoten.
    5. Entfernen Sie Einfrieren Medium spin die Kapillaren unten 250 X g, 4 ° C für mind. 7
    6. Vorsichtig Aspirieren den Überstand und erneut das Pellet in 1-2 mL 10-mL-aliquoten auszusetzen. Wenn wieder ausgesetzt, die Lösung 10mL Medium aliquoten übertragen.
    7. Übertragen die Kapillare Suspension in den beschichteten T75 Kolben und sanft neigen Sie die Flasche um gleichmäßige Verteilung über der Oberfläche zu gewährleisten. Legen Sie den T75 Kolben bei 37 ° C, 5 % CO 2.
      Tag 2
    8. Nach der Inkubation über Nacht 10 mL pBEC Wachstumsmedium ergänzt mit Puromycin (4 µg/mL) für eine T75 Kolben vorbereiten und durchführen eine mittlere Änderung. Beachten Sie, dass alle mittlere Lösungen auf Zellen angewendete vorgewärmt auf 37 ° C vor dem Gebrauch sein sollten.
      Hinweis: Alternativ kann eine mittlere Änderung sein durchgeführten 4-6 h Post-Beschichtung bei der Kapillaren auf der Oberfläche angebracht haben sollte. Inkubieren Sie die Zellen bis 60-95 % Zusammenfluss, in der Regel 3-5 Tage vom Auftauen erreicht ist. Tun nicht allow Zellen erreichen 100 % Zusammenfluss Vermeidung von Kontakt-Hemmung, die stoppen, können weitere Zellwachstum.
      Tag 4-6
    9. Wenn die gewünschte Konfluenz erreicht ist, Durchgang der Endothelzellen, durchlässige Membran Einsätze (siehe Abschnitt 2.2). Wenn die gewünschte Konfluenz am 4. Tag nicht erreicht wird, erfolgt die Medienwechsel. Spätestens am 6. Tag sollten Zellen an die durchlässige Membran Einsätze passagiert. Wenn die erforderliche Konfluenz von Tag 6 nicht erreicht wird, die Zellen sind nicht geeignet für Versuchszwecke.
      Hinweis: Vorbereitung der Astrozyten für NCC: beim Einrichten der Kokultur Modell, 2 - 8 Wochen alten Astrozyten in Kultur (siehe Abschnitt 4) sollten vorbereitet sein Kokultur Modell durch eine mittlere Änderung am Vortag Passagierung Endothelzellen auf Einsätze durchführen. Für jede Astrozyten vorzubereiten, 1500 µL Astrozyten Wachstumsmedium bestehend aus DMEM niedrige Glukose ergänzt mit 10 % FBS, Penicillin (100 U/mL) und Streptomycin (100 µg/mL) und führen Sie dann die mittlere Änderung.
  2. Wachstum von pBECs auf durchlässige Membran fügt (5 Tage)
    Tag 4-6
    1. Prepare durchlässige Membran Einsätze (12-Well-Platte mit Einsätzen von 1,12 cm 2 Fläche, 0,4 µm-Poren) für Aussaat von pBEC durch die Beschichtung mit Kollagen IV (500 µg/mL) und Fibronektin (100 µg/mL) in DdH 2 O. Einsatz ca. 300 µL für jede einfügen, und stellen Sie sicher, dass die Lösung der wachsenden vollflächig abdeckt. Inkubation bei 37 ° C, 5 % CO 2 für ein Minimum von 2 h.
    2. 30 mL pBEC Wachstumsmedium vorbereiten (Medienkomposition, finden Sie in Abschnitt 2.1.2) ohne Puromycin.
    3. Aspirieren von pBEC Kultur in T75 Kolben Mittel- und sanft waschen zweimal mit 5 mL sterilem PBS bei Raumtemperatur.
    4. Trypsinize der Zellen durch Zugabe von 2 mL Trypsin-EDTA-Lösung (2,5 % Trypsin, 0,1 nM EDTA mit PBS-Puffer), T75, und legen Sie die Flasche bei 37 ° C, 5 % CO 2 für ca. 5-7 min.
    5. Die Gehirn endothelial Zellen zu trennen, tippen Sie sanft auf der Seite des Kolbens mit den Fingerspitzen, schließlich verlassen Überlebende und stärkere Befestigung Perizyten auf der Oberfläche der Küvette T75. Visuell Ablösung unter dem Mikroskop zu untersuchen. Wenn 80 % Distanz beobachtet wird, nicht mehr Trypsinization durch Zugabe von 5 mL Medium.
    6. Übertragen die Zelle-Lösung auf eine 15 mL-Tube mit 10 mL-Pipette und Spin die Gehirn endothelial Zellen durch Zentrifugation bei 250 X g, 4 ° C für 7 Minuten.
