Entwicklung eines menschlichen präklinischen Modell der Osteoclastogenesis aus peripherem Blut Monozyten Co mit Brustkrebszelllinien kultiviert

Summary

Dieses Protokoll beschreibt eine in-Vitro menschliche präklinischen Modell des Osteoclastogenesis aus peripherem Blut Monozyten kultiviert mit Brustkrebszelllinien, die Krebs Zelle Osteoklasten Interaktion zu imitieren. Das Modell könnte verwendet werden, um unser Verständnis der Metastasierung Knochenbildung und Therapiemöglichkeiten zu verbessern.

Abstract

Das Übersprechen zwischen Tumorzellen und Knochenzellen in die Knochen Mikroumgebung ist entscheidend für das Verständnis des Mechanismus der Metastasierung Knochenbildung. Wir entwickelte eine in-vitro- vollständig humaner präklinischen Modell Kokulturen von Brustkrebs-Zellen und Monozyten in der Differenzierung zu Osteoklasten. Wir optimieren ein Modell der Osteoclastogenesis ausgehend von einer Stichprobe von peripherem Blut von gesunden Spendern gesammelt. Peripheren mononukleären Zellen (PBMCs) wurden zuerst durch Dichte-Gradienten-Zentrifugierung getrennt, bei einer hohen Dichte ausgesät und induziert durch das Hinzufügen von zwei Wachstumsfaktoren (GFs) zu unterscheiden: Rezeptor Aktivator des nuklearen Faktor κB Ligand (RANKL) und Makrophagen Kolonie-stimulierende Faktor (MCSF). Die Zellen in der Kultur für 14 Tage blieben und dann fixiert und durch nachgelagerte Analyse analysiert. In osteolytischen Knochenmetastasen ist eine der Auswirkungen der Krebs Zelle Anreise in den Knochen der Induktion von Osteoclastogenesis. Wir herausgefordert damit unser Modell mit Ko-Kulturen von Brustkrebszellen, die Differenzierung macht der Krebszellen in Bezug auf GFs zu studieren. Eine einfache Möglichkeit des Studiums Krebs Zelle Osteoklasten Interaktion soll indirekten Co Kulturen basiert auf der Verwendung von konditionierten Medium von Brustkrebs Zellkulturen gesammelt und gemischt mit frischem Medium ausführen. Diese Mischung wird dann verwendet, um Osteoklasten Differenzierung zu induzieren. Wir haben auch eine Methode der direkten Kokultur in welcher Krebs Zellen und Monozyten in der Differenzierung des Mediums zu teilen und austauschen sezernierten Faktoren optimiert. Dies ist eine deutliche Verbesserung gegenüber der ursprünglichen indirekte Kokultur Methode, wie Forscher die gegenseitige Wechselwirkungen der beiden Zelltypen beobachten und nachgeschalteten für Krebszellen und Osteoklasten Analysen. Diese Methode ermöglicht es uns, die Wirkung von Medikamenten auf die Metastasen Knochen Mikroumgebung und Samen Zelllinien unternehmensfremde abgeleitet von Brustkrebs zu studieren. Das Modell kann auch verwendet werden, um andere Krankheiten wie Osteoporose oder andere Knochen-Bedingungen zu studieren.

Introduction

Knochen ist eine gemeinsame Website der Metastasierung für verschiedene Arten von primären Tumoren wie Prostata-, Lungen- und Brustkrebs Krebs, mit 20-25 % der Patienten entwickeln Knochenmetastasen im Verlauf der Krankheit^1,2,3. 70 % der Patientinnen mit Brustkrebs durchgeführt, insbesondere, Nachweis von Knochenmetastasen bei Tod-⁴. Tumor und Stromazellen Zelle Interaktion ist wichtig für Krebsentwicklung im primären Krebs und sekundäre Läsionen. In den Knochen Mikroumgebung hängen osteolytischen Knochenmetastasen bei Brustkrebs die Einrichtung ein pathologischer Teufelskreis zwischen Krebszellen, Knochenzellen, und die Knochen Mikroumgebung. Krebszellen stören Knochen Gleichgewicht, Erhöhung der Knochenresorption^5,6,7.

