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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Em tempo real a tremer induzida por conversão ensaio para detecção de príons CWD em Material Fecal

Published: September 29, 2017 doi: 10.3791/56373
Automatic Translation
*1, *1, 2, 3, 3, 1
1Dept. of Ecosystem and Public Health, Calgary Prion Research Units, Faculty of Veterinary Medicine, University of Calgary, 2Dept. of Molecular Biology, University of Wyoming, 3Canadian Food Inspection Agency, Lethbridge Laboratories
* These authors contributed equally

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para descrever uma técnica de amplificação de prião simples, rápido e eficiente, o método de conversão de tremor induzido em tempo real (RT-QuIC).

Abstract

A técnica de RT-QuIC é um sensível em vitro príon celular livre amplificação ensaio baseado principalmente no semeado enrolamento e agregação de substrato de proteína (PrP) recombinante do prião usando sementes de príon como um modelo para a conversão. RT-QuIC é uma nova técnica de alta produtividade, que é análoga à reação em cadeia da polimerase em tempo real (PCR). Deteção de crescimento de amiloide fibrila baseia-se o corante Thioflavin T, que fluoresce a mediante interação específica com proteínas ricas ᵦ-folha. Assim, a formação de amiloide pode ser detectada em tempo real. Procurou-se desenvolver um teste de rastreio não-invasiva confiável para detectar os príons de doença (CWD) desperdiçando crônica no extrato fecal. Aqui, nós adaptamos especificamente a técnica de RT-QuIC revelará o PrPSc semeadura atividade nas fezes de CWD infectado cervídeos. Inicialmente, a atividade de propagação dos extratos fecais que estamos preparados foi relativamente baixa em RT-QuIC, possivelmente devido a potenciais inibidores de ensaio no material fecal. Para melhorar a atividade de preparação de extratos de fezes e remover potenciais inibidores de ensaio, nós homogeneizado as amostras fecais em um buffer que contém detergentes e inibidores de protease. Também apresentámos as amostras de diferentes metodologias para concentrar o PrPSc com base na precipitação de proteínas usando ácido fosfotúngstico de sódio e força centrífuga. Finalmente, os extratos de fezes foram testados por otimizado RT-QuIC que incluiu a substituição de substrato no protocolo para melhorar a sensibilidade da deteção. Assim, estabelecemos um protocolo para a deteção sensível de príons CWD semeadura atividade nas fezes de cervídeos pré-clínicos e clínicos por RT-QuIC, que pode ser uma ferramenta prática para o diagnóstico não-invasivo de CWD.

Introduction

Doenças do prião ou encefalopatias espongiformes transmissíveis (EET) são doenças neurodegenerativas, incluindo a doença de Creutzfeldt - Jakob (CJD) em humanos, a encefalopatia espongiforme bovina (EEB) em bovinos, tremor epizoótico dos ovinos e caprinos e desperdiçando crônica doença (CWD) em cervídeos 1,2. EET caracterizam-se pela aparência distintiva espongiforme e perda de neurônios do cérebro. De acordo com a hipótese de "proteína apenas", príons são principalmente compostos de PrPSc ('Sc' para o tremor epizoótico) 3, uma isoforma misfolded da proteína príon celular codificado anfitrião, PrPC. PrPSc resulta da conversão de PrPC em uma conformação enriquecida em ᵦ-folhas 4,5,6 , que pode atuar como uma semente para vincular e converter outras moléculas de PrPC . As moléculas de PrPSc recém-gerado são incorporadas em um crescente polímero 7,,8 que invade oligômeros menores, resultando em maior número de núcleos infecciosos. PrPSc é propenso a agregação e é parcialmente resistente às proteases 9,10.

CWD afeta alces selvagens e de criação (Cervus canadensis), veado (Odocoileus hemionus), cariacu (WTD; Odocoileus virginianus), alce (Alces alces) e Rena (Rangifer tarandus tarandus) 11,12,13. É considerada a mais contagiosa doença de Creutzfeld-Jacob com transmissão horizontal favorecido por cervídeos provenientes interações e persistência ambiental de infecciosidade 14,15. Ao contrário de outras doenças de príon onde PrPSc acumulação e infecciosidade estão confinados ao cérebro, em CWD estas também são encontradas em tecidos periféricos e fluidos corporais, por exemplo, saliva, urina e fezes 16,17, 18.

