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Immunology and Infection

In tempo reale tremare-indotta conversione analisi per rilevazione di CWD prioni nel materiale fecale

Published: September 29, 2017 doi: 10.3791/56373
Automatic Translation
*1, *1, 2, 3, 3, 1
1Dept. of Ecosystem and Public Health, Calgary Prion Research Units, Faculty of Veterinary Medicine, University of Calgary, 2Dept. of Molecular Biology, University of Wyoming, 3Canadian Food Inspection Agency, Lethbridge Laboratories
* These authors contributed equally

Summary

Qui, presentiamo un protocollo per descrivere una tecnica di amplificazione del prion semplice, veloce ed efficiente, il metodo di conversione indotta da tremare in tempo reale (RT-QuIC).

Abstract

La tecnica RT-QuIC è un sensibili in vitro senza cellula del prion amplificazione saggio basato principalmente sul seminato misfolding e aggregazione del substrato di proteina (PrP) prionica ricombinante usando i semi del prion come modello per la conversione. RT-QuIC è una tecnica novella di alto-rendimento che è analoga alla reazione a catena della polimerasi in tempo reale (PCR). Rilevamento della crescita della fibrilla dell'amiloide è basato sul colorante Tioflavina T, che reagisce in su specifica interazione con proteine ricche ᵦ-foglio. Pertanto, la formazione dell'amiloide possa essere rilevati in tempo reale. Abbiamo tentato di sviluppare un test di screening non invasivo affidabile per rilevare i sprecare prioni (CWD) la malattia cronica in estratto fecale. Qui, in particolare abbiamo adattato la tecnica RT-QuIC per rivelare PrPSc semina attività nelle feci di CWD infettati cervidi. Inizialmente, l'attività di semina degli estratti fecali che abbiamo preparato era relativamente basso in RT-QuIC, probabilmente a causa di potenziali inibitori di dosaggio del materiale fecale. Per migliorare l'attività semina degli estratti di feci e rimuovere potenziali inibitori di dosaggio, abbiamo omogeneizzato i campioni fecali in un tampone contenente detergenti e inibitori della proteasi. Abbiamo anche presentato i campioni di diverse metodologie per concentrarsi PrPSc sulla base di precipitazione della proteina usando acido fosfotungstico sodio e forza centrifuga. Infine, gli estratti di feci sono stati testati da ottimizzato RT-QuIC che comprendeva la sostituzione del substrato nel protocollo per migliorare la sensibilità di rilevazione. Così, abbiamo stabilito un protocollo per rilevazione sensibile del prione CWD semina attività nelle feci di cervidi pre-clinici e clinici di RT-QuIC, che può essere uno strumento pratico per la diagnosi non invasiva di CWD.

Introduction

Malattie da prioni o encefalopatie spongiformi trasmissibili (TSE) sono disordini neurodegenerative compreso la malattia di Creutzfeldt – Jakob (CJD) negli esseri umani, l'encefalopatia spongiforme bovina (BSE) nei bovini, scrapie nelle pecore e capre e di sprecare cronica malattia (CWD) nei cervidi 1,2. Le TSE sono caratterizzate da aspetto spongiforme distintivo e perdita di neuroni nel cervello. Secondo l'ipotesi della "proteina solo", i prioni sono costituiti principalmente di PrPSc ('Sc' scrapie) 3, un'isoforma misfolded della proteina prionica cellulare host-codificati, PrPC. PrPSc risultante dalla conversione di PrPC in una conformazione arricchita in schede tecniche ᵦ 4,5,6 , che può agire come un seme di legare e convertire altre molecole di PrPC . Le molecole di PrPSc appena generate sono incorporate in un crescente polimero 7,8 , che si rompe in oligomeri più piccoli, con conseguente più alti numeri di nuclei infettivi. PrPSc è incline all'aggregazione ed è parzialmente resistente alle proteasi 9,10.

CWD colpisce selvatici e di allevamento degli alci (Cervus canadensis), cervo mulo (Odocoileus hemionus), cervi dalla coda bianca (WTD; Odocoileus virginianus), alce (Alces alces) e la renna (Rangifer tarandus tarandus) 11,12,13. È considerato la più contagiosa malattia prionica con trasmissione orizzontale favorito da interazioni di cervidi e persistenza ambientale di infettività 14,15. A differenza di altre malattie da prioni dove PrPSc accumulo e infettività sono confinati al cervello, in CWD questi si trovano anche in tessuti periferici e fluidi corporei es. saliva, urina e feci 16,17, 18.