Unter normalen und pathologischen Bedingungen sind Osteoklasten die Zellen verantwortlich für Knochenabbau, während Osteoblasten in Hinterlegung neue Matrix für neue Knochen Bildung⁸verantwortlich sind. Osteoklasten-Aktivität wird durch Osteoblasten durch den Ausdruck von RANKL, die an seinen Rezeptor RANK auf der Pre-Osteoklasten Oberfläche bindet, Pre Osteoklasten Fusion, ein notwendiger Prozess zur Differenzierung in ausgereiften Osteoklasten induzieren geregelt. Die Induktion von Osteoclastogenesis erhöht Knochenabbau. Eine große Anzahl von in-Vivo -Studien haben unser Verständnis von Knochen Metastasen Bildung^9,10,11deutlich verbessert. Brustkrebs-Zellen aus dem primären Tumor und in den Knochen Mikroumgebung Radardetektoren Knochen Homöostase, Förderung Osteoclastogenesis und Knochen Resorption⁸. In diesem Szenario sind alle molekularen Interaktionen, die auftreten, die zwischen Krebszellen und Osteoklasten von entscheidender Bedeutung. Wie bereits erwähnt hat der Mechanismus der Knochenbildung Metastasen in in Vivo Mäuse Modelle aufgeklärt. Neben der Notwendigkeit für die Zulassung von allen in Vivo Tierversuche durch die Ethik-Kommission sind jedoch einige andere Nachteile zur Durchführung von in-Vivo Experimenten einschließlich hohe Kosten und zeitaufwändige Methoden. Mehrere Autoren haben präklinische in Vivo und in Vitro Modellen von Osteoclastogenesis mittels einer murinen Linie von Pre Osteoklasten genannt RAW246.7^9,10,11kombiniert. Die Nachteile dieses Modells ergeben sich aus der Tatsache, dass die Zellen schon immer vor Osteoklasten verpflichtet und nicht menschlichen Ursprungs sind sind. Aus diesen Gründen profitieren translationaler Forschung stark von der Verfügbarkeit von in-vitro- vollständig humaner präklinischen Modellen, Knochen-Krebs-Zell-Interaktionen zu studieren.

Wir haben eine Methode des Osteoclastogenesis in Vitro menschliche peripherem Blut Proben^12,13ab optimiert. Osteoklasten stammen aus Monozyten, die, wenn auch in geringem Umfang im peripheren Blutproben vorliegen. Mononukleäre Zellen werden zunächst von den Erythrozyten und Granulozyten im Vollblut von Ficoll Dichtegradient getrennt; Sie werden dann dank ihrer Fähigkeit zur Einhaltung der Kunststoff-Substrat, im Gegensatz zu Lymphozyten ausgewählt. Nach der Aussaat, sind Zellen für 14 Tage kultiviert. MCSF und RANKL sind die GFs geforderten Monozyten, zuerst in Makrophagen und dann in Osteoklasten^14,15zu unterscheiden. MCSF braucht man für die gesamte Dauer des Tests, während RANKL verwendet wird, um den Differenzierungsprozess in den späten Stadien der Osteoclastogenesis induzieren. In der frühen Phase der Differenzierung hilft MCSF Monozyten vermehren und überleben^14,15. Während des zweiten Teils der Osteoclastogenesis Zellen verschmelzen und Reifen als Osteoklasten, zeigt die charakteristische Verteilung der Aktin F in Ringe und mit dem Ausdruck spezifischer Marker wie Tartrat-resistente saure Phosphatase (TRAP) und Calcitonin-Rezeptor (CTR) ^{14 , 15}. unsere Methode besteht darin, zusätzlich MCSF zu Monocyte-Kultur für die ersten 7 Tage des Experiments und eine Kombination aus MCSF und RANKL von 7 bis 14 Tage. Am Ende des Experiments wird Osteoclastogenesis analysiert durch zählen der differenzierten Zellen, wie unten aufgeführt.