Imuno-histoquímica é considerada o padrão-ouro para o diagnóstico CWD detectar a distribuição de PrPSc e espongiforme lesões 19,20. ELISA e em casos mais raros, borrão ocidental também são usados para diagnóstico CWD. Assim, o atual diagnóstico de doença de príon é baseado principalmente na detecção de príons em tecidos post-mortem. Diagnóstico ante mortem por CWD está disponível por tirar as amígdalas ou biópsias de tecido linfoide associado a mucosa reto-anal (RAMALT); no entanto, este procedimento é invasivo e requer a captura dos animais. Assim, o uso de amostras facilmente acessíveis, tais como urina e fezes, seria uma maneira prática para a deteção de príons CWD. No entanto, esses harbor excreções relativamente baixa concentrações dos priões abaixo do limite de detecção dos métodos de diagnóstico atuais. Por conseguinte, uma ferramenta diagnóstica mais sensível e alta taxa de transferência é necessária. Em vitro sistemas de conversão, tais como proteína enrolamento amplificação cíclica do ensaio (PMCA) 21, amiloide semeadura do ensaio e conversão de tremor induzido em tempo real (RT-QuIC) ensaio 22,23, 24 são ferramentas muito poderosas para explorar a capacidade auto-propagação de PrPSc de imitar em vitro o processo de conversão de príon e, assim, ampliar a presença de quantidades minuciosas de PrPSc para níveis detectáveis 25 ,26. O método de RT-QuIC, no entanto, tira proveito do fato de que o produto de conversão enriquecido em estrutura secundária de β-folha especificamente pode ligar thioflavin T (Th-T). Portanto, o PrP recombinante (rPrP) mediante conversão semeado cresce em amiloides que ligam Th-T e, portanto, podem ser detectados em tempo real através da medição de fluorescência do Th-T expressada em unidades de fluorescência relativo (RFU) ao longo do tempo. Uma vez controlada, a RFU pode ser usada para avaliar atividades de semeadura relativas e parâmetros quantitativos como a fase de retardo. A fase de retardo representa o tempo necessário para atingir o limiar, durante a qual rPrP conversão a fase inicial da reação é abaixo do limite de detecção de fluorescência Th-T (h). O fim da fase de aparente defasagem, concomitante à formação de um núcleo de amiloide suficiente (nucleação/alongamento), ocorre quando a fluorescência de Th-T excede o nível de limiar e torna-se positivo. O crescimento das fibrilas podem ser detectadas em tempo real e a inicial do PrPSc ou semeadura atividade contida na amostra de amiloide é amplificado por segmentação que gera mais sementes. Estas sementes, por sua vez induzem uma rápida fase exponencial de crescimento de fibra amiloide.

Porque este ensaio é capaz de detectar tão baixo quanto 1 fg de PrPSc 24, a alta sensibilidade qualifica esta técnica para conseguir ante mortem ou diagnóstico não-invasivo, detectando PrPSc em vários tecidos periféricos, excreções ou outros tipos de amostra, abrigando os baixos níveis de infecciosidade. RT-QuIC definitivamente fornece vantagens sobre outros ensaios para sua reprodutibilidade, praticidade, rapidez (menos de 50 h) e baixos custos em comparação com os bioensaios. Evita as complexidades técnicas tais como sonication usado em PMCA; Além disso, ela é realizada em uma microplaca de fita-selado que minimiza o risco de contaminação de aerossol de cada poço. O formato multi bem permite a análise de até 96 amostras no mesmo experimento. Para combater o problema recorrente de falsos positivos e conversão espontânea de rPrP nos ensaios de conversão em vitro , a implementação de um limiar (cut-off) em RT-QuIC é muito útil. De fato, baseado nos resultados do controlo negativo (RFU média de amostras negativas + 5 SD 27), uma linha de base é configurada do qual seja possível discriminação entre amostras positivas e negativas. O uso de quatro repetições para cada amostra, portanto, pode ajudar a definir uma amostra como positivo quando pelo menos 50% de repetições a mostrar um sinal positivo, ou seja, cruzar o disco de corte 28. A homologia entre Sementes e substrato não é necessária no RT-QuIC, como por exemplo, em um estudo anterior, hamster rPrP foi encontrado ser um substrato mais sensível em relação ao substrato homólogas em humanos PrPvCJD semeado e tremor epizoótico ovelhas semeado reações 29. hamster-ovelha quimérico rPrP sugeriu-se também para ser um substrato mais adequado do que rPrP humano para detectar CJD variante humana priões 30. Assim, o uso de substratos rPrP de diferentes espécies é muito comum neste ensaio. Este ensaio tem sido aplicado com êxito a várias doenças de príon, como esporádicos DCJ 31,32,33, gendoenças de príon ETIC 34, BSE 35,36,37, 23,de tremor epizoótico36e CWD 38,39,40,41, 42. Estudos utilizando processados líquor, sangue, saliva e urina como sementes em RT-QuIC foram todos bem sucedidas para detectar PrPSc 38,39,40,41, 42. para fomentar a capacidade de deteção em amostras de plasma de sangue que podem conter inibidores da formação de amiloide, Orrú et al. (2011) desenvolveu uma estratégia para remover potenciais inibidores da formação de amiloide penteando PrPSc passo de imunoprecipitação (IP) e RT-QuIC, chamado "reforçada QuIC" ensaio (eQuIC). Além disso, uma etapa de substituição do substrato foi empregada após ~ 24 h de tempo de reação a fim de melhorar a sensibilidade. Em última análise, como baixa como 1 ag de PrPSc era detectável por eQuIC 30.

Fim de extratos de fezes de purificar e remover inibidores possível ensaio nas fezes, amostras fecais coletadas em estágios pré-clínicos e clínicos de elk após infecção oral experimental foram homogeneizadas em tampão contendo detergentes e inibidores de protease. Os extratos de fezes mais foram submetidos a diferentes metodologias para concentrar o PrPSc nas amostras utilizando a precipitação de proteínas através da precipitação do sódio fosfotúngstico ácida (NaPTA). O método de precipitação de NaPTA, primeiramente descrito por Safar e col 43, é usado para concentrar o PrPSc em amostras do teste. A incubação de NaPTA com a amostra resulta em precipitação preferencial do PrPSc ao invés de PrPC. No entanto, o mecanismo molecular é ainda incerto. Esta etapa também ajudou a contendo e impedindo a conversão espontânea de rPrP, que é observado em alguns casos. Finalmente, os extratos de fezes foram testados por otimizado RT-QuIC usando rPrP rato (aa 23-231) como substrato e incluindo substituição de substrato no protocolo para melhorar a sensibilidade da deteção.