    7. Sorgfältig entfernen den Überstand und das Pellet in 1mL Medium Aufschwemmen. Wenn angehalten, fügen Sie eine weitere 2 mL Medium bringen das Gesamtvolumen auf 3 mL
    8. die Anzahl der Zellen manuell mittels einer Zelle zählen Kammer oder eine automatische Zelle Zählsystem. Bereiten Sie eine Zelle Lösung von 2,2 x 10 5 Zellen/mL Medium, was zu einer endgültigen Aussaatdichte von 1,1 x 10 5 Zellen/einfügen.
    9. Die durchlässige Membran Einsätze Beschichtungslösung entnehmen und 500 µL Zellsuspension auf jeder Einsatz übertragen. Auf einem der Einsätze, fügen Sie nur Medium und verwenden diese Einlage als eine ' filtern nur ' Kontrolle für die TEER-Messungen.
    10. Stellen die Endothelzellen in MC, MC mit ACM, oder NCC mit Astrozyten in folgender Weise:
      1. für MC: fügen Sie 1500 µL pBEC Wachstum Mittel-/ACM pro Bohrloch 12-Well-Platte unter die durchlässige Membran-Einsätze. Legen Sie die durchlässige Membran-Einsätze bei 37 ° C, 5 % CO 2 und inkubieren Sie für 2 Tage.
      2. Für NCC: Transfer Einsätze zu Brunnen mit Astrozyten mit Astrozyten Wachstumsmedium aktualisiert am Vortag. Legen Sie die durchlässige Membran-Einsätze bei 37 ° C, 5 % CO 2 und inkubieren Sie für 2 Tage.
        Hinweis: Beachten Sie die Verwendung von verschiedenen Medien-Typen in den unteren Brunnen der drei Modelle.
        Tag 6-8
    11. Am 2. Tag, wechseln Sie das Medium auf die durchlässige Membran-Einsätze mit pBECs. Bereiten Sie 500 µL pBEC Wachstumsmedium pro einfügen, und sorgfältig durchführen der Änderung zur Minimierung von Störungen der Zellschicht. Zwei Tage inkubieren Sie die Zellen. Beachten Sie, dass der Medienwechsel auf Einsätze nur, und nicht auf unteren Brunnen durchgeführt wird.
  3. Stimulation mit Differenzierungsfaktoren (1-2 Tage)
    Tag 8-10
    1. für jede der verschiedenen Modelle, Stimulation Medien sollten wie folgt vorbereitet werden:
      1. für MC: für jede einfügen und bereiten nun, 500 µL pBEC Wachstumsmedium mit Lager (250 µM), Hydrocortison (550 nM) und RO (17,5 µM).
        MC: Bereiten Sie zusätzlich 1500 µL pBEC Wachstumsmedium mit Lager (250 µM), Hydrocortison (550 nM) und RO (17,5 µM).
        MC mit ACM: 1500 µL ACM Auftauen und ergänzen es mit Lager (250 µM), Hydrocortison (550 nM) und RO (17,5 µM).
      2. Für NCC: für jeden Einsatz vorbereiten 500 µL pBEC Wachstumsmedium mit Lager (250 µM), Hydrocortison (550 nM) und RO (17,5 µM). Für jedes gut Astrozyten bereiten 1500 µL DMEM/F-12 ergänzt mit Penicillin (100 U/mL) und Streptomycin (100 µg/mL), Heparin (15 U/mL), Lager (250 µM), Hydrocortison (550 nM) und RO (17,5 µM).
    2. Für jede der verschiedenen Modelle, Datenträgeraustausch wie folgt durchführen:
      1. für MC: vorsichtig Aspirieren Medium aus Brunnen und Einsätze und beide Fächer mit 500 µL für jeden Einsatz die Differenzierung Medium hinzufügen und 1500 µL für jedes gut. Beachten Sie, dass Störungen auf beiden Seiten des Einsatzes der Zellschicht zu stören und beeinflussen kann.
      2. Für NCC: vorsichtig Aspirieren Medium aus Brunnen und 750 µL Differenzierung Medium pro Bohrloch hinzufügen. Vorsichtig aspirieren Sie Medium von Einsätzen und fügen Sie 500 µL Differenzierung Medium pro einfügen hinzu. Fügen Sie dann die restlichen 750 µL Differenzierung Medium zu jedem Astrozyten gut.
    3. Für alle Modelle: Legen Sie die Zellen bei 37 ° C, 5 % CO 2 und inkubieren mit Differenzierung Medium bis zum nächsten Tag.
      Hinweis: Beachten Sie, dass für die NCC mit Astrozyten, Astrozyten ab diesem Zeitpunkt in serumfreien Medium gehalten sind.