Induziert durch GFs unterscheiden Monocyte-Kulturen bilden die Grundlage unserer präklinischen Modell. Wir optimieren eine Kokulturen-System ohne GFs, die Osteoclastogenic Kraft der Brustkrebs-Zellen besser zu verstehen. Wir zuerst entwickelt ein Modell der indirekten Co Kulturen durch Zugabe von einem Medium (80 % α-Minimal notwendig (α-MEM) und 20 % bedingt Medium gesammelt von einer Kultur des Brustkrebs-Zellen, dass ca. 90 % Zusammenfluss Zellen Differenzierung^{12 befanden} . Die konditionierte Medium (nicht unter Serum Entbehrung Bedingungen gesammelt) wurde nach 24 Stunden gesammelt und gemischt mit frisches Medium mit einem Anteil von 1:4. Die konditionierte Medium induziert signifikante Osteoklasten Differenzierung im Hinblick auf die negativ-Kontrolle. Jedoch, wie die Informationen über die Wechselwirkung zwischen Krebszellen und Knochenzellen verloren geht, bei der Verwendung von indirekten Co Kulturen, wir unser System durch Durchführung von direkten Ko-Kulturen verbessert. Wir ausgesät Krebszellen in 0,4 µM fügt und legte sie in Brunnen wo Mononukleäre Zellen überzogen waren. Mit dieser Methode, Zellen teilen das gleiche Medium und sekretierten Proteine austauschen. Wir schuf damit ein vollständig humaner präklinisches Modell Osteoclastogenesis induziert durch Krebs Zellen¹³.

Dieses System ist vielseitig einsetzbar und eignet sich für verschiedene wissenschaftliche Zwecke, z. B.in pharmakologischen Studien zur Untersuchung der Rolle der Drogen in Knochenmetastasen. Unser Modell macht es möglich, die Wirksamkeit und Wirkmechanismen des Knochens zielgerichtete Therapien und/oder Antitumor-Drogen in den Knochen Mikroumgebung in Anwesenheit von Krebs Zellen¹³zu studieren. Versuchsplanung mit der richtigen Steuerung, macht d.h., Krebszellen und Osteoklasten kultiviert individuell, es leichter zu verstehen, die Auswirkungen der Co-Kultur auf Drogetätigkeit. Dieser Ansatz wird noch interessanter, wenn das zu untersuchende Medikament richtet sich an beide Krebs Zellen und Osteoklasten, z.B.Everolimus¹⁶. Dieses Modell kann auch verwendet werden, um neue Wege der Interaktion zwischen Krebszellen und Knochenzellen zu identifizieren.

Protocol

menschlichen Osteoklasten wurden differenziert von PBMCs von gesunden Spendern gab schriftliche Einwilligungserklärung, an der Studie teilzunehmen. Das Studienprotokoll wurde von der lokalen Ethik-Kommission im Einklang mit den ethischen Standards gemäß der Deklaration von Helsinki 1964 genehmigt.

1. Osteoklasten Differenzierung

Hinweis: Sammeln von peripherem Blut oder buffy Coats von gesunden menschlichen Spendern in EDTA. Verwenden Sie nicht weniger als 20 mL des peripheren Blutes. Buffy Coats sind vorzuziehen, weil sie eine größere Fülle von mononukleären Zellen haben. Führen Sie die folgenden Schritte in eine sterile Gewebekultur Kapuze.