Aqui os resultados demonstram que este método melhorado pode detectar concentrações muito baixas de príons CWD e aumenta a sensibilidade de detecção e especificidade em amostras fecais em comparação com um protocolo sem substituição de precipitação e substrato de NaPTA. Potencialmente, este método pode ser aplicado a outros tecidos e fluidos corporais e pode ser de grande utilidade para vigilância CWD em cervídeos, selvagens e em cativeiro.

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Protocol

1. RT-QuIC usando Material Fecal

  1. preparação de cervídeos provenientes de fezes de extratos
    1. Make homogenate fecal pela adição de 1 g de material fecal para 10 mL de fezes Extraia buffer (fosfato de sódio de 20 mM, pH 7.1, 130 mM de NaCl, 0,05% Tween 20, 1 mM PMSF e 1x completam os inibidores de protease, EDTA-free) para dar uma concentração final de 10% (p/v). O buffer de homogeneização pode ser preparado antes da utilização e armazenado a -20 ° C.
    2. Homogenize pelotas fecais (1g) e buffer (10 mL) em tubos (por exemplo, tubos de gentleMACS M) usando um dissociador com um programa pré-estabelecido do fabricante para proteínas para 1 min à temperatura ambiente. Repita este passo de duas a três vezes, até as amostras fecais são completamente homogeneizadas no buffer.
    3. Selar os tubos com parafilm e coloque-os em um agitador de plataforma ou giratório balanço para uma incubação de 1h à temperatura ambiente.
    4. Centrifugar os tubos a 18.000 x g durante 5 min à temperatura ambiente.
    5. Coletar os sobrenadantes que contêm a proteína extrai e alíquota-los em 1,5 mL tubos. Alíquotas podem ser armazenadas a-80 ° C para mais aplicativos.
  2. Concentração de PrP Sc nas fezes extrai
    Nota: a fim de concentrar os príons CWD nas amostras de fezes de extrato, melhorando assim a sensibilidade de detecção por RT-QuIC, é adicionado a um passo de precipitação de proteínas para o protocolo.
    1. Método de precipitação NaPTA
    2. Adicionar 250 µ l de 10% (p/v) de N-Lauril sarcosinate (sarkosyl) a 1 mL de proteína fecal Extraia-o para dar uma concentração final de sarkosyl de 2% (v/v).
    3. Selar os tubos que contêm as amostras com parafilm e incubam a 37 ° C por 30 min sob agitação constante a 1.400 rpm em um thermomixer.
    4. Ajustar a mistura de extrato de proteína fecal e sarkosyl com uma solução contendo 10% (p/v) de ácido fosfotúngstico de sódio e 170 mM de cloreto de magnésio, pH 7,4 para obter uma concentração final de 0,3% (p/v) o ácido fosfotúngstico de sódio nas amostras.
    5. Incubar as amostras a 37 ° C por 2 h com agitação constante a 400 rpm.
    6. Centrifugar as amostras a 14 ° C por 30 min em 15.800 x g. remover os sobrenadantes cuidadosamente.
    7. Lavar as pelotas por resuspending-los em tampão de lavagem (10 mM Tris-Cl, pH 7,5, 100 mM de NaCl, 0,5% Triton-X100, EDTA 10 mM, 0,5% de sódio Deoxycholate do (w/v) e 0.1% sarkosyl (w/v)).
    8. Centrifugar as amostras a 14 ° C por 15 min em 15.800 x g. remover os sobrenadantes cuidadosamente.
    9. Resuspenda as pelotas em 100 µ l (1/10 do volume original da proteína fecal extrair) de tampão de diluição QuIC-RT.
      Nota: RT-QuIC tampão de diluição (fosfato de sódio de 20 mM, pH 6,9, 130 mM NaCl, SDS 0,1% (p/v) e 1 X N2 suplemento) é preparado antes da utilização. Um volume total de 10 mL é filtrado através de um filtro de seringa 0,2 µm acrodisc usando uma seringa e em seguida, armazenado a-20 ° C até o uso.
    10. Armazenar as amostras de NaPTA Tratado a-20 º C até utilizá-las no ensaio de RT-QuIC.
  3. RT-QuIC ensaio
    1. Prepare uma solução stock de 10mm fresco Th-T (0,032 g de Th-T em 10 mL de água destilada dobro H 2 O).
    2. Fazer uma diluição de 01:10 da solução estoque em dobro destilada H 2 O para fazer uma concentração final de Th-T de 1 mM o filtro através de uma seringa de acrodisc 0,2 µm filtro usando uma seringa Th-T.
    3. Descongelar o rato recombinante PrP (rPrP, aa 23-231) substrato (10 µ g/mL por reação de RT-QuIC) armazenado a -80 ° C no Ice.
    4. Carga 500 µ l de substrato rPrP cada vez em 100 kDa tamanho microtubos de filtro de exclusão e centrifugação a 14.000 x g durante 5 min à temperatura ambiente (um tubo/filtro pode ser usado até duas vezes).