Immunohistochemistry è considerato il gold standard per la diagnosi CWD rilevare la distribuzione di PrPSc e lesioni spongiformi 19,20. ELISA e in casi più rari, macchia occidentale sono utilizzati anche per la diagnostica CWD. Così, la diagnosi delle malattie da prioni attuale si basa principalmente sulla rilevazione di prioni in tessuti post-mortem. La diagnosi ante mortem per CWD è disponibile prendendo le tonsille o le biopsie di tessuto linfoide mucosa-collegato recto-anale (RAMALT); Tuttavia, questa procedura è invasiva e richiede la cattura degli animali. Pertanto, l'uso di esemplari facilmente accessibili, come urina e feci, sarebbe un modo pratico per il rilevamento del prion CWD. Tuttavia, quei harbor escrementi relativamente basse concentrazioni di prioni sotto il limite di rilevamento degli attuali metodi di diagnostici. Di conseguenza, è necessario uno strumento diagnostico più sensibile e più alta di velocità effettiva. Analisi in vitro sistemi di conversione, quali proteina misfolding ciclica amplificazione (PMCA) 21, amiloide semina analisi e conversione indotta da tremare in tempo reale (RT-QuIC) dosaggio 22,23, 24 sono strumenti molto potenti per sfruttare la capacità auto-moltiplicazione di PrPSc di mimare in vitro il processo di conversione da prioni e quindi amplificare la presenza di piccole quantità di PrPSc a livelli rilevabili 25 ,26. Tuttavia, il metodo RT-QuIC, sfrutta il fatto che il prodotto di conversione arricchito nella struttura secondaria β-foglio può legano specificamente Tioflavina T (Th-T). Di conseguenza, PrP ricombinante (rPrP) al momento della conversione seminato cresce in fibrille amiloidi che legano Th-T e pertanto possono essere rilevate in tempo reale misurando la fluorescenza della Th-T espresso in unità di fluorescenza relativa (RFU) nel corso del tempo. Una volta controllati, la RFU può essere utilizzata per valutare la relativa attività di semina e parametri quantitativi quali la fase di ritardo. La fase di ritardo rappresenta il tempo (h) necessario per raggiungere la soglia, durante il quale rPrP conversione nella fase iniziale della reazione è inferiore al limite di rilevazione di fluorescenza Th-T. Alla fine della fase di apparente ritardo, concomitante alla formazione di un nucleo dell'amiloide sufficiente (nucleazione/allungamento), si verifica quando la fluorescenza di Th-T supera il livello di soglia e diventa positiva. La crescita di amiloide fibrille possono essere rilevati in tempo reale e l'iniziale PrPSc o semina attività contenuta nel campione è amplificata dalla segmentazione che genera più semi. Questi semi inducono a sua volta una rapida fase esponenziale di crescita della fibra dell'amiloide.

Perché questo test è in grado di rilevare basso quanto 1 fg di PrPSc 24, l'alta sensibilità si qualifica questa tecnica per realizzare ante mortem o diagnosi non invasiva rilevando PrPSc in vari tessuti periferici, escrementi o altre tipi di campione che harboring i bassi livelli di infettività. RT-QuIC offre sicuramente vantaggi rispetto altri dosaggi per la sua riproducibilità, praticità, rapidità (meno di 50 h) e bassi costi rispetto alle analisi biologiche. Evita la complessità tecniche quali sonicazione utilizzato in PMCA; Inoltre, viene eseguita in una micropiastra nastro sigillato che minimizza il rischio di contaminazione dell'aerosol di ciascun pozzetto. Il formato multi-pozzetto permette l'analisi di fino a 96 campioni nello stesso esperimento. Per contrastare il problema ricorrente di falsi positivi e conversione spontanea di rPrP nelle analisi in vitro conversione l'implementazione di una soglia (cut-off) in RT-QuIC è molto utile. Infatti, sulla base dei risultati del controllo negativo (media RFU di campioni negativi + 5 SD 27), una linea di base è impostato da cui si può fare discriminazione tra positivi e negativi. L'uso di quattro repliche per ogni campione così può contribuire a definire un campione come positivo quando almeno il 50% dei replicati mostrano un segnale positivo, cioè attraversare il cut-off 28. L'omologia tra seme e substrato non è necessaria in RT-QuIC, come ad esempio in uno studio precedente, criceto rPrP è stato trovato per essere un substrato più sensibile rispetto al substrato omologo in umano PrPvCJD seminato e scrapie delle pecore seminato reazioni 29. criceto-pecore chimerico rPrP inoltre è stato suggerito un substrato più adatto rispetto umano rPrP per rilevare umano variante CJD prioni 30. Pertanto, l'utilizzo di substrati rPrP da diverse specie è molto comune in questo test. Questo test è stato applicato con successo a parecchie malattie da prioni, quali sporadiche CJD 31,32,33, gendi malattie da prioni etic 34, BSE 35,36,37, scrapie 23,36e CWD 38,39,40,41, 42. Gli studi che utilizzano elaborati del liquido cerebrospinale, sangue intero, saliva e urina come semi in RT-QuIC erano tutti di successo per rilevare PrPSc 38,39,40,41, 42. per favorire la capacità di rilevazione campioni come nel plasma sanguigno che possono contenere inibitori della formazione dell'amiloide, Orrú et al. (2011) ha sviluppato una strategia per rimuovere potenziali inibitori della formazione dell'amiloide da pettinatura PrPSc immunoprecipitazione (IP) passo e RT-QuIC, denominato "enhanced QuIC" dosaggio (eQuIC). Inoltre, un passo di sostituzione del substrato è stato impiegato dopo ~ 24 h tempo di reazione al fine di migliorare la sensibilità. In definitiva, come basso come 1 ag di PrPSc era rilevabile da eQuIC 30.

Al fine di purificare le feci estratti e rimuovere gli inibitori possibile dosaggio nelle feci, campioni di feci raccolti nelle fasi precliniche e cliniche da elk al momento dell'infezione orale sperimentale sono stati omogeneizzati in tampone contenente detergenti e inibitori della proteasi. Gli estratti di feci ulteriormente sono stati sottoposti a diverse metodologie per concentrarsi PrPSc nei campioni utilizzando la precipitazione della proteina tramite precipitazione di sodio fosfotungstico acido (NaPTA). Il metodo di precipitazione di NaPTA, in primo luogo descritto da Safar et al. 43, è usato per concentrare PrPSc in campioni di prova. L'incubazione di NaPTA con i risultati del campione in precipitazione preferenziale di PrPSc piuttosto che PrPC. Tuttavia, il meccanismo molecolare è ancora poco chiaro. Questo passaggio ha aiutato anche contenenti e impedendo la conversione spontanea del rPrP, che si osserva in alcuni casi. Infine, gli estratti di feci sono stati testati da ottimizzato RT-QuIC usando mouse rPrP (aa 23-231) come substrato e compresa la sostituzione del substrato nel protocollo per migliorare la sensibilità di rilevazione.