1. Verdünnen EDTA Vollblut 1:1 mit 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS). Wieder gut auszusetzen.
2. Schicht auf Lymphozyten Trennung Medien (Blut-PBS: Lymphozyten Trennung Medien, 2:1) in 50 mL-Tuben.
   1. Pipette 30 mL Blut verdünnt mit PBS-Puffer in einem 50 mL-Tube.
   2. Sanft Unterlage 15 mL Lymphozyten Trennung Medien in den unteren Teil der 50-mL-Tube.
3. Zentrifuge bei 757 × g für 10 min bei Raumtemperatur (ohne Bremsen).
4. Sammeln die mononukleären Zellen:
   1. sammeln, die weiße Schicht von mononukleären Zellen mit einer 5-mL-Pipette ohne Rühren und legen Sie sie in eine neue 50 mL Tube.
   2. Die gesammelten PBMCs mit 20 mL PBS verdünnen.
5. Waschen die PBMCs:
   1. Zentrifuge bei 225 X g für 5 min bei Raumtemperatur.
   2. Verwerfen den Überstand durch das Rohr zu invertieren. Einmal zu wiederholen.
6. RBC Lyse:
   Hinweis: Wenn die Zelle Pellet rot ist, behandeln Sie Zellen mit roten Blutkörperchen Lyse Pufferlösung (siehe Tabelle der Materialien).
   1. Setzen die 50 mL-Tube auf Eis.
   2. Fügen Sie 5 mL Erythrozyten Lyse Puffer.
   3. Warten 3-5 min. um die lyse von Erythrozyten zu vervollständigen. Die Zeit variiert je nach dem Grad der Verunreinigung der Erythrozyten.
   4. Die Reaktion zu stoppen, durch Zugabe von 20 mL PBS.
   5. Zentrifuge bei 225 X g für 5 min bei Raumtemperatur. Verwerfen den Überstand durch das Rohr zu invertieren.
      Hinweis: Optional: Wenn die RBC-Lyse durchgeführt wird, waschen die PBMCs, wie unten beschrieben.
7. Wash PBMCs:
   1. 20 mL PBS und Zentrifuge bei 225 X g für 5 min bei Raumtemperatur hinzufügen.
   2. Verwerfen den Überstand durch das Rohr zu invertieren.
8. Wieder aussetzen der Zellen im kompletten α-MEM (ergänzt mit 1 % Glutamin (Ausgangskonzentration 100 X) und 10 % fötalen Rinderserum).
9. Zählen die Zellen mit einer Neubauer-Kammer.
   1. Verdünnen der Probe 1: 100 in Eisessig und 10 µL der Verdünnung verwenden, um Zellen zu zählen.
   2. Mindestens zweimal zählen und rechnen den Mittelwert der Wiederholungen, die durchschnittliche Gesamtzahl der Zellen gesammelt bekommen.
10. Platte Zellen:
    1. Platte Zellen in einer Konzentration von 750.000 PBMCs pro cm ².
    2. Speichern Sie vergoldete Zellen in einem Inkubator bei 37 ° C in 5 % CO ₂ Atmosphäre.
       Hinweis: Design repliziert das Experiment Negativkontrollen, enthalten die Zellen, die mit normalen vollständige α-MEM ohne MCSF oder RANKL GFs. denken Sie daran, jede Bedingung in mindestens 3 Technische durchzuführen behandelt werden. Führen Sie mindestens 3 biologische Wiederholungen.
11. Das Medium ergänzt mit GFs verändern:
    1. warten ca. 3 h nach der Aussaat der Zelle und entfernen Sie das Medium mit Pipette (200-1.000 µL), Schutt, ungebunden Zellen und Erythrozyten zu verwerfen.
       Hinweis: Achten Sie beim Wechsel des Mediums zur Vermeidung von Zelle Loslösung.
    2. Fügen Sie neue komplette α-MEM ergänzt mit 20 ng/mL MCSF (500 µL/Well).
       Hinweis: Wenn mit Krebszellen Co Kultivierung, Samen der Krebs Zellen am Tag nach der Aussaat der PBMC.
12. Wechseln Sie das Medium alle 2-3 Tage (α-MEM ergänzt mit 20 ng/mL des MCSF):
    1. verwerfen das Medium durch ein 200-1.000 µL Pipette.
    2. Hinzufügen neuer frisches Medium mit einem 200-1.000 µL Pipette.
13. 6-7 Tage nach der Aussaat Zelle, 20 ng/mL von RANKL hinzufügen komplette α-MEM + MCSF.
14. Das Medium verändern (vollständige α-MEM + MCSF + RANKL) alle 2-3 Tage:
    1. verwerfen das Medium mit einer 200-1.000 µL Pipette.
    2. Fügen Sie neues Medium mit einer 200-1.000 µL Pipette. Induktion der Differenzierung zu stoppen, 14 Tage nach der Aussaat Zelle.
    3. Verwerfen Medium und zweimal mit PBS waschen.
15. Zellen mit Paraformaldehyd befestigen:
    1. Zellen trocknen lassen.
    2. 4 % Paraformaldehyd hinzufügen (siehe Tabelle der Werkstoffe).
    3. Für 20 min bei Raumtemperatur inkubieren.
16. Verwerfen Paraformaldehyd und zweimal mit 500 µL PBS waschen.
    Achtung: Paraformaldehyd ist giftig; Bitte tragen Sie Handschuhe, Maske und Brille.
17. Zellen trocknen lassen.
18. Führen Sie TRAP Färbung nach Angaben des Herstellers ' s Anweisungen (siehe Tabelle der Werkstoffe).
19. Zählen Osteoklasten-ähnliche Zellen manuell unter dem Mikroskop bei Vergrößerung 10 X; NA 0,30.
    Hinweis: Osteoklasten-wie Zellen werden definiert als TRAP + Polycarion Zellen mit mindestens 4 Kerne.