3. TEER-Messungen

  1. am Tag nach anregende Zellen mit Differenzierung Medium, bereiten das Gewebe Widerstand Kammer Messsystem für TEER Messungen durch Spülen der Kammers zwei Mal mit DdH 2 O, einmal mit 70 % EtOH für 5 min und 2 weitere Male mit DdH 2 O.
  2. Der Gewebe Widerstand Messkammer 4 mL DMEM/F-12 hinzu, an das System anschließen und kalibrieren für ca. 30 min nach der folgenden Einstellungen: R = 0, Test R = 1000, Modus = R.
  3. Die TEER-Messungen durchführen, indem man sorgfältig die Einsätze in der Messkammer Gewebe Widerstand. Für jeden Einsatz, führen Sie Messungen in dreifacher Ausfertigung und berechnen Sie die durchschnittliche Ω cm 2.
    Hinweis: Für das Modell Kokultur TEER Werte werden voraussichtlich erreichen > 500 Ω cm 2. Wenn der entsprechende TEER nicht am ersten Tag zur Messung der TEER erreicht ist, fügen Sie neue Differenzierungsfaktoren (cAMP (250 µM), Hydrocortison (550 nM) und RO (17,5 µM)) und TEER wieder am folgenden Tag zu messen. Bei geeignete Ebenen erreicht werden, sollte das Modell bereit für das geplante Experiment. Beachten Sie, dass die Zellen für mindestens 3 h ruhen sollte, bevor Sie das Experiment für die Wiederherstellung nach TEER Messungen durchführen. Nach der Stimulation, TEER-Werte im allgemeinen bleiben akzeptabel für 24-48 h nach Stimulation.
    Hinweis: Eine alternative und schnellere Methode mit der starren STX - 100C-Elektrodenpaar auch zeichnet hohe TEER in diesem Modell 81. Das flexible STX2 eleCtrode paar gibt weniger zuverlässige Messwerte.