Qui i risultati dimostrano che questo metodo migliorato in grado di rilevare concentrazioni molto basse di prioni CWD e aumenta la sensibilità di rilevazione e specificità in campioni di feci rispetto a un protocollo senza sostituzione di precipitazione e substrato di NaPTA. Potenzialmente, questo metodo può essere applicato ad altri tessuti e fluidi corporei e può essere di grande utilità per la sorveglianza di CWD nei cervidi selvatici.

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Protocol

1. RT-QuIC utilizzando il materiale fecale

  1. preparazione di cervide feci estratti
    1. Make omogeneato fecale con l'aggiunta di 1 g di materiale fecale a 10 mL di feci estrarre buffer (20 mM sodio fosfato, pH 7.1, 130 mM NaCl, 0.05% Tween 20, 1 mM PMSF e 1 x completare inibitori della proteasi, privo di EDTA) per ottenere una concentrazione finale di 10% (p/v). Il buffer di omogeneizzazione possa essere preparato prima dell'utilizzazione e conservato a -20 ° C.
    2. Omogenizzazione pellet fecali (1 g) e buffer (10 mL) in tubi (ad es., gentleMACS M tubi) utilizzando un dissociatore con un programma preimpostato dal produttore per le proteine per 1 min a temperatura ambiente. Ripetere questo passaggio due o tre volte fino a quando i campioni di feci sono completamente omogeneizzati nel buffer.
    3. Guarnizione le provette con parafilm e metterli su un agitatore a dondolo piattaforma o rotativo per un 1 ore di incubazione a temperatura ambiente.
    4. Centrifugare le provette a 18.000 x g per 5 min a temperatura ambiente.
    5. Raccogliere i surnatanti che contengono la proteina estrae e aliquota in 1,5 mL provette. Le aliquote possono essere conservate a-80 ° C per ulteriori applicazioni.
  2. Concentrazione di PrP Sc nelle feci estrae
    Nota: al fine di concentrare i prioni CWD dei campioni di feci Estratto, migliorando così la sensibilità di rilevazione di RT-QuIC, viene aggiunto un passaggio di precipitazione della proteina per il protocollo.
    1. Metodo di precipitazione NaPTA
    2. Estratto di aggiungere 250 µ l di 10% (p/v) di N-lauryl sarcosinate (sarkosyl) a 1 mL di proteina fecale per ottenere una concentrazione finale di sarkosyl del 2% (v/v).
    3. Guarnizione dei tubi che contengono i campioni con parafilm e incubare a 37 ° C per 30 min sotto agitazione costante a 1.400 giri/min in un thermomixer.
    4. Regolare il mix di estratto proteico fecale e sarkosyl con una soluzione contenente 10% (p/v) di acido fosfotungstico sodio e 170 mM di cloruro di magnesio, pH 7.4 per ottenere una concentrazione finale di 0.3% (p/v) sodio acido fosfotungstico nei campioni.
    5. Incubare i campioni a 37 ° C per 2 h con agitazione costante a 400 giri/min.
    6. Centrifugare i campioni a 14 ° C per 30 min a 15.800 x g. rimuovere con attenzione i sovranatante.
    7. Lavare il pellet da loro ematico nel tampone di lavaggio (10 mM Tris-Cl, pH 7.5, NaCl 100 mM, 0,5% Triton-X100, 10mm EDTA, 0,5% sodio desossicolato (w/v) e 0,1% sarkosyl (w/v)).
    8. Centrifugare i campioni a 14 ° C per 15 min a 15.800 x g. rimuovere con attenzione i sovranatante.
    9. Risospendere il pellet in 100 µ l (1/10 del volume originale della proteina fecale estrarre) di tampone di diluizione RT-QuIC.
      Nota: RT-QuIC tampone di diluizione (fosfato di sodio di 20 mM, pH 6.9, 130 mM NaCl, 0.1% SDS (w/v) e 1 X N2 supplemento) è preparato prima dell'utilizzazione. Un volume totale di 10 mL è filtrato attraverso un filtro da 0,2 µm acrodisc siringa usando una siringa e poi conservato a-20 ° C fino all'utilizzo.
    10. Conservare i campioni di NaPTA trattato a-20 ° C fino al loro utilizzo nell'analisi di RT-QuIC.
  3. Analisi di RT-QuIC
    1. preparare una soluzione stock (0,032 g di Th-T in 10 mL di doppia distillata H 2 O) di fresco 10 mM Th-T.
    2. Fare una diluizione di 01:10 della soluzione di riserva in doppia distillata H 2 O per effettuare una concentrazione finale di Th-T di 1 mM il filtro attraverso una siringa di acrodisc 0,2 µm filtrare utilizzando una siringa Th-T.
    3. Disgelo del mouse ricombinante PrP (rPrP, aa 23-231) substrato (10 µ g/mL per reazione di RT-QuIC) conservato a -80 ° C il ghiaccio.
    4. Carico 500 µ l di substrato di rPrP in un momento in 100 kDa dimensione esclusione filtro microprovette e centrifugare a 14.000 x g per 5 min a temperatura ambiente (un tubo/filtro può essere utilizzato fino a due volte).
    5. Trasferire il substrato eluito in una provetta sterile 1,5 mL e tenerlo a 4 ° C fino all'utilizzo.
