Hier präsentieren wir ein Protokoll, um eine einfache, schnelle und effiziente Prion-Verstärkung-Technik, die Echtzeit-Beben-induzierte (RT-QuIC) Konvertierungsmethode beschreiben.
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Methodenartikel
Echtzeit-Beben-induzierte Umwandlung Test zur Erkennung von CWD Prionen in Fäkalien
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die RT-QuIC-Technik ist ein sensibler in-vitro- zellfreie Prion Verstärkung Assay basiert hauptsächlich auf die kernigen Fehlfaltung und Aggregation von rekombinanten Prion Protein (PrP) Substrat mit Prion Samen als Vorlage für die Konvertierung. RT-QuIC ist eine neuartige Hochdurchsatz-Technik, analog zur Real-Time Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Nachweis von Amyloid Fibrille Wachstum basiert auf den Farbstoff Thioflavin T, die auf spezifische Wechselwirkung mit ᵦ-Blatt reichen Proteinen fluoresziert. So kann Amyloid Bildung in Echtzeit erkannt werden. Wir haben versucht, zuverlässige nicht invasive Screening-Test zur Erkennung von chronischen wasting Disease (CWD) Prionen in fäkale Extrakt zu entwickeln. Hier haben wir speziell die RT-QuIC Technik zu offenbaren, dass PrPSc Aussaat Aktivität im Kot von CWD Hirschartigen infiziert. Anfangs war die Sämaschinen Aktivität der fäkalen Extrakte, die wir vorbereitet in RT-QuIC, möglicherweise wegen eines möglichen Assay-Hemmer im fäkalen Material relativ gering. Zur Verbesserung Sämaschinen Aktivität von Kot-Extrakten und entfernen mögliche Assay-Inhibitoren, homogenisiert wir Stuhlproben in einem Puffer mit Wasch- und Protease-Inhibitoren. Wir reichten auch Proben unterschiedlicher Methoden, PrPSc auf der Grundlage von Proteinfällung mit Natrium Phosphotungstic Acid und Zentrifugalkraft zu konzentrieren. Schließlich wurden die Kot-Extrakte durch optimierte RT-QuIC getestet, die Substrat-Ersatz in das Protokoll zur Verbesserung der Nachweisempfindlichkeit enthalten. So haben wir ein Protokoll für empfindliche Detektion von CWD Prion Aussaat Aktivität im Kot der vorklinischen und klinischen Hirschartigen durch RT-QuIC, die ein praktisches Werkzeug für nichtinvasive Diagnostik der CWD sein kann.
Einleitung
Prion-Krankheiten oder transmissiblen spongiformen Enzephalopathien (TSE) sind Neurodegenerative Erkrankungen einschließlich der Creutzfeldt - Jakob-Krankheit (CJK) beim Menschen, bovine spongiforme Enzephalopathie (BSE) bei Rindern, Scrapie bei Schafen und Ziegen und chronische verschwenden Disease (CWD) in Hirschartigen 1,2. TSE zeichnen sich durch markante spongiforme aussehen und Verlust von Nervenzellen im Gehirn. Nach der Hypothese "Protein nur" sind Prionen hauptsächlich bestehend aus PrPSc ("Sc" für Scrapie) 3, fehlgefaltete Isoform des Host-kodierten zellulären Prion....
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Protokoll
1. RT QuIC mittels fäkal Material
- machen Aufstellungdes Cervid Kot extrahiert fäkale Homogenat durch Zugabe von 1 g fäkal Material bis 10 mL von Kot extrahieren Puffer (20 mM Natriumphosphat, pH 7,1, 130 mM NaCl, 0,05 % Tween 20, 1 mM PMSF und 1 X komplette Protease-Inhibitoren, EDTA-frei), eine Endkonzentration von 10 % (w/V) zu geben. Der Homogenisierung Puffer kann vor der Nutzung vorbereitet und bei-20 ° c
- Homogenize fäkale Pellets (1 g) und Puffer (10 mL) in Tuben (z. B. GentleMACS M Rohre) mit einem Dissociator mit einem vorgegebenen Programm vom Hersteller für Proteine für 1 min bei Raumtemperatur. Wiederholen Sie ....
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Ergebnisse
Die CWD fäkale Extrakte vorbereitet bei 10 % (w/V) konnten RT QuIC Reaktion Samen, doch die Nachweisempfindlichkeit war niedrige 27. Mit einem speziellen Puffer für fäkale Homogenisierung war ein entscheidender Schritt, hohe Hintergrundfluoreszenz in RT QuIC begleitende Reaktionen auf die Verwendung der Maus rPrP Substrat zu vermeiden, anstatt Hirsch rPrP ermöglichte man genauere Ergebnisse 27. Die Zugabe von NaPTA Niederschlag verringert di.......