4. Vorbereitung von ASTROZYTEN für berührungslose KOKULTUR: Alternative Methode

  1. Reinigung der Astrozyten
    1. für jede Ratte Gehirn verwendet, Mantel 2 T75 Fläschchen durch Zugabe von 10 mL Poly-L-Lysin (5 µg/mL) in DdH 2 O zueinander T75 Kolben. Inkubieren Sie die Fläschchen bei 37 ° C für 30 min.
    2. Isolierung der Astrozyten kann wie folgt durchgeführt werden:
      1. Ratte Astrozyten:
        1. enthaupten 2 1 - 2 Tage alten Ratten mit einer anerkannten Methode.
        2. Schneiden Sie die Haut vor den Schädel vom Hals in Richtung Nase ab und schneiden Sie die Knochen mit einen sagittalen Schnitt.
        3. Mit gebogenen Pinzette den Schädel zu öffnen, nehmen Sie das Gehirn und legen Sie sie in einer 15 mL Tube (Röhre 1) mit 11 mL DMEM niedrige Glukose ergänzt mit 10 % FBS und Gentamycin Sulfat (125 µg/mL).
        4. Sorgfältig Hirnhaut mit feinen Spitze Pinzette zu entfernen und das Gehirn-Material mit einer 1-mL-Pipette aussetzen.
      2. Porcinen Astrozyten:
        1. erhalten 1 Gehirn aus einem 5-6-Monate-alten Hausschwein.
        2. Entfernen Sie vorsichtig aus dem Gehirn mit feinen Spitze Pinzetten und/oder Hände Hirnhaut.
        3. Sammeln 4 g graue Angelegenheit aus dem Gehirn und legen Sie die Stücke in 1-2 mL DMEM niedrige Glukose ergänzt mit 10 % FBS und Gentamycin Sulfat (125 µg/mL) in einer Petrischale. Wenn die Stücke groß sind, Hackfleisch mit Skalpell oder Zange.
        4. Unterbrechen das isolierte Material mit einer 1-mL-Pipette, verschieben Sie sie in eine 15-mL-Tube (Röhre 1) und füllen mit niedrigen Glukose DMEM mit 10 % FBS und Gentamycin Sulfat (125 µg/mL) auf ein Gesamtvolumen von 11 mL ergänzt.
        5. Weiter Homogenisierung der isolierten Materials mit einer langen Nadel an einen 10-mL-Spritze befestigt und nach oben und unten 3 Mal aussetzen. Warten Sie, bis die großen Stücke in den Boden des Röhrchens niedergelassen haben, dann sammeln Sie 7 mL Medium von der Spitze des Schlauches (Rohres 1).
        6. Filter 7 mL Zellsuspension durch einen 40 µm-Nylon-Filter in eine neue 50-mL-Tube (Röhre 2).
        7. Hinzufügen 7 mL Medium Schlauch 1 mit dem Gehirn. Die Homogenisierung und Filtration von Schritte 4.1.2.2.5-6 fortgesetzt, bis das Volumen der gefilterten Zellsuspension in Rohr 2 ca. 35 mL ist.
    3. Die Beschichtungslösung aus den T75 Kolben [Schritt 4.1.1] zu entfernen. Eine schnelle Reinigung mit 5 mL PBS nach Inkubation mit Poly-L-Lysin kann verwendet werden, um sicherzustellen, dass die Zellen von giftigen Effekten von der Beschichtungslösung nicht geschädigt werden.
    4. Teilen und Samen isolierte Astrozyten Lösung gleichmäßig zwischen T75 Fläschchen. Inkubieren Sie die Fläschchen bei 37 ° C, 5 % CO 2 für 3-5 Tage.
  2. Kultivierung Astrozyten und Vorbereitung NCC mit Endothelzellen (3 Wochen)