    6. Tampone di diluizione scongelare RT-QuIC conservati a -20 ° C.
      7. Tampone di diluizione
    7. make diluizioni del seme (estratto proteico fecale) in RT-QuIC:
      Campione non diluito: utilizzare l'Estratto di proteine fecale non diluito
      diluito 2 x 10 -1
      diluito 2 x 10 -2
      diluito 2 x 10 -3
    8. preparare soluzioni di riserva per RT-QuIC miscela di reazione:
      tampone fosfato salino ( PBS): 5 X
      NaCl: 2 M stock soluzione di NaCl preparato in doppio distillata H 2 O.
      100 mM EDTA: soluzione di EDTA preparato in doppia distillata H 2 O.
    9. Prima dell'utilizzo di tutte le soluzioni (punto 1.3.8), filtrare separatamente per ogni soluzione 0,2 µm acrodisc siringa filtro utilizzando una siringa e tenerli sterile a temperatura ambiente.
    10. Preparare un volume totale di RT-QuIC miscela di reazione in base al numero di campioni (98 µ l di volume di reazione per campione e quattro replica per campione) da utilizzarsi più 10% di questo volume per assicurarsi di avere abbastanza miscela per tutte le reazioni.
      1. Uso un tubo da 15 mL per preparare la miscela di reazione RT-QuIC (fosfato di sodio di 20 mM, pH 6,9, 300 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10 µM Th-T, 10 µ g/mL rPrP substrato e doppia acqua distillata per regolare la concentrazione finale di rPrP nella reazione) utilizzando il sol d'archivio utions.
      2. Mescolare tutte le soluzioni ben pipettando su e giù per mezzo di una pipetta con una punta di filtro. Evitare quanto più possibile l'uso di vortice.
      3. Versare il composto in un flacone di pipettaggio monouso 50ml.
      4. Utilizzare una pipetta multicanale per caricare 98 µ l di miscela di reazione di RT-QuIC in ciascun pozzetto di una piastra 96 pozzetti ottico inferiore.
    11. Aggiungere a ogni RT-QuIC reazione 2 µ l di non diluito o estratto proteico fecale in serie diluito 10 volte. Ogni campione di prova in quattro repliche.
      Nota: In ogni esperimento, diluizioni seriali di campioni di feci (che vanno da non diluito a 2 x 10 -3) da CWD-negativo e verificato CWD-positivi gli animali vengono utilizzati come controlli positivi e negativi, rispettivamente.
    12. Sigillare la piastra con un nastro sigillante prima incubazione in un lettore di piastra a 42 ° C per 25 h con ripetuti cicli di 1 min doppia orbitale agitazione (700 giri/min) e 1 min di riposo durante l'incubazione.
    13. Impostazioni di misura di fluorescenza Definisci:
      Eccitazione: 450 nm
      emissione: 480 nm
      leggere, basso numero di lampeggi: 20
      manuale del guadagno: 1000 (dipende dalla macchina)
      tempo d'integrazione: 20 µs
    14. togliere la piastra dal lettore della piastra all'estremità del h. 25
    15. Rotazione verso il basso la piastra a 3.000 x g per 3 min evitare possibili contaminazioni tra i pozzetti.
    16. Rimuovere il sigillo dalla piastra.
    17. Preparare una nuova piastra a 96 pozzetti aggiungendo 90 µ l di RT-QuIC miscela di reazione contenente substrato fresco e fresco fluorescenza tingere Th-T, come descritto nella sezione 1.3.1 a 1.3.6.
    18. Trasferire 10 µ l da ciascun pozzetto della piastra prima per il 96 appena preparato ben piatto.
    19. La nuova piastra di tenuta e continuare l'analisi di RT-QuIC per ulteriori 50 h seguendo la procedura descritta nel passaggio 1.3.13. Questo ulteriore passo di h 50 farà il tempo di reazione totale di h. 75
      Nota: Tutte le procedure di analisi di RT-QuIC vengono eseguite nell'ambito di biosicurezza.
    20. Raccogliere i dati.
      1. Lettura e documento il segnale di fluorescenza Th-T di ciascun pozzetto ogni 15 min.
      2. Raccogliere i dati dei cicli totale utilizzando software di analisi dei dati e trasferimento in un foglio di calcolo con la media delle reazioni quadruplicate.
      3. Plot le medie dei dati. L'asse x corrisponde al tempo di reazione di RT-QuIC (h) e l'asse y corrisponde alle unità relativa fluorescenza (RFU). Ogni curva corrisponde ad una diluizione di un campione noto.
      4. In ogni esperimento, delimitano una soglia di calcolare i valori medi più alti del controllo negativo plus 5 deviazioni standard come descritto nella corrente pubblicato letteratura 41.
        NOTA: Tutte le repliche che ha attraversato la soglia vengono considerate positive. Se almeno due su quattro repliche varcare la soglia, il campione viene quindi considerato positivo.

