Verbesserte Methode für die Einrichtung einer In-vitro- Blut - Hirn-Schranke Modell auf porcinen Endothelzellen Gehirnzellen basiert

Zusammenfassung

Ziel des Protokolls ist eine optimierte Verfahren für die Einrichtung eines in-vitro- Blut - Hirn-Schranke (BBB) Modells basierend auf primäre porcinen Gehirn endothelial Zellen (pBECs) zu präsentieren. Das Modell zeigt hohe Reproduzierbarkeit, hohe Dichtigkeit und eignet sich für Studien der Transport- und intrazellulären Menschenhandel in der Wirkstoffforschung.

Zusammenfassung

Das Ziel dieses Protokolls stellt eine optimierte Verfahren für die Reinigung und Pflege der pBECs und in-vitro- Blut - Hirn-Schranke (BBB) Modelle basierend auf pBECs in Mono-Kultur (MC), MC mit Astrozyten konditioniertes Medium (ACM), zu etablieren und berührungslose Kokulturen (NCC) mit Astrozyten von Schweinen oder Ratte Herkunft. pBECs waren isoliert und kultiviert aus Fragmenten der Kapillaren aus dem Gehirn Cortex von Hausschweinen ca. 5-6 Monate alt. Diese Fragmente wurden durch sorgfältige Entfernung der Hirnhaut, Isolation und Homogenisierung der grauen Substanz, Filtration, enzymatischen Verdauung und Zentrifugation gereinigt. Um weitere kontaminierende Zellen zu beseitigen, wurden die Kapillare Fragmente mit Puromycin-haltigen kultiviert Medium. Bei 60-95 % Zusammenfluss pBECs wächst aus der Kapillare Fragmente zu passagiert wurden durchlässige Membranfilter fügt und die Modelle gegründet. Um Barrier Dichtigkeit und BBB charakteristischen Phänotyp der pBECs zu erhöhen, wurden die Zellen mit folgenden Differenzierungsfaktoren behandelt: Membran permeationsfähigen 8-CPT-Zaatari (hier abgekürzt), Hydrocortison und ein Phosphodiesterase-Hemmer, RO-20-1724 (RO). Das Verfahren erfolgte über einen Zeitraum von 9-11 Tage, und bei der Festlegung der NCC-Modell waren die Astrozyten 2 bis 8 Wochen im Voraus kultiviert. Einhaltung der beschriebenen Verfahren des Protokolls ermöglichte die Errichtung der endothelialen Schichten mit stark eingeschränkter parazellulär Durchlässigkeit, mit NCC Modell zeigt einen durchschnittliche Transendothelial elektrischen Widerstand (TEER) 1249 ± 80 Ω cm ², und parazellulär Durchlässigkeit (P_app) für Luzifer gelb 0,90 10^-6 ± 0,13 10^-6 cm s^-1 (meine ± SEM, n = 55). Weitere Auswertung dieser pBEC Phänotyp zeigte guten Ausdruck der engen Knoten Proteine Claudin 5, ZO-1, occludin und Adherens Junction Proteins p120-Catenin. Das vorgestellte Modell eignet sich für eine Vielzahl von Studien der BBB in Gesundheit und Krankheit, und mit der sehr restriktive parazellulär Durchlässigkeit, eignet sich dieses Modell für Studien von Verkehr und Handel mit intrazellulären.

Einleitung

Zelluläre Struktur und Funktion der Blut - Hirn-Schranke

An der Schnittstelle von Herz-Kreislauf und zentrales Nervensystem (ZNS) wirkt die BBB als eine wichtige regulatorische Seite für Volumenstörungen Kontrolle über die CNS Mikroumgebung, was für einwandfreie Funktion und Schutz des Nervensystems unerlässlich ist. Die Website der BBB ist die Auskleidung der Blutgefäße Lumen Endothelzellen. Im Gehirn Kapillaren Endothelzellen bilden komplexe interzelluläre enge Kreuzungen und stark polarisierten Expressionsmuster von bestimmten Zustrom und Efflux-Transporter sorgen für hochspezifische molekularen Transport zwischen dem Blut und der Gehirn- <....

Protokoll

porcinen Gehirne wurden als Nebenprodukte der dänischen Lebensmittelindustrie erhalten. Dänischen Schlachthöfen sind unter strenger Überwachung und Beobachtung durch das dänische Ministerium für Umwelt und Lebensmittel.

Ratten für die Isolierung von Astrozyten verwendet wurden gezüchtet und in den lokalen Tierhaus bei einer Umgebungstemperatur von 22 ° C - 23 ° C und auf einem 12/12 h hell/dunkel-Zyklus unter Kontrolle des Tierarztes und nach Dänisch Gruppe untergebracht Vorschriften für Labortiere. Die Ratten wurden eingeschläfert, bevor sie nach internationalen Richtlinien für die ethische Verwendung von Tieren (Richtlinie Europäischen ....