    1. Ursprüngliche Kultur
      1. nach 3-5 Tagen Inkubation, führen Sie eine mittlere Änderung durch sorgfältig Absaugen von Medium und Hinzufügen von 10 mL der niedrige Glukose DMEM mit 10 % FBS und Gentamycin Sulfat (125 µg/mL) ergänzt.
        Hinweis: Nach der ersten mittlere Änderung Medium alle 5 Tage gewechselt werden. In den ersten 2 Wochen schütteln Sie die Fläschchen und waschen Sie die Zellen gründlich mit PBS, wenn das Medium wechseln. Dies hilft bei der Entfernung von kontaminierenden Mikroglia.
      2. Nach 3 Wochen des Anbaus die Zellen durch Zugabe von 2 mL Trypsin-EDTA-Lösung an der Unterseite von jedem T75 Kolben, trypsinize und inkubieren sie bei 37 ° C, 5 % CO 2 für ca. 5-7 min.
      3. Trypsinization durch Zugabe von 5 mL Medium zu stoppen, die Zelle-Lösung für eine 15 mL Tube übertragen und Zentrifugieren der Astrozyten bei 250 X g, 4 ° C für 7 min.
      4. Sorgfältig überstand zu entfernen und wieder auszusetzen, die Zellen im eiskalten Lösung bestehend aus 10 % DMSO in FBS.
      5. Die Anzahl der Zellen und bereiten Sie eine Zelle Lösung von 4.0 x 10 6 Zellen/mL. Einfrieren der Zellen in Cryovials 1 mL pro Fläschchen hinzufügen.
    2. Wachstum in durchlässige Membran einfügen System unten Wells (2-12 Wochen)
      1. Wachstum der Astrozyten durch Zugabe von 1 mL der Poly-L-Lysin (5 µg/mL) in DdH 2 O in jede Vertiefung 12-Well Platten vorbereiten. Legen Sie die Platten bei 37 ° C für 2 h
      2. Vorbereitung jedes 12-Well-Platte, 25 mL von Astrozyten Wachstumsmedium (DMEM niedrige Glukose mit 10 % FBS und Penicillin (100 U/mL) und Streptomycin (100 µg/mL) ergänzt).
      3. Bringen die Phiole der Astrozyten aus flüssigem Stickstoff und Auftauen der Zellen durch Zugabe von 750 µL DMEM niedrige Glukose Medium. Pipette vorsichtig rauf und runter zu tauen und die Aussetzung zu homogenisieren. Wenn aufgetaut, übertragen die Zellsuspension auf eine 15-mL-Tube und einem Volumen von 7 mL Medium hinzufügen.
        Achtung: Flüssigstickstoff ist extrem niedrige Temperaturen, so tragen Sie persönliche Schutzausrüstung wie Handschuhe.
      4. Entfernen Sie Einfrieren Medium spin die Kapillaren unten 250 X g, 4 ° C für mind. 7
      5. Sorgfältig Aspirieren überstand und wieder auszusetzen, die Zellen im Medium.
      6. Entfernen Sie die Beschichtung aus den Brunnen der 12-well-Platten und die Zellsuspension in Vertiefungen mit 1 mL pro Bohrloch zu übertragen. Inkubation der Zellen bei 37 ° C, 5 % CO 2.
      7. Aktualisieren das Medium jeden dritten Tag und für mindestens 2 Wochen vor der Verwendung der Zellen für Kokultur mit Endothelzellen Kulturzellen. Die Zellen für Kokultur für bis zu 12 Wochen nach dem Auftauen mit dem optimalen Alter 2 bis 8 Wochen einsetzbar.