2. Purificazione della proteina prionica ricombinante (rPrP)

  1. crescita dello stock batterici ed espressione di rPrP
    Nota: Escherichia coli (Escherichia coli) ceppo Rosetta (DE3) trasformata con vettore animale-24 codifica il mouse PrP (residui 23-231) è stato utilizzato per preparare il rPrP.
    1. Scongelare Stock in glicerolo di Rosetta (DE3) trasformato con animali-24 mPrP(23-231) su ghiaccio.
    2. Striscia LB (Luria Bertani) piastre con una concentrazione finale di kanamicina 50 µ g/ml e incubare per una notte in un incubatore a 37 ° C. Assicurarsi che le piastre sono capovolte per evitare la condensazione di umidità in terreni solidi contenenti i batteri. Preparare due piastre per assicurarsi di avere crescita in almeno una delle due piastre.
    3. Preparare 1 L di LB e autoclave per renderlo sterile.
    4. Supplemento 1 L di terreno sterile LB con 1 mL di kanamicina (50 mg/mL) e 1 mL di cloramfenicolo (34 mg/mL).
    5. Prendere una colonia di ciascuna piastra tramite un ciclo di inoculazione monouso per inoculare 3 mL di terreno LB contenente kanamicina e cloramfenicolo.
    6. Posto il mini-culture in un incubatore a 37 ° C con agitazione costante a 225 giri/min per 5-6 h.
    7. Aggiungere il mini-culture al resto dell'originale l 1 del LB media insieme con Express autoinduzione sistema 1 per l'induzione dell'espressione della proteina.
    8. Luogo la cultura in pallone da 2 L, o superiore, in un incubatore a 37 ° C con agitazione costante a 200 rpm per 20-24 h.
    9. Dividere la cultura 1L in provette da centrifuga 4 x 250 mL.
    10. Rotazione verso il basso le provette contenenti la cultura a 3.750 x g per 20 min a temperatura ambiente.
    11. Scartare il surnatante e raccogliere il pellet batterico in provette da centrifuga 50ml, poi congelarli a-80 ° C fino a ulteriore elaborazione. Il pellet risultante hanno pesato 3 a 4 g per una resa buona proteina.
  2. Preparazione del corpo di inclusione
    1. scongelare il pellet congelato (3-4 g) a 37 ° C per pochi minuti.
    2. Congelare il pellet ancora una volta per 10 min a-80 ° C e scongelare nuovamente. Ripetere questo passaggio di congelamento e scongelamento altre due volte.
    3. Risospendere il pellet batterico in 1 X reagente di lisi (ad es. BugBuster Master Mix) pipettando accuratamente. Uso 5 mL del reattivo per 1 g di pellet batterica. Assicurarsi di omogeneizzare completamente il mix.
    4. Incubare l'omogenato su un agitatore meccanico per 20 min a temperatura ambiente.
    5. Centrifugare l'omogeneizzato a 16.000 x g per 20 min a temperatura ambiente.
    6. Scartare i surnatanti versando attentamente off.
    7. Omogeneizzare le palline nello stesso volume di reagente di lisi come utilizzato nel passaggio precedente: 1x.
    8. Incubare l'omogeneizzato per 15 minuti su un agitatore meccanico a temperatura ambiente.
    9. Aggiungere un volume sufficiente di 01:10 (0,1 x) reagente di lisi per ottenere un volume totale di omogenato di 40 mL. Mix di inversione per assicurarsi omogeneizzare bene.
    10. Centrifugare l'omogeneizzato a 7.900 x g per 15 min a 4 ° C.
    11. Scartare il surnatante versando attentamente esso.
    12. Risospendere il pellet in 40 mL di 0,1 x reagente di lisi.
    13. Centrifugare l'omogeneizzato a 16.000 x g per 15 min a 4 ° C.
    14. Scartare il surnatante attentamente versandolo e memorizzare il pellet contenente i corpi di inclusione a-20 ° C fino a ulteriore elaborazione.
  3. Purificazione della proteina
    1. scongelare i corpi di inclusione a temperatura ambiente.
    2. Sciogliere i corpi di inclusione scongelati in 14 mL di 8m guanidina-HCl (cloridrato della guanidina 38g in 0.1 M NaPO 4 pH 8.0 e riempimento la sospensione con H 2 O a 50 mL; non regolate il pH alla soluzione finale) per solubilizzare le proteine.
    3. Assicurarsi omogeneizzare bene pipettando su e giù.
    4. Incubare il lisato su un agitatore meccanico a temperatura ambiente per 50 min.
    5. Preparare 18 g di resina Ni-NTA Perline (18 g per 3-4 g di pellet batterica); risciacquarli con 100 mL di acqua utilizzando vuoto e un filtro superiore 100 mL 0,22 µm bottiglia.
      1. Mettere il 18 g di perle di resina Ni-NTA nel tubo da 50 mL e aggiungere un volume sufficiente di denaturare buffer (100 mM fosfato di sodio, 10 mM Tris, pH 8.0, 6m guanidina, pH 8) per rendere il volume finale fino a 50 mL.
      2. Equilibrare le perline nel buffer denaturante per 50 minuti su un agitatore meccanico a temperatura ambiente.
    6. Centrifugare il corpo di inclusione lisato a 16.000 x g per 5 min rimuovere i residui insolubili.
    7. Aggiungere il supernatante ai branelli equilibrati e scartare i pellet.
    8. Mettere il mix su un rocker per 40 min a temperatura ambiente per consentire il legame con le proteine alla resina Ni-NTA.
      Nota: Perline chelati di nichel sono utilizzati per purificare PrP da sua affinità di nichel. La regione N-terminale di istidina-ricca di PrP rende l'affinità al nickel, che la proteina permette di associare a nichel ioni senza qualsiasi his-tag.
    9. FPLC lavare con acqua per pulire entrambe le linee (A e B).
    10. Eseguire buffer denaturante (100mm fosfato di sodio, 10 millimetri Tris, pH 8.0, 6m guanidina, pH 8) tramite entrambe le linee (A e B) per innescare il sistema (la colonna è non ancora associata).
    11. Caricare la resina sulla colonna. Fare in modo di ridurre al minimo le bolle d'aria.
    12. Fissare la colonna per il FPLC ed eseguire una sfumatura lineare da 100% denaturare tampone A e 0% di refolding tampone B (fosfato di sodio di 100 mM, 10 mM Tris, pH 8.0) in un primo momento a 0% denaturing buffer e ripiegamento buffer alla fine al 100%. Questo graduale spostamento viene eseguito ad una portata di 0,75 mL/min per 240 min ed è necessaria per il corretto ripiegamento della PrP.
      Nota: Durante il processo di purificazione cromatografica, il PrP denaturato è prima lentamente riavvolgerlo sulla resina applicando una sfumatura lineare di refolding tampone per sostituire il buffer denaturante. Questo passaggio rimuove anche il caotropici guanidina-HCl.
    13. Assicurarsi che il buffer di refolding 100% continua a fluire attraverso la colonna per altri 30 min a 0,75 mL/min.
      14. Linea
    14. risciacquo con acqua seguita da tampone di eluizione (100 mM sodio fosfato 10 mM Tris, imidazolo 500 mM, pH 5,8) bypassando la colonna. Questo modo si pulirà il buffer denaturante che è stato sostituito ora dal buffer di eluizione nel sistema AKTA.
    15. Elute proteina a 2 mL/min eseguendo una sfumatura lineare per 40 min da 100% ripiegamento buffer B e 0% tampone di eluizione A in un primo momento a 0% ripiegamento buffer e buffer di eluizione del 100%.
      Nota: L'alta concentrazione di imidazolo in tampone di eluizione gareggeranno PrP ' associazione di s per il nickel. Il picco di proteina primaria dovrebbe iniziare per eluire circa 1/3 del modo attraverso il gradiente.
      1. Guarda il cromatogramma per OD 280 nm ad aumentare.
    16. Raccogliere solo le provette contenenti la proteina al centro del grande picco.
      Nota: Le frazioni eluite di 2 mL ciascuno vengono raccolti in provette da 15 mL.
    17. Diluire la proteina contenuta nei tubi immediatamente con circa 1/3 del volume (1 mL) di tampone di dialisi (fosfato di sodio di 10 mM, pH 5,8).
    18. Posizionare immediatamente i tubi sul ghiaccio.
    19. La proteina eluita contenuta nei tubi della piscina.
    20. Povero la proteina nelle cassette di dialisi (peso molecolare cut-off 10 kDa).
    21. Mettere le cassette nel buffer di pre-refrigerati dialisi (3,6 L) per 2 ore a 4 ° C, quindi trasferire le cassette in un buffer di dialisi fresca (3,6 L) per una notte. Fare sicuri che il buffer di dialisi è sotto costante agitazione.
    22. Filtro proteina dopo dialisi attraverso un filtro da 0,2 µm acrodisc siringa usando una siringa.
    23. Misurare la concentrazione di proteine utilizzando un kit di analisi della proteina BCA.
    24. Concentrato o diluire se necessario regolare la concentrazione di proteina a 0,3 mg/mL.
      Nota: Confermare purezza da SDS-PAGE e macchiatura blu di Coomassie.
    25. Rendere le aliquote di 1 mL di proteina in provette per microcentrifuga e immediatamente conservare a-80 ° C fino al successivo utilizzo, come descritto nel protocollo RT-QuIC.