    5. Transferir o substrato eluted em um tubo estéril de 1,5 mL e mantê-lo em 4 ° C até o uso.
    6. Tampão de diluição descongelar RT-QuIC armazenado a -20 ° C.
      7. Tampão de diluição de
    7. fazer diluições das sementes (extracto de proteína fecal) QuIC-RT:
      Amostra não diluída: use o extrato de proteína fecal sem diluir
      diluído a 2 x 10 -1
      diluído a 2 x 10 -2
      diluído a 2 x 10 -3
    8. preparar soluções estoque para RT-QuIC mistura reacional:
      tampão fosfato salino ( PBS): 5 X
      NaCl: solução de NaCl preparada em água destilada dobro H 2 O. o estoque 2 M
      100 mM de EDTA: solução de EDTA preparado em dobro destilada H 2 O.
    9. Antes da utilização de todas as soluções (etapa 1.3.8), filtrar cada solução separadamente através de um filtro de seringa 0,2 µm acrodisc usando uma seringa e mantê-los estéril à temperatura ambiente.
    10. Preparar um volume total da mistura de reação RT-QuIC de acordo com o número de amostras (98 volume µ l de reação por amostra e quatro repetições por amostra) a ser usado, acrescido de 10% desse volume, para ter certeza de ter bastante mistura para todas as reações.
      1. Uso um tubo de 15 mL para preparar a mistura de reação QuIC-RT (fosfato de sódio de 20 mM, pH 6,9, 300 mM de NaCl, 1 mM EDTA, 10 µM Th-T, substrato de rPrP 10 µ g/mL e água bidestilada para ajustar a concentração final rPrP na reação) usando o sol estoque utions.
      2. Misture todas as soluções bem pipetando subindo e descendo com uma pipeta com uma ponta do filtro. Evitar, tanto quanto possível, o uso de vórtice.
      3. Despeje a mistura em um reservatório de pipetagem descartáveis de 50 mL.
      4. Usar uma pipeta multicanal para carregar 98 µ l da mistura de reação RT-QuIC em cada poço de uma placa de 96 poços óptica inferior.
    11. Adicionar para cada RT-QuIC µ l de reação 2 de não diluído ou extrato de proteína fecal serialmente diluída 10 vezes. Teste cada amostra em quatro repetições.
      Nota: Em cada experimento, diluições em série de amostras fecais (variando de não diluído a 2 x 10 -3) de CWD-negativo e verificadas CWD-positivo de animais são usadas como controles positivos e negativos, respectivamente.
    12. a placa com uma fita de vedação do selo antes da incubação em um leitor de placas a 42 ° C para 25 h com ciclos repetidos de 1min dupla orbital tremendo (700 rpm) e 1 min descansando durante a incubação.
      13. Definir configurações de medição de fluorescência de
    13. :
      Excitação: 450 nm
      emissão: 480 nm
      ler, de fundo número de flashes: 20
      ganho Manual: 1000 (dependendo da máquina)
      tempo de integração: 20 µs
    14. retirar a placa do leitor de placa no final da 25 h.
    15. Spin para baixo a placa a 3.000 x g por 3 min evitar a potencial contaminação entre os poços.
    16. Remover o selo da placa de.
    17. Prepare uma nova placa de 96 poços, acrescentando 90 µ l da mistura de reação RT-QuIC contendo substrato fresco e fresca fluorescência tingir Th-T conforme descrito na seção 1.3.1 a 1.3.6.
    18. Placa de transferência 10 µ l de cada poço da placa de primeira para o 96 recém preparado bem.
    19. a nova placa do selo e continuar o ensaio QuIC-RT para adicional h 50 seguindo os passos descritos na etapa 1.3.13. Esta etapa adicional de 50 h vai fazer o tempo de reação total de 75 h.
      Nota: Todos os procedimentos de ensaio de RT-QuIC são feitos sob o armário de biossegurança.
    20. Coleta de dados.
      1. Leitura e documento do sinal de fluorescência do Th-T de cada poço a cada 15 min.
      2. Coletar dados dos ciclos totais usando software de análise de dados e a transferência para uma planilha com a média de reações quadruplicate.
      3. Plotar as médias dos dados. O eixo x corresponde ao tempo de reação de RT-QuIC (h) e o eixo y corresponde as unidades de fluorescência relativo (RFU). Cada curva corresponde a uma diluição de uma amostra conhecida.
      4. Em cada experimento, demarcar um limite, calculando-se os valores médios mais elevados do controlo negativo, mais 5 desvios-padrão, conforme descrito na atual publicado literatura 41.
        NOTA: Todas as réplicas que cruzaram o limiar definido são consideradas positivas. Se pelo menos duas das quatro repetições cruzar o limiar, a amostra é então considerada positiva.

