Methodenartikel

Echtzeit-Beben-induzierte Umwandlung Test zur Erkennung von CWD Prionen in Fäkalien

DOI:

10.3791/56373

⸱

29. September 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Dept. of Ecosystem and Public Health, Calgary Prion Research Units, Faculty of Veterinary Medicine, University of Calgary, 2Dept. of Molecular Biology, University of Wyoming, 3Canadian Food Inspection Agency, Lethbridge Laboratories

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Hier präsentieren wir ein Protokoll, um eine einfache, schnelle und effiziente Prion-Verstärkung-Technik, die Echtzeit-Beben-induzierte (RT-QuIC) Konvertierungsmethode beschreiben.

Zusammenfassung

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Die RT-QuIC-Technik ist ein sensibler in-vitro- zellfreie Prion Verstärkung Assay basiert hauptsächlich auf die kernigen Fehlfaltung und Aggregation von rekombinanten Prion Protein (PrP) Substrat mit Prion Samen als Vorlage für die Konvertierung. RT-QuIC ist eine neuartige Hochdurchsatz-Technik, analog zur Real-Time Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Nachweis von Amyloid Fibrille Wachstum basiert auf den Farbstoff Thioflavin T, die auf spezifische Wechselwirkung mit ᵦ-Blatt reichen Proteinen fluoresziert. So kann Amyloid Bildung in Echtzeit erkannt werden. Wir haben versucht, zuverlässige nicht invasive Screening-Test zur Erkennung von chronischen wasting Disease (CWD) Prionen in fäkale Extrakt zu entwickeln. Hier haben wir speziell die RT-QuIC Technik zu offenbaren, dass PrPSc Aussaat Aktivität im Kot von CWD Hirschartigen infiziert. Anfangs war die Sämaschinen Aktivität der fäkalen Extrakte, die wir vorbereitet in RT-QuIC, möglicherweise wegen eines möglichen Assay-Hemmer im fäkalen Material relativ gering. Zur Verbesserung Sämaschinen Aktivität von Kot-Extrakten und entfernen mögliche Assay-Inhibitoren, homogenisiert wir Stuhlproben in einem Puffer mit Wasch- und Protease-Inhibitoren. Wir reichten auch Proben unterschiedlicher Methoden, PrPSc auf der Grundlage von Proteinfällung mit Natrium Phosphotungstic Acid und Zentrifugalkraft zu konzentrieren. Schließlich wurden die Kot-Extrakte durch optimierte RT-QuIC getestet, die Substrat-Ersatz in das Protokoll zur Verbesserung der Nachweisempfindlichkeit enthalten. So haben wir ein Protokoll für empfindliche Detektion von CWD Prion Aussaat Aktivität im Kot der vorklinischen und klinischen Hirschartigen durch RT-QuIC, die ein praktisches Werkzeug für nichtinvasive Diagnostik der CWD sein kann.

Einleitung

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Prion-Krankheiten oder transmissiblen spongiformen Enzephalopathien (TSE) sind Neurodegenerative Erkrankungen einschließlich der Creutzfeldt - Jakob-Krankheit (CJK) beim Menschen, bovine spongiforme Enzephalopathie (BSE) bei Rindern, Scrapie bei Schafen und Ziegen und chronische verschwenden Disease (CWD) in Hirschartigen 1,2. TSE zeichnen sich durch markante spongiforme aussehen und Verlust von Nervenzellen im Gehirn. Nach der Hypothese "Protein nur" sind Prionen hauptsächlich bestehend aus PrPSc ("Sc" für Scrapie) 3, fehlgefaltete Isoform des Host-kodierten zellulären Prion....

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Protokoll

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1. RT QuIC mittels fäkal Material

    1. machen Aufstellungdes Cervid Kot extrahiert fäkale Homogenat durch Zugabe von 1 g fäkal Material bis 10 mL von Kot extrahieren Puffer (20 mM Natriumphosphat, pH 7,1, 130 mM NaCl, 0,05 % Tween 20, 1 mM PMSF und 1 X komplette Protease-Inhibitoren, EDTA-frei), eine Endkonzentration von 10 % (w/V) zu geben. Der Homogenisierung Puffer kann vor der Nutzung vorbereitet und bei-20 ° c
    2. Homogenize fäkale Pellets (1 g) und Puffer (10 mL) in Tuben (z. B. GentleMACS M Rohre) mit einem Dissociator mit einem vorgegebenen Programm vom Hersteller für Proteine für 1 min bei Raumtemperatur. Wiederholen Sie ....

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Ergebnisse

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Die CWD fäkale Extrakte vorbereitet bei 10 % (w/V) konnten RT QuIC Reaktion Samen, doch die Nachweisempfindlichkeit war niedrige 27. Mit einem speziellen Puffer für fäkale Homogenisierung war ein entscheidender Schritt, hohe Hintergrundfluoreszenz in RT QuIC begleitende Reaktionen auf die Verwendung der Maus rPrP Substrat zu vermeiden, anstatt Hirsch rPrP ermöglichte man genauere Ergebnisse 27. Die Zugabe von NaPTA Niederschlag verringert di.......