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Representative Results

Gli estratti fecali CWD preparati al 10% (p/v) erano in grado di reazione RT-QuIC del seme, tuttavia la sensibilità di rilevazione era basso 27. Utilizzando un buffer specifico per omogeneizzazione fecale era un passaggio fondamentale per evitare la fluorescenza di fondo alto in reazioni RT-QuIC concomitante all'uso del substrato rPrP mouse piuttosto che rPrP di cervi che ha permesso di ottenere più specifici risultati 27. L'aggiunta di NaPTA precipitazioni ha ridotto la conversione spontanea di rPrP in RT-QuIC (Figura 1) senza inibire l'amplificazione dell'attività semina delle reazioni (Figura 2). Anche se la migliore amplificazione è stata osservata dopo trattamento NaPTA, segnali di fluorescenza risultante di campioni fecali CWD-positivi erano ancora bassa (Figura 1). Inoltre, l'amplificazione del prion di alcuni campioni ha raggiunto un plateau costante a livelli di bassa fluorescenza. Questo indica la saturazione delle reazioni, che può essere dovuto la degradazione/denaturazione di rPrP o la formazione di aggregati di fuori via che consumano la piscina di rPrP 30. Per migliorare l'amplificazione dei prioni ulteriormente e migliorare la sensibilità di rilevazione, un passo di sostituzione del substrato fu incorporato il protocollo. L'introduzione della sostituzione del substrato del protocollo RT-QuIC (Figura 2) ha aumentato la sensibilità (77%; 14 su 18 campioni in RT-QuIC erano positivi) e specificità (100%; nessuno dei controlli negativi in RT-QuIC tornito positivo) di rilevazione (Vedi Tabella 1 da Cheng et al. 27). Infine, tutti questi passaggi (Figura 3) ha condotto all'ottimizzazione di un protocollo affidabile e sensibile per la rilevazione di RT-QuIC dei prioni CWD, utilizzando il campione contenente bassi livelli di infettività.

Sostituzione del substrato è stato introdotto dopo il primo 25 h di reazione RT-QuIC, riempiendo la reazione tampone substrato fresco e fresco fluorescenza tinta Th-T. Introducendo il passo di sostituzione del substrato nel protocollo, il tempo di reazione di RT-QuIC è stata estesa da 50 h a 75 h. Come illustrato nella Figura 2 con l'incorporazione della sostituzione del substrato, è stato osservato un miglioramento significativo dell'amplificazione del prion.