2. Zellkulturen

Hinweis: die Experimente mit verschiedenen Arten von Brust Adenokarzinom Zelllinien wie SCP2 ¹⁷, einer Osteotropic-Zelllinie aus den dreifach negative Menschen durchgeführt werden können Brust-Krebs-Zell-Linie (MDA-MB-231) und die hormonelle Hormonrezeptor-positivem Zellinie MCF7.

1. Kultur der Zellen als eine Monolage in 75 cm ² Flaschen.
   1. Samen 1.000.000 Krebszellen in einem 75-cm ² Kolben.
   2. Speichern die Zellen bei 37 ° C in vollständige α-MEM Medium mit 1 % Glutamin und 10 % fötalen Rinderserum in 5 % CO ₂ Atmosphäre ergänzt.
2. Lösen die Zellen bei einer Konfluenz von ca. 90 %:
   1. das Medium zu verwerfen, waschen mit PBS, und 2-3 mL Trypsin 1 X in PBS.
   2. Inkubieren Sie Zellen für 3-5 min bei 37 ° c
   3. Sammeln die freistehenden Zellen aus den 75 cm ² Kolben durch einen 10-mL-Pipette, Hinzufügen von 8 mL komplette Medium, die enzymatische Reaktion zu stoppen.
   4. Zentrifuge bei 225 X g für 5 min.
3. Waschen die Krebszellen:
   1. fügen Sie 10 mL PBS.
   2. Zentrifuge bei 600 X g für 5 min.
4. Zählen Krebszellen mit einer Neubauer-Kammer.
   1. Zählen Krebszellen mindestens zweimal und berechnen Sie den Mittelwert der Wiederholungen, die durchschnittliche Gesamtzahl der Zellen gesammelt bekommen.