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Diskussion

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RT-QuIC war zuvor beschäftigt, CWD Prionen in Urin und fäkale Extrakte von mündlich infizierten weiß - angebundene Rotwild und Maultierhirsche 38zu erkennen. Das System in diesem Manuskript gezeigt ist eine angepasste Methode des RT-QuIC Assays. Weitere Schritte wurden in der "klassischen" RT-QuIC Assay zur Verbesserung der Erkennung und Empfindlichkeit des Assays für CWD Prionen in Fäkalien infizierter Tiere aufgenommen.

Die niedrige Nachweisempfindlichkeit im Kot Extr.......

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

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Wir sind dankbar, Dr. Byron Caughey (NIH Rocky Mountain Laboratories) für die Ausbildung und das Cervid PrP bakterielle Expressionsplasmid. SG wird vom Canada Research Chair Programm unterstützt. Wir anerkennen die Fördermittel für diese Forschung zu SG Genome Kanada, Alberta Prion Research Institute und Alberta Land- und Forstwirtschaft durch Genom Alberta und der University of Calgary zur Unterstützung dieser Arbeit. Wir erkennen ein Forschungsstipendium von der Margaret Gunn Foundation for Animal Research.

....

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Materials
Acrodisc VorsatzfilterPALL4652
amicon Ultra-15 Zentrifugalfilter EinheitMilliporeUCF901024
BD 10 ml SeringeVWRCA75846-842
ChloramphenicolSigma-AldrichC0378
Corning Flaschenaufsatz VakuumfilterSigma-Aldrich431118
Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)Sigma-AldrichE4884
gentleMACS M TubeMiltenyi Biotec130-093-236
GuanidinhydrochloridSigma-AldrichG4505
ImidazolSigma-AldrichI5513
IsopropanolSigma-AldrichI9516
KanamycinsulfatSigma-Aldrich60615
Luria-Bertani (LB) BouillonThermoFisher Scientific12780029
MagnesiumchloridSigma-AldrichM9272
N2 Ergänzung (100X)ThermoFisher Scientific15502048
N-Lauroylsarcosin-Natriumsalz (Sarkosyl)Sigma-AldrichML9150
Nanosep Zentrifugalgeräte mit Omega-Membran 100KPALLOD100C34
Nunc DichtbänderThermoFisher Scientific232702
Parafilm MVWR52858-000
Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF)Sigma-AldrichP7626
ProteasehemmerTablette Roche
NatriumchloridSigma-AldrichS3014
NatriumdesoxycholatSigma-AldrichD6750
Natriumdodecylsulfat (SDS)Calbiochem7910-OP
NatriumphosphatSigma-Aldrich342483
Natriumphosphat zweibasisch wasserfreiSigma-AldrichS9763
Monobasisches Natriumphosphat-MonohydratSigma-AldrichS9638
Natriumphosphotungathydrat (NaPTA)Sigma-Aldrich496626
Thioflavin TSigma-AldrichT3516
Tris-Hydroxy-Methyl-Amino-Methan (Tris)Sigma-AldrichT6066
Triton-100Calbiochem9410-OP
Tween 20Sigma-AldrichP7949
NameCompanyKatalognummerKommentare
Kommerzielle Puffer und Lösungen
BugBuster Master MixNogagen71456-4
Ni-NTA SuperflowQiagen1018401
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) pH 7,4 (1X)Life TechnologiesP5493
UltraPure Distilled WaterInvitrogen10977015
NameCompanyKatalognummerKommentare
Standards und kommerzielle Kits
Express Autoinduktionssystem 1Novagen71300-4
Pierce BCA Protein Assay KitThermoFisher Scientific23227
NameCompanyKatalognummer<strong>Kommentare
Geräteeinrichtung
AKTA Proteinreinigungssysteme FPLCGE Healthcare Life Sciences
Beckman Avanti J-25 ZentrifugeBeckman Coulter
Beckman Rotor JA-25.50Beckman Coulter
Beckman Rotor JA-10Beckman Coulter
FLUOstar Omega Mikroplatten-ReaderBMG Labtech
gentleMACS DissoziatorMiltenyi Biotec130-093-235
NameCompanyKatalognummer<strong>Kommentare
Sofware
MARS DatenanalyseBMG Labtech
GraphPad Prism6GraphPad Software
4693159001:

Referenzen

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  1. Watts, J. C., Balachandran, A., Westaway, D. The expanding universe of prion diseases. PLoS Pathog. 2 (3), (2006).
  2. Wadsworth, J. D., Collinge, J. Update on human prion disease. Biochim Biophys Acta. 1772 (6), 598-609 (2007).
  3. Prusiner, S. B.

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Schlagwörter

CWD Prionen NachweisAnalyse von KotprobenNatrium Phosphowolframat Pr zipitationThioflavin T Fluoreszenzassayrekombinantes Prion Protein SubstratChronic Wasting DiseaseKotproben von CervidenPrion Seeding Aktivit tHochdurchsatz Screening

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