2. Purificação da proteína príon de recombinante (rPrP)

  1. crescimento de estoque bacteriana e expressão de rPrP
    Nota: A Escherichia coli (e. coli) COE Rosetta (DE3) transformada com o vetor de pET-24 codificação a mouse PrP (resíduos 23-231) foi usado para preparar o rPrP.
    1. Descongelar o estoque de glicerol de Rosetta (DE3) transformada com animal de estimação-24 mPrP(23-231) na Ice.
    2. Raia LB (Luria Bertani) placas com uma concentração final de canamicina de 50 µ g/mL e incuba durante uma noite em uma incubadora de 37 ° C. Certifique-se que as placas são de cabeça para baixo para evitar a condensação de umidade na mídia sólida contendo as bactérias. Prepare duas placas para certificar-se de ter crescimento em pelo menos uma das duas placas.
    3. Preparar 1 L de LB e autoclave para torná-lo estéril.
    4. Suplemento 1 L de estéril LB mídia com 1 mL de canamicina (50 mg/mL) e 1 mL de cloranfenicol (34 mg/mL).
    5. Escolher uma colônia de cada placa, usando um loop de inoculação descartável para inocular 3 mL de meio LB contendo canamicina e cloranfenicol.
    6. Lugar da miniculturas em uma incubadora a 37 ° C, com agitação constante a 225 rpm para 5-6 h.
    7. Adicionar as miniculturas para o resto do original 1 l de LB mídia juntamente com Express 1 de sistema Autoinduction para indução da expressão da proteína.
    8. Lugar da cultura no frasco de 2 L, ou maior, em uma incubadora a 37 ° C, com agitação constante a 200 rpm por 20-24 h.
    9. Dividir a cultura de 1L em tubos de centrífuga de 4 x 250 mL.
    10. Spin para baixo os tubos contendo a cultura a 3.750 x g por 20 min em temperatura ambiente.
    11. Desprezar o sobrenadante e coletar as pelotas bacterianas em tubos de centrífuga de 50 mL e, em seguida, congelá-los a-80 ° C até o processamento adicional. As pelotas resultantes pesar 3 a 4 g para um rendimento de proteína boa.
  2. Preparação do corpo de inclusão
    1. descongelar a pelota congelada (3 a 4 g) a 37 ° C por alguns minutos.
    2. Congelar a pelota, mais uma vez para 10 min a-80 ° C e descongelar novamente. Repita essa etapa de congelamento e degelo mais duas vezes.
    3. Resuspenda o pellet bacteriano em 1 X reagente de lise (por exemplo, BugBuster Master Mix) pipetando completamente. Use 5 mL do reagente para 1G de pelota bacteriana. Certifique-se de homogeneizar completamente o mix.
    4. Incubar o homogeneizado em um balancim por 20 min em temperatura ambiente.
    5. Centrifugar o homogenate a 16.000 x g por 20 min em temperatura ambiente.
    6. Descartar os sobrenadantes derramando cuidadosamente la fora
    7. Homogeneizar as pelotas do mesmo volume de reagente de Lise como usado na etapa anterior de 1x.
    8. Incubar o homogeneizado por 15 min em uma cadeira de balanço em temperatura ambiente.
    9. Adicionar um volume suficiente de 01:10 (0.1 x) reagente de Lise para obter um volume total homogeneizado de 40 mL. Misture por inversão para certifique-se de homogeneizar bem.
    10. Centrifugar o homogenate a 7.900 x g, durante 15 min a 4 ° C.
    11. Descartar o sobrenadante derramando cuidadosamente la
    12. Resuspenda o pellet em 40 mL de 0.1 x reagente de Lise.
    13. Centrifugar o homogenate a 16.000 x g, durante 15 min a 4 ° C.
    14. Desprezar o sobrenadante cuidadosamente por coloca-lo e armazenar a pelota contendo os corpos de inclusão a-20 º C até posterior processamento.
  3. Purificação da proteína
    1. descongelar os corpos de inclusão à temperatura ambiente.
    2. Dissolver os corpos de inclusão descongelados em 14 mL de 8m guanidina-HCl (cloridrato de guanidina g 38 em 0.1 M NaPO 4 pH 8.0 e o preenchimento da suspensão com H 2 O a 50 mL; não ajustar o pH a solução final) para solubilizar proteínas.
    3. Certifique-se de homogeneizar bem pipetando para cima e para baixo.
    4. Incubar o lisado sobre um roqueiro à temperatura de 50 min.
    5. Preparar 18 g de resina Ni-NTA grânulos (18 g para pellet bacteriana de 3 a 4 g); enxaguá-los com 100 mL de água usando a vácuo e um filtro garrafa-top 100 mL 0,22 µm.
      1. Coloque a 18 g de grânulos de resina Ni-NTA em tubo de 50 mL e adicionar um volume suficiente de desnaturação buffer (100 mM de fosfato de sódio, 10 mM Tris, pH 8.0, 6m cloridrato de guanidina, pH 8) para fazer o volume final de 50 mL.
      2. Equilibrar as contas no buffer de desnaturação por 50 min em uma cadeira de balanço em temperatura ambiente.
    6. Centrifugar o corpo de inclusão lisado a 16.000 x g por 5 min remover os resíduos insolúveis.
    7. Adicionar o sobrenadante para os grânulos equilibrados e descartar as pelotas.
    8. Colocar a mistura sobre um roqueiro para 40 min à temperatura ambiente para permitir a ligação às proteínas a resina Ni-NTA.
      Nota: Grânulos de Quelato de níquel são usados para purificar o PrP por sua afinidade de níquel. A região N-terminal de histidina-rica de PrP processa a afinidade para nickel(II), que permite que a proteína ligar ao níquel íons sem qualquer marca de sua-.
    9. FPLC de lavagem com água para limpar para fora as duas linhas (A e B).
    10. Executar o buffer de desnaturação (100 mM de fosfato de sódio, 10 mM Tris, pH 8.0, 6m cloridrato de guanidina, pH 8) através de ambas as linhas (A e B) para aprontar o sistema (a coluna ainda não está ligada.)
    11. Carregar a resina na coluna. Certifique-se de minimizar as bolhas de ar.
    12. Unir a coluna para o FPLC e executar um gradiente linear de 100% desnaturação de tampão A e 0% de redobramento buffer B (fosfato de sódio de 100 mM, 10 mM Tris, pH 8.0) em primeiro lugar para 0%, tampão de desnaturação e 100% dobrar tampão até o final. Esta mudança gradual é executada em uma taxa de fluxo de 0,75 mL/min para 240 min e é necessária para a adequada de dobramento de PrP.
      Nota: Durante o processo de purificação cromatográfica, o PrP desnaturado é primeiro lentamente novamente sobre a resina através da aplicação de um gradiente linear de redobramento reserva para substituir o buffer de desnaturação. Esta etapa também remove o guanidina-HCl caotrópicas.
    13. Certifique-se de buffer de redobramento 100% continua a fluir através da coluna para um adicional 30 min em 0,75 mL/min.
    14. Lavagem linha A com água, seguida de tampão de eluição (100 mM de fosfato de sódio, 10 mM Tris, imidazol 500 mM, pH 5,8) ignorando a coluna. Isto irá limpar o buffer de desnaturação, que foi substituído agora pelo tampão de eluição no sistema AKTA.
    15. Proteína Elute em 2 mL/min, executando um gradiente linear de 40 min de 100% reenovelamento buffer B e tampão de eluição de 0% A primeiro para 0% dobrar buffer e tampão de eluição de 100%.
      Nota: A alta concentração de imidazol em tampão de eluição competirão PrP ' ligação de s para o nickel(II). O pico principal proteína deve começar a eluir cerca de 1/3 do caminho através do gradiente.
      1. Assistir o cromatograma para OD 280 nm aumentar a.
    16. Coletar apenas os tubos que contêm a proteína no centro do grande pico.
      Nota: As frações eluted de 2 mL cada são coletadas em tubos de 15 mL.
    17. Diluir a proteína contida nos tubos imediatamente com volume de aproximadamente 1/3 (1ml) do buffer de diálise (fosfato de sódio de 10 mM, pH 5,8).
    18. Imediatamente, coloque os tubos no Ice.
    19. Piscina a proteína eluted contida nos tubos.
    20. Pobre a proteína em diálise Cassettes (peso molecular de corte 10 kDa).
    21. Colocar as fitas no buffer de diálise pre-refrigerados (3,6 L) por 2 h a 4 ° C e, em seguida, transferir as fitas em um buffer de diálise fresco (3,6 L) para a noite. Fazer Se o buffer de diálise está sob constante agitação.
    22. Filtrar proteína após diálise através de um filtro de seringa 0,2 µm acrodisc utilizando uma seringa.
    23. Medir a concentração de proteína usando um kit de ensaio de proteína BCA.
    24. Concentrado ou diluir se necessário para ajustar a concentração de proteína para 0,3 mg/mL.
      Nota: Confirmar a pureza por SDS-PAGE e coloração de azul de Coomassie.
    25. Fazer alíquotas de 1 mL de proteína em tubos microcentrifuga e imediatamente armazenar a-80 ° C até nova utilização, conforme descrito no protocolo de RT-QuIC.