Figure 1
Figura 1: ridotta conversione spontanea del substrato rPrP mouse in RT-QuIC seminato con purificato CWD-negativi fecale omogeneato. Fecali omogeneati dell'alce non infetti (C181-006) o cervo mulo sono stati omogeneizzati in feci Estratto di buffer per ottenere una concentrazione finale di 10% (p/v). Per la purificazione, questi omogeneati fecali sono stati elaborati e 10 - volte concentrati dalla precipitazione di NaPTA. L'impura fecali omogeneati (un), forme NaPTA-purificata e concentrate (b) diluiti come indicato sono stati utilizzati per RT-QuIC quadruplicate reazioni con rPrP del mouse come un substrato di semi. La y Visualizza unità relative fluorescenza Th-T, che il x-axes raffigurano il tempo di reazione. Una riduzione delle conversioni spontanee è stata veduta in campioni fecali NaPTA-purificato (b). Dati utilizzati da Cheng et al. 27. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2. Migliorato il rilevamento dei prioni CWD nelle feci mediante sostituzione del substrato. Omogeneati fecali di alce individuali (C051-05, C052 di-05) oralmente infettati con i prioni CWD erano purificati e concentrati da precipitazione di NaPTA. NaPTA-trattati campioni sono stati diluiti tra 2 x 10-1 a 2 x 10-3 utilizzato per reazioni di RT-QuIC quadruplicate seme con substrato rPrP del mouse. L'analisi di RT-QuIC è stato effettuato senza sostituzione di substrato (un) in un periodo normale di 50 h o con l'incorporazione della sostituzione di substrato per un periodo di incubazione estesa di 75 h (b). Per quest'ultimo, sostituzione di substrato è stato introdotto dopo il primo 25 h di reazione RT-QuIC. Novanta per cento del volume di reazione è stato rimosso e sostituito da preparata RT-QuIC miscela di reazione contenente substrato rPrP e Th-T. Introducendo il passo di sostituzione del substrato nel protocollo, il tempo di reazione di RT-QuIC è stata estesa da 50 h-h. 75 dati utilizzati da Cheng et al. 27. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: diagramma di flusso che descrive PrPSc estrazione fecale da CWD-infettati cervidi e semina amplificazione del prione e attività usando RT-QuIC test. Campioni di feci da animali affetti da CWD sono omogeneizzati in un tampone di estrazione fecale, sottoposti al metodo di precipitazione di NaPTA e testati dall'analisi di RT-QuIC. Quest'ultima è stata eseguita mediante l'introduzione di un passo di sostituzione del substrato. L'incorporazione della procedura di sostituzione NaPTA e substrato è provocato da una riduzione di conversione spontanea e forte miglioramento nella semina amplificazione del prione e attività. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

RT-QuIC precedentemente è stata impiegata per rilevare i prioni CWD in urina ed estratti fecali di oralmente infetti cervi bianco - muniti e cervo mulo 38. Il sistema illustrato in questo manoscritto è un metodo adattato del dosaggio RT-QuIC. Passaggi aggiuntivi furono incorporati nell'analisi di RT-QuIC "classica" per migliorare la rilevazione e la sensibilità del dosaggio per i prioni CWD nel materiale fecale degli animali infetti.

La bassa sensibilità di rilevazione in feci estratti ci ha portato al miglioramento del protocollo RT-QuIC. Per ottenere sensibili in vitro rilevamento dei prioni nelle feci, passaggi critici sono stati aggiunti per la preparazione del campione al fine di rimuovere i componenti che interferiscono con conversione prione e/o propagazione e migliorano la sensibilità di rilevazione. Incorporando la sostituzione del substrato nel protocollo di RT-QuIC e trattamento NaPTA/sarkosyl era critica per la rilevazione di attività di semina a elk CWD-infettati pre-clinici e clinici e per migliorare i limiti di rilevazione di conversione prione in estratti di feci .

NaPTA precipitazione è una tecnica comune di solito accompagnata da sarkosyl estrazione per isolare e concentrare PrPSc a un livello rilevabile. NaPTA è noto per precipitare preferibilmente PrPSc sopra PrPC 43 mentre sarkosyl è un detergente noto per facilitare la conversione di prione a basse concentrazioni in una cella libera sistema 44. In linea con questo, utilizzando una combinazione di NaPTA e sarkosyl potrebbe generare un rendimento più elevato di aggregati fibrillari in vitro come mostrato prima 45,46,47. Questa metodologia è stata incorporata in precedenza in RT-QuIC test per rilevare i prioni CWD periferici con successo nell'esemplare come saliva purificata 39 e sangue intero 40. Il nostro studio fornisce la prima prova che incorporando NaPTA/sarkosyl purificazione nel protocollo di preparazione del campione fecale consente il rilevamento di prioni CWD di RT-QuIC. Inoltre, con questa metodologia, siamo riusciti a ridurre la conversione spontanea del substrato rPrP in omogeneati fecali CWD-negativo nell'analisi di RT-QuIC.

Un potenziale meccanismo è stato proposto per spiegare l'effetto di substrato sostituzione 30. Nel primo round della reazione (prima dell'aggiunta del substrato fresco), solo una piccola quantità di semi viene aggiunto alle reazioni di RT-QuIC. Mentre solo una parte del rPrP è inglobata le reazioni teste di serie, il resto del substrato può essere utilizzato sia interagendo con le pareti dei pozzetti della piastra reazione a formare aggregati non amiloidi, o alterato per una forma che è meno incline a essere convertito dalla sede DED RT-QuIC prodotti piuttosto che i semi originali. Di conseguenza, il tasso di incorporazione di rPrP ai semi è lento, e la formazione di fibrille non è rilevabile nella fase di ritardo. Come le teste di serie RT-QuIC prodotti coltivati nella fase di ritardo sono finalmente allungati per raggiungere una "fase di montaggio rapido", i prioni possono essere rapidamente amplificato dalla segmentazione attraverso agitazione o laterale aggiunta di piccoli aggregati. In questa fase, il substrato fresco aggiunto alla reazione è prontamente integrato le teste di serie prodotti piuttosto che formando aggregati aspecifici. L'incorporazione del passo di sostituzione del substrato nel nostro protocollo era una modifica che una maggiore sensibilità; e ' stato utile per rilevare i semi da prioni nei campioni con una quantità molto bassa di PrPSc da animali pre-clinici e/o contenenti composti inibitori.