Ergebnisse

Gründung der BBB In-vitro- Modelle

In der vorgestellten, optimierte Methode Anbau von pBECs und die Errichtung des durchlässige Membran einfügen mit MC oder ohne ACM oder NCC mit Astrozyten (Abbildung 1) für einen Zeitraum von 9 bis 11 Tagen (Abbildung 2) erfolgte. Für die Auswahl von Endothelzellen, wurde eine erste Kultur der gereinigten Kapillare Fragmente komb.......

Diskussion

Reinigung und Verbreitung von pBEC

Während die Reinigungsprozedur gehören wichtige Schritte schnelle und wirksame Beseitigung der Hirnhaut und Trennung der weißen und grauen Materie, die wichtig für die Reinigung Ausbeute und Reinheit und für den richtigen Aufbau des Modells ist. Für die vorgestellten in-vitro- BBB-Modell mit pBECs haben wir verbessert und vereinfacht eine Reinigungsprozedur basierend auf mechanische Homogenisierung der isolierten graue Substanz, Größe-selektive Filterun.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Fibronektin	Sigma-Aldrich	F1141
Kollagen IV	Sigma-Aldrich	C5533
Poly-L-Lysin	Sigma-Aldrich	P1524
DMEM/F-12	Lonza	BE12-719F
DMEM/Low Glucose	Sigma-Aldrich	D6046
Penicillin/Streptomycin	Gibco Invitrogen	15140
Aus Plasma gewonnenes Serum (PDS)	First Link UK Ltd.	60-00-89
Fötales Rinderserum (FBS)	Gibco Invitrogen	10-270-106
Trypsin/EDTA	Gibco Invitrogen	15090-046
Heparin	Sigma-Aldrich	H3393
Puromycin	Sigma-Aldrich	P8833
Hydrocortison	Sigma-Aldrich	H4001
8-CPT-cAMP	Biolog	C010
RO 20-1724	Sigma-Aldrich	B8279
Gentamicin Sulfate	Lonza	17-518Z
DMSO	Sigma-Aldrich	34896
PBS	Sigma-Aldrich	D8537
EtOH	VWR	20,824,296	Mischen Sie die 70 %ige Lösung aus dem 96 %igen EtOH
DNAse 1	Sigma-Aldrich	D4513
Kollagenase CLS2	Sigma-Aldrich	C6885
ddH2O			Hergestellt mit Elga System
T75 Kolben	Thermo Scientific	156499
Costar Transwell-Einsätze (Zellpermeable Membraneinsätze)	Costar	CLS3401	12-Well-Platte, 12 mm Durchmesser, 0,4 μ m Polycarbonat-Membran
15 ml Zentrifugenröhrchen	Cellstar	188271
50 ml Zentrifugenröhrchen	Cellstar	227261
Petrischalen	Thermo Scientific	150350
Kryofläschchen	Thermo Scientific	377224
500 ml Flasche	Thermo Scientific	159910/159920
Skalpelle	Swann-Morten	REF0211	Typ 24
Gewebehomogenisator	Sigma	D9188
140 μ m Filter	MERCK	NY4H04700
40 μ m filter	Corning	431750
EndOhm Kammersystem	World Precision Instruments	ENDOHM-12	EndOhm Kammer für 12mm Culture Cups
EVOM2 Elektrodensystem	World Precision Instruments	300523+STX100C	TEER Messsystem mit starrem STX-100C Elektrodenpaar
Lange Nadel	Sigma		An einer Spritze befestigen
Gebogene Pinzette mit feiner Spitze	KLS Martin	12-409-12-07
Pinzette mit breiter Spitze	VWR	82027-390
Filterhalter	MERCK Milipore	Swinnex-47
50 ml Spritze	Braun	4617509F
10 ml Spritze	Terumo	SSt20ESI
Anti-Occludin Antikörper	Abcam	ab31721	1:100
Anti-p120 Catenin-Antikörper	BD Transduktionslabor 610133 atorien		1:200
Anti-ZO-1-Antikörper	Invitrogen	61-7300	1:200
Anti-Claudin-5-Antikörper	Sigma-Aldrich	SAB4502981	1:100
Esel-Anti-Kaninchen-IgG, konjugiert mit Alexa-Mehl 568	Thermo Scientific	A10042	1:500
Esel-Anti-Maus-IgG, konjugiert mit Alexa-Mehl 488	Thermo Scientific	A21202	1:500
Saccharose	Perkin Elmer	NEC100X250UC	0,15 μ; l/ml Endbearbeitung conc
Lucifer Yellow	Sigma	L0144 10	µ g/ml Endarbeitsergebnis