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Ergebnisse

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Gründung der BBB In-vitro- Modelle

In der vorgestellten, optimierte Methode Anbau von pBECs und die Errichtung des durchlässige Membran einfügen mit MC oder ohne ACM oder NCC mit Astrozyten (Abbildung 1) für einen Zeitraum von 9 bis 11 Tagen (Abbildung 2) erfolgte. Für die Auswahl von Endothelzellen, wurde eine erste Kultur der gereinigten Kapillare Fragmente komb...

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Diskussion

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Reinigung und Verbreitung von pBEC

Während die Reinigungsprozedur gehören wichtige Schritte schnelle und wirksame Beseitigung der Hirnhaut und Trennung der weißen und grauen Materie, die wichtig für die Reinigung Ausbeute und Reinheit und für den richtigen Aufbau des Modells ist. Für die vorgestellten in-vitro- BBB-Modell mit pBECs haben wir verbessert und vereinfacht eine Reinigungsprozedur basierend auf mechanische Homogenisierung der isolierten graue Substanz, Größe-selektive Filterun...

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Offenlegungen

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Die Autoren berichten keinen Interessenskonflikt.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren möchten Elisabeth Helena Bruun, Sarah Christine Christensen und Niels M. Kristiansen für technische Hilfe anerkennen, und die Lundbeck-Stiftung gewähren Anzahl R155-2013-14113.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
FibronektinSigma-AldrichF1141
Kollagen IVSigma-AldrichC5533
Poly-L-LysinSigma-AldrichP1524
DMEM/F-12LonzaBE12-719F
DMEM/Low GlucoseSigma-AldrichD6046
Penicillin/StreptomycinGibco Invitrogen15140
Aus Plasma gewonnenes Serum (PDS)First Link UK Ltd.60-00-89
Fötales Rinderserum (FBS)Gibco Invitrogen10-270-106
Trypsin/EDTAGibco Invitrogen15090-046
HeparinSigma-AldrichH3393
PuromycinSigma-AldrichP8833
HydrocortisonSigma-AldrichH4001
8-CPT-cAMPBiologC010
RO 20-1724Sigma-AldrichB8279
Gentamicin SulfateLonza17-518Z
DMSOSigma-Aldrich34896
PBSSigma-AldrichD8537
EtOHVWR20,824,296Mischen Sie die 70 %ige Lösung aus dem 96 %igen EtOH
DNAse 1Sigma-AldrichD4513
Kollagenase CLS2Sigma-AldrichC6885
ddH2OHergestellt mit Elga System
T75 KolbenThermo Scientific156499
Costar Transwell-Einsätze (Zellpermeable Membraneinsätze)CostarCLS340112-Well-Platte, 12 mm Durchmesser, 0,4 μ m Polycarbonat-Membran
15 ml ZentrifugenröhrchenCellstar188271
50 ml ZentrifugenröhrchenCellstar227261
PetrischalenThermo Scientific150350
KryofläschchenThermo Scientific377224
500 ml FlascheThermo Scientific159910/159920
SkalpelleSwann-MortenREF0211Typ 24
GewebehomogenisatorSigmaD9188
140 μ m FilterMERCKNY4H04700
40 μ m filterCorning431750
EndOhm KammersystemWorld Precision InstrumentsENDOHM-12EndOhm Kammer für 12mm Culture Cups
EVOM2 ElektrodensystemWorld Precision Instruments300523+STX100CTEER Messsystem mit starrem STX-100C Elektrodenpaar
Lange NadelSigmaAn einer Spritze befestigen
Gebogene Pinzette mit feiner SpitzeKLS Martin12-409-12-07
Pinzette mit breiter SpitzeVWR82027-390
FilterhalterMERCK MiliporeSwinnex-47
50 ml SpritzeBraun4617509F
10 ml SpritzeTerumoSSt20ESI
Anti-Occludin AntikörperAbcamab317211:100
Anti-p120 Catenin-AntikörperBD Transduktionslabor 610133 atorien1:200
Anti-ZO-1-AntikörperInvitrogen61-73001:200
Anti-Claudin-5-AntikörperSigma-AldrichSAB45029811:100
Esel-Anti-Kaninchen-IgG, konjugiert mit Alexa-Mehl 568Thermo ScientificA100421:500
Esel-Anti-Maus-IgG, konjugiert mit Alexa-Mehl 488Thermo ScientificA212021:500
SaccharosePerkin ElmerNEC100X250UC0,15 μ; l/ml Endbearbeitung conc
Lucifer YellowSigmaL0144 10µ g/ml Endarbeitsergebnis

Referenzen

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