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Representative Results

Os extratos fecais CWD preparados em 10% (p/v) foram capazes de reação de RT-QuIC de sementes, ainda a sensibilidade da deteção era baixa 27. Usar uma reserva específica para homogeneização fecal foi um passo fundamental para evitar a fluorescência de fundo elevado em RT-QuIC reações concomitantes ao uso de substrato de rato rPrP ao invés de veado rPrP que permitiu para obter mais específico resulta 27. A adição de NaPTA precipitação reduzida a conversão espontânea de rPrP em RT-QuIC (Figura 1) sem inibir a amplificação da atividade semeadura das reações (Figura 2). Embora tenha sido observada amplificação melhor tratamento de NaPTA, sinais de fluorescência resultante de amostras fecais positivas CWD foram ainda baixo (Figura 1). Além disso, a amplificação do prião de algumas amostras alcançado um platô constante a níveis baixos de fluorescência. Isto indica a saturação das reacções, que pode ser devido a degradação/desnaturação de rPrP ou a formação de agregados de fora-caminho que consomem o rPrP piscina 30. Para além disso, melhorar a amplificação dos priões e aumentar a sensibilidade da deteção, uma etapa de substituição do substrato foi incorporada o protocolo. A introdução de substituição de substrato para o protocolo de RT-QuIC (Figura 2) aumentou a sensibilidade (77%; 14 de 18 amostras em RT-QuIC foram positivas) e especificidade (100%; nenhum dos controles negativos em positivo virou QuIC-RT) da deteção (ver 1 tabela de Cheng et al . 27). finalmente, todos estes passos (Figura 3) levaram para a otimização de um protocolo confiável e sensível para a deteção RT-QuIC de príons CWD, usando a amostra contendo baixos níveis de infecciosidade.