3. Direkte Ko-Kulturen von Krebszellen ein Nd Monozyten unterziehen Differenzierung zu Osteoklasten

1. Samen der Krebszellen auf Einsätze (Pore Durchmesser 0,4 µm):
   1. Samen die Krebszellen in einer Konzentration von 4.000 Zellen pro cm ².
   2. Inkubation bei 37 ° C und 5 % CO ₂.
      Hinweis: Samen der Krebs Zellen am Tag nach der PBMC Aussaat für das Kokultur Experiment in 0,4 µm Einsätze.
2. Warten Sie 24 Stunden damit die Zellen haften.
3. Ort der gesäten einfügen Kultur über den mononukleären Kulturen Kokulturen (siehe Abschnitt 1.10 des Protokolls) beginnen.
4. Wechseln Sie das Medium alle 2-3 Tage mit kompletten α-MEM.
   1. Verwerfen das Medium mit einer 200-1.000 µL Pipette.
   2. Hinzufügen 500 µL frisches Medium.
      Hinweis: Das primäre Ziel der Co-Kultur ist es, die Osteoclastogenic Kraft von Krebszellen zu verstehen, sind daher die GFs nicht α-MEM hinzugefügt. Gehören Sie in jedem Experiment der Kokultur negative Kontrollen (siehe Hinweis im Schritt 1.10 des Protokolls) und Positivkontrollen von Osteoklasten durch RANKL und MCSF (keine Krebszellen) unterschieden. Krebszellen in die Einsätze nicht platziert in mononukleären Zellen ausgesät dienen als Negativkontrolle der Kokultur.
5. Der Kokultur zu stoppen und Krebszellen für nachgelagerte Analyse verwenden:
   1. 13 Tage nach der Aussaat PBMC und 12 Tage nach der Krebs Zelle Aussaat, legen Sie den Einsatz auf einer neuen Platte.
   2. Stoppen Krebs Zelle Kultur, auf deren Grundlage die nachgeschaltete Analysen durchgeführt werden (siehe Diskussion).
6. Am 14. Tag, Osteoklasten Differenzierung zu stoppen und Zellen, zu beheben, wie in Schritt 1.15 berichtet.
7. Führen Sie TRAP Färbung sofort oder innerhalb von 14-30 Tage.
   Hinweis: Optionale Färbung: um zu bestätigen, dass die Falle + Polycarion Zellen Osteoklasten, können Forscher führen Sie zusätzliche Färbung um CTR, ein Osteoklasten-spezifische Marker zu erkennen. Der Nachweis von F-Aktin-Ringe ist ein weiteres Osteoklasten-spezifische Färbung Assay ^{12 , 13 , 14}.

Results

Eine Methode wurde optimiert, um leicht Osteoklasten aus menschlichen peripheren Blut Monozyten differenzieren. Die Monocyte-Kultur war mit Krebszellen, bestätigt wird (wie in der Literatur¹⁸beschrieben), dass Krebszellen fähig Osteoclastogenesis in Knochenmetastasen kultiviert. Osteoklasten unterscheiden sich Krebszellen und GFs sind in Abbildung 1dargestellt. Eine Zelle Osteoklasten-wie ist eine Zelle mit 4 oder mehr Kerne und ist po...

Discussion

Präklinischen in-vitro- Modelle untersuchen die Mechanismen der Übersprechen zwischen Krebszellen und Knochenzellen sind erforderlich, um die Mechanismen der Knochenmetastasen zu identifizieren, die verwendet werden können, um neue therapeutische Strategien zu erstellen. Wir entwickelten ein vollständig humaner in Vitro -Modell der Osteoclastogenesis aus dem menschlichen peripheren Blut (Abbildung 3). Bei der Optimierung der Methodik wurden eine Reihe von kritischen Punkte ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
α MEM	Euroclone	BE12-169F
Glutamin	Life-technologies	ECB3000D
Fötales Rinderserum	Life-technologies	ECS0180DPR
hMCSF	Peprotech	300-25	Lagerungshinweise müssen beachtet werden
hRANKL	Peprotech	310-01	Lagerungshinweise müssen beachtet werden
Saure Phosphatase, Leukozyten (TRAP) Kit	Sigma Aldrich	387 A
Lymphozyten-Trennmedium	Biowest	L0560-100
Lysierungspuffer für rote Blutkörperchen	SIgma	11814389001 ROCHE
Trypsin	EuroClone	COD. ECB3052D
Paraformaldehyd 4%ige wässrige Lösung, EM-Qualität	Elektronenmikroskopie Sciences	157-4-100
MDA-MB-231 Zelllinie	ATCC	CRM-HTB-267
MCF7	ATCC	HTB-22
Transwell	Corning	3470-Clear	Diese Einsätze sind für 24-Well-Platten; 6,5 mm, 0,4 μ M; Porengröße