Utilizzando analisi di RT-QuIC anziché PMCA, che è la prima proteina in vitro misfolding analisi di amplificazione descritto 21, ha diversi vantaggi. In PMCA i tubi sono incubati e sonicati in bagno d'acqua contenuto all'interno del sonicatore; i tubi posizionati alla periferia del sonicatore mostrano un'efficacia minore di amplificazione rispetto ai tubi posizionati nel centro 48. Il sistema di RT-QuIC tremare sembra essere più facile da controllare. L'uso di un formato ben 96 è un reale vantaggio di RT-QuIC, tuttavia, il mb-PMCA sviluppato da Moudjo et al. 49 , 50, ha mostrato benefici simili, ma ancora è meno usato in PMCA.

Come substrato, RT-QuIC utilizza rPrP ricombinante per la conversione; al contrario, PMCA nella maggior parte dei casi utilizza omogeneato del cervello normale. Inoltre, in RT-QuIC alcuna omologia di sequenza non è necessaria tra seme e substrato 51–53.

La presenza di cofattori è necessaria per la replicazione prionica in PMCA e il prodotto risultante è contagioso. Tuttavia, nell'analisi di RT-QuIC, il PrP amplificato non è contagiosa. Nelle analisi di amplificazione in vitro l'avvenimento di reazioni falsamente positive molto probabilmente a causa della conversione spontanea di PrPC è un problema ricorrente. Pertanto, il dosaggio e condizioni utilizzate in questo studio sono state ideate per minimizzare tali dispersioni per massimizzare la differenza tra teste di serie rPrP-conversione e la conversione spontanea.

In conclusione, il trattamento NaPTA/sarkosyl permette alla rimozione degli inibitori di dosaggio nelle feci e riduce la conversione spontanea. Interessante, il trattamento non ha fatto ostacolo alla semina attività di precipitatedPrPSc. Inoltre, la sensibilità di rilevazione è stata migliorata significativamente quando la sostituzione del substrato è stato adottato in concomitanza.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Siamo grati al Dr. Byron Caughey (NIH Rocky Mountain Laboratories) per fornire formazione ed il plasmide di espressione batterica PrP cervide. SG è supportato dal programma Canada Research Chair. Riconosciamo che il finanziamento per la ricerca a SG di Genome Canada, Prion Alberta Research Institute, Alberta agricoltura e silvicoltura attraverso Genome Alberta e l'Università di Calgary a sostegno di questo lavoro. Riconosciamo un assegno di ricerca dalla Margaret Gunn Foundation for Animal Research.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials
Acrodisc seringe filters PALL 4652
amicon Ultra-15 Centrifugal filter Unit Millipore UCF901024
BD 10 ml seringe VWR CA75846-842
Chloramphenicol Sigma-Aldrich C0378
Corning bottle-top vacuum filters Sigma-Aldrich 431118
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich E4884
gentleMACS M Tube Miltenyi Biotec 130-093-236
Guanidine hydrochloride Sigma-Aldrich G4505
Imidazole Sigma-Aldrich I5513
Isopropanol Sigma-Aldrich I9516
Kanamycin sulfate Sigma-Aldrich 60615
Luria-Bertani (LB) broth ThermoFisher Scientific 12780029
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M9272
N2 supplement (100X) ThermoFisher Scientific 15502048
N-lauroylsarcosine sodium salt (sarkosyl) Sigma-Aldrich ML9150
Nanosep centrifugal devices with omega membrane 100K PALL OD100C34
Nunc sealing tapes ThermoFisher Scientific 232702
Parafilm M VWR 52858-000
phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Sigma-Aldrich P7626
Protease inhibitor tablet Roche 4693159001
Sodium chloride Sigma-Aldrich S3014
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich D6750
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Calbiochem 7910-OP
sodium phosphate Sigma-Aldrich 342483
Sodium phosphate dibasic anhydrous Sigma-Aldrich S9763
Sodium phosphate monobasic monohydrate Sigma-Aldrich S9638
Sodium phosphotungstate hydrate (NaPTA) Sigma-Aldrich 496626
Thioflavin T Sigma-Aldrich T3516
Tris-Hydroxy-Methyl-Amino-Methan (Tris) Sigma-Aldrich T6066
Triton-100 Calbiochem 9410-OP
Tween 20 Sigma-Aldrich P7949
Name Company Catalog Number Comments
Commercial buffers and solutions
BugBuster Master Mix Nogagen 71456-4
Ni-NTA superflow Qiagen 1018401
Phosphate-buffered saline (PBS) pH 7.4 (1X) Life Technoligies P5493
UltraPure Distilled Water Invitrogen 10977015
Name Company Catalog Number Comments
Standards and commercial kits
Express Autoinduction System 1 Novagen 71300-4
Pierce BCA Protein Assay Kit ThermoFisher Scientific 23227
Name Company Catalog Number Comments
Equipment setup
AKTA protein purification systems FPLC GE Healthcare Life Sciences
Beckman Avanti J-25 Centrifuge Beckman Coulter
Beckman rotor JA-25.50 Beckman Coulter
Beckman rotor JA-10 Beckman Coulter
FLUOstar Omega microplate reader BMG Labtech
gentleMACS Dissociator Miltenyi Biotec 130-093-235
Name Company Catalog Number Comments
Sofware
MARS Data Analysis BMG Labtech
GraphPad Prism6 GraphPad software

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Cheng, Y. C., Hannaoui, S., John, T. R., Dudas, S., Czub, S., Gilch, S. Real-time Quaking-induced Conversion Assay for Detection of CWD Prions in Fecal Material. J. Vis. Exp. (127), e56373, doi:10.3791/56373 (2017).

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