Substituição de substrato foi introduzida após o primeiro 25 h de reação de RT-QuIC, pela reação de reabastecimento tampão contendo substrato fresco e fresca fluorescência tingir Th-T. Introduzindo-se a etapa de substituição do substrato no protocolo, o tempo de reação de RT-QuIC foi ampliado de 50 h para 75 h. Como mostrado na Figura 2 , com a incorporação de substituição do substrato, observou-se uma melhoria significativa da amplificação do prião.

Figure 1
Figura 1: reduzida conversão espontânea de substrato de rPrP rato em RT-QuIC semeado com purificada CWD-negativo fecal homogenate. Homogenates fecais de alces não infectados (C181-006) ou veado-mula foram homogeneizadas em tampão de extrato de fezes para obter uma concentração final de 10% (p/v). Para a purificação, estes homogenates fecais foram processados e 10 vezes concentradas pela precipitação de NaPTA. Os impuro fecais homogenates (um), formas de NaPTA-purificado e concentradas (b) diluídas conforme indicado foram usados para propagar quadruplicate RT-QuIC reações com rPrP de rato como substrato. Os y-Axes mostram unidades relativas de fluorescência Th-T, que os x-axes retratam o tempo de reação. Uma redução de conversões espontâneas foi vista em amostras fecais NaPTA-purificado (b). Dados utilizados de Cheng et al . 27. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2. Melhor detecção de príons CWD nas fezes usando substituição de substrato. Homogenates fecais de alces individuais (C051-05, C052-05) infectados por via oral com príons CWD foram purificados e concentrou-se por precipitação de NaPTA. Tratados com NaPTA amostras foram diluídas entre 2 x 10-1 a 2 x 10-3 usado para reações de RT-QuIC quadruplicate semente com substrato rPrP de rato. O ensaio de RT-QuIC foi realizado sem substituição de substrato (um) em um período regular de 50 h ou com a incorporação de substituição de substrato para um período de incubação prolongado de 75 h (b). Para este último, substituição de substrato foi introduzida após o primeiro 25 h de reação QuIC-RT. Noventa por cento do volume reação foi removido e substituído por uma mistura de reação RT-QuIC preparada contendo substrato rPrP e Th-T. Introduzindo-se a etapa de substituição do substrato no protocolo, o tempo de reação de RT-QuIC foi prorrogado de 50 h-75 h. dados utilizados de Cheng et al . 27. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: diagrama de fluxo descrevendo PrPSc fecal extração de cervídeos CWD-infectados e propagação de atividade e do prião amplificação usando RT-QuIC ensaio. Amostras fecais de animais infectados CWD são homogeneizadas em um buffer de extração fecal, submetidas ao método de precipitação de NaPTA e testadas pelo ensaio de RT-QuIC. O último foi realizado através da introdução de uma etapa de substituição do substrato. A incorporação de NaPTA e substrato passos de substituição resultou em uma redução de conversão espontânea e forte melhoria na semeadura amplificação de atividade e príon. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

RT-QuIC anteriormente foi empregado para detectar os príons CWD em urina e fezes extractos de infectados oralmente cariacu e veado-mula 38. O sistema mostrado neste manuscrito é um método adaptado do ensaio QuIC-RT. Etapas adicionais foram incorporadas o ensaio de RT-QuIC "clássico" para melhorar a detecção e a sensibilidade do ensaio para príons CWD em material fecal de animais infectados.

A baixa sensibilidade da deteção em extractos de fezes nos levou para o aprimoramento do protocolo de RT-QuIC. Para alcançar sensível em vitro deteção dos priões nas fezes, passos críticos foram adicionados para a preparação da amostra para remover componentes que interferem com a conversão de príon e/ou propagação e aumentar a sensibilidade da deteção. Incorporando a substituição de substrato no protocolo de RT-QuIC e tratamento de NaPTA/sarkosyl foi fundamental para detecção de atividade de propagação em alces de infectados CWD pré-clínicos e clínicos e para reforçar os limites de deteção de conversão do prião em extractos de fezes .

Precipitação de NaPTA é uma técnica comum, geralmente acompanhada de extração de sarkosyl para isolar e concentrar o PrPSc a um nível detectável. NaPTA é conhecido para precipitar de preferência PrPSc / PrPC 43 , enquanto sarkosyl é um detergente conhecido para facilitar a conversão de prião em baixas concentrações em um sistema livre de células 44. Em alinhamento com isso, usando uma combinação de NaPTA e sarkosyl pode gerar um maior rendimento de agregados fibrillar em vitro como mostrado antes 45,46,47. Esta metodologia foi incorporada anteriormente RT-QuIC ensaio para detectar periféricos príons CWD com êxito na amostra, tais como saliva purificada 39 e sangue total 40. Nosso estudo fornece a primeira evidência que incorporar NaPTA/sarkosyl purificação no protocolo da preparação da amostra fecal permite a detecção de príons CWD por RT-QuIC. Além disso, com esta metodologia fomos capazes de reduzir a conversão espontânea de substrato rPrP em negativo CWD homogenates fecal no ensaio de RT-QuIC.