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Diskussion
RT-QuIC war zuvor beschäftigt, CWD Prionen in Urin und fäkale Extrakte von mündlich infizierten weiß - angebundene Rotwild und Maultierhirsche 38zu erkennen. Das System in diesem Manuskript gezeigt ist eine angepasste Methode des RT-QuIC Assays. Weitere Schritte wurden in der "klassischen" RT-QuIC Assay zur Verbesserung der Erkennung und Empfindlichkeit des Assays für CWD Prionen in Fäkalien infizierter Tiere aufgenommen.
Die niedrige Nachweisempfindlichkeit im Kot Extr.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Danksagungen
Wir sind dankbar, Dr. Byron Caughey (NIH Rocky Mountain Laboratories) für die Ausbildung und das Cervid PrP bakterielle Expressionsplasmid. SG wird vom Canada Research Chair Programm unterstützt. Wir anerkennen die Fördermittel für diese Forschung zu SG Genome Kanada, Alberta Prion Research Institute und Alberta Land- und Forstwirtschaft durch Genom Alberta und der University of Calgary zur Unterstützung dieser Arbeit. Wir erkennen ein Forschungsstipendium von der Margaret Gunn Foundation for Animal Research.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Materials | |||
| Acrodisc Vorsatzfilter | PALL | 4652 | |
| amicon Ultra-15 Zentrifugalfilter Einheit | Millipore | UCF901024 | |
| BD 10 ml Seringe | VWR | CA75846-842 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| Corning Flaschenaufsatz Vakuumfilter | Sigma-Aldrich | 431118 | |
| Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) | Sigma-Aldrich | E4884 | |
| gentleMACS M Tube | Miltenyi Biotec | 130-093-236 | |
| Guanidinhydrochlorid | Sigma-Aldrich | G4505 | |
| Imidazol | Sigma-Aldrich | I5513 | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| Kanamycinsulfat | Sigma-Aldrich | 60615 | |
| Luria-Bertani (LB) Bouillon | ThermoFisher Scientific | 12780029 | |
| Magnesiumchlorid | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| N2 Ergänzung (100X) | ThermoFisher Scientific | 15502048 | |
| N-Lauroylsarcosin-Natriumsalz (Sarkosyl) | Sigma-Aldrich | ML9150 | |
| Nanosep Zentrifugalgeräte mit Omega-Membran 100K | PALL | OD100C34 | |
| Nunc Dichtbänder | ThermoFisher Scientific | 232702 | |
| Parafilm M | VWR | 52858-000 | |
| Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| Proteasehemmer | Tablette Roche | ||
| Natriumchlorid | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Natriumdesoxycholat | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| Natriumdodecylsulfat (SDS) | Calbiochem | 7910-OP | |
| Natriumphosphat | Sigma-Aldrich | 342483 | |
| Natriumphosphat zweibasisch wasserfrei | Sigma-Aldrich | S9763 | |
| Monobasisches Natriumphosphat-Monohydrat | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| Natriumphosphotungathydrat (NaPTA) | Sigma-Aldrich | 496626 | |
| Thioflavin T | Sigma-Aldrich | T3516 | |
| Tris-Hydroxy-Methyl-Amino-Methan (Tris) | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| Triton-100 | Calbiochem | 9410-OP | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P7949 | |
| Name | Company | Katalognummer | Kommentare |
| Kommerzielle Puffer und Lösungen | |||
| BugBuster Master Mix | Nogagen | 71456-4 | |
| Ni-NTA Superflow | Qiagen | 1018401 | |
| Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) pH 7,4 (1X) | Life Technologies | P5493 | |
| UltraPure Distilled Water | Invitrogen | 10977015 | |
| Name | Company | Katalognummer | Kommentare |
| Standards und kommerzielle Kits | |||
| Express Autoinduktionssystem 1 | Novagen | 71300-4 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23227 | |
| Name | Company | Katalognummer< | strong>Kommentare |
| Geräteeinrichtung | |||
| AKTA Proteinreinigungssysteme FPLC | GE Healthcare Life Sciences | ||
| Beckman Avanti J-25 Zentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Beckman Rotor JA-25.50 | Beckman Coulter | ||
| Beckman Rotor JA-10 | Beckman Coulter | ||
| FLUOstar Omega Mikroplatten-Reader | BMG Labtech | ||
| gentleMACS Dissoziator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Name | Company | Katalognummer< | strong>Kommentare |
| Sofware | |||
| MARS Datenanalyse | BMG Labtech | ||
| GraphPad Prism6 | GraphPad Software |
Referenzen
- Watts, J. C., Balachandran, A., Westaway, D. The expanding universe of prion diseases. PLoS Pathog. 2 (3), (2006).
- Wadsworth, J. D., Collinge, J. Update on human prion disease. Biochim Biophys Acta. 1772 (6), 598-609 (2007).
- Prusiner, S. B.
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Nachdrucke und Genehmigungen