Um mecanismo potencial tem sido proposto para explicar o efeito da substituição de substrato 30. Nas primeiras rodadas de reação (antes da adição do substrato fresco), apenas uma pequena quantidade de sementes é adicionada à RT-QuIC reações. Enquanto apenas uma parte do rPrP é incorporada as reações semeadas, o resto do substrato também pode ser usado acima interagindo com as paredes de poços de placa de reação para agregados de forma não-amiloide, ou ser alterado de uma forma que é menos propensa a ser convertido pela Sé RT-QuIC DED produtos em vez das sementes originais. Como resultado, a taxa de incorporação de rPrP às sementes é lenta, e a formação de fibrila não é detectável na fase lag. Como os produtos de RT-QuIC semeados cultivados na fase lag finalmente são alongados para chegar a uma fase de"montagem rápida", príons podem ser rapidamente amplificada por segmentação através de agitação ou lateral adição de agregados menores. Nesta fase, o substrato fresco adicionado para a reação é prontamente incorporado a produtos semeados, ao invés de formando agregados inespecíficos. A incorporação da etapa de substituição de substrato em nosso protocolo foi uma modificação que o aumento da sensibilidade; foi útil detectar as sementes do prião em amostras com uma quantidade muito baixa de PrPSc de animais pré-clínicos e/ou contendo compostos inibitórios.

Usando RT-QuIC ensaio ao invés de PMCA, que é a primeira em vitro proteína enrolamento ensaio de amplificação descritos 21, tem várias vantagens. Em PMCA os tubos são incubados e lisados num banho de água contido o sonicador; os tubos posicionados na periferia do sonicador mostram menos eficácia de amplificação em comparação com os tubos posicionados no centro 48. O sistema RT-QuIC tremer parece ser mais fácil de controlar. O uso de um formato bem 96 é uma vantagem real de RT-QuIC, no entanto, o PMCA mb-desenvolvido por Moudjo et al . 49 , 50, mostrou benefícios similares, mas ainda é menos usado em PMCA.

Como substrato, RT-QuIC usa rPrP recombinante para conversão; em contraste, o PMCA na maioria dos casos usa homogenate cerebral normal. Além disso, em RT-QuIC nenhuma homologia de sequência é necessária entre Sementes e substrato 51–53.

A presença de cofactores é necessária para a replicação de prião em PMCA e o produto resultante é contagiante. No entanto, no ensaio de RT-QuIC, o PrP amplificado não é infecciosa. Em ensaios de amplificação em vitro a ocorrência de reações falso-positivas mais provavelmente por causa de conversão espontânea de PrPC é um problema recorrente. Portanto, o ensaio e condições utilizadas neste estudo foram adaptadas para minimizar essas perturbações para maximizar a diferença entre semeado rPrP-conversão e conversão espontânea.

Em conclusão, tratamento de NaPTA/sarkosyl permite a remoção de inibidores de ensaio nas fezes e reduz a conversão espontânea. Curiosamente, o tratamento não dificultar a semeadura atividade de precipitatedPrPSc. Além disso, a sensibilidade da deteção foi significativamente melhorada quando a substituição do substrato concomitantemente foi adoptada.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Nós estamos gratos ao Dr. Byron Caughey (NIH Rocky Mountain Laboratories) para fornecer a formação e o plasmídeo de expressão bacteriana do PrP de cervídeos provenientes. SG é suportado pelo programa da cadeira de pesquisa do Canadá. Reconhecemos que o financiamento para esta pesquisa para SG do Genome Canadá, príon Alberta Research Institute e Alberta agricultura e silvicultura através do genoma Alberta e a Universidade de Calgary para apoiar este trabalho. Reconhecemos uma bolsa de pesquisa da Margaret Gunn Foundation para a pesquisa Animal.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials
Acrodisc seringe filters PALL 4652
amicon Ultra-15 Centrifugal filter Unit Millipore UCF901024
BD 10 ml seringe VWR CA75846-842
Chloramphenicol Sigma-Aldrich C0378
Corning bottle-top vacuum filters Sigma-Aldrich 431118
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich E4884
gentleMACS M Tube Miltenyi Biotec 130-093-236
Guanidine hydrochloride Sigma-Aldrich G4505
Imidazole Sigma-Aldrich I5513
Isopropanol Sigma-Aldrich I9516
Kanamycin sulfate Sigma-Aldrich 60615
Luria-Bertani (LB) broth ThermoFisher Scientific 12780029
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M9272
N2 supplement (100X) ThermoFisher Scientific 15502048
N-lauroylsarcosine sodium salt (sarkosyl) Sigma-Aldrich ML9150
Nanosep centrifugal devices with omega membrane 100K PALL OD100C34
Nunc sealing tapes ThermoFisher Scientific 232702
Parafilm M VWR 52858-000
phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Sigma-Aldrich P7626
Protease inhibitor tablet Roche 4693159001
Sodium chloride Sigma-Aldrich S3014
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich D6750
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Calbiochem 7910-OP
sodium phosphate Sigma-Aldrich 342483
Sodium phosphate dibasic anhydrous Sigma-Aldrich S9763
Sodium phosphate monobasic monohydrate Sigma-Aldrich S9638
Sodium phosphotungstate hydrate (NaPTA) Sigma-Aldrich 496626
Thioflavin T Sigma-Aldrich T3516
Tris-Hydroxy-Methyl-Amino-Methan (Tris) Sigma-Aldrich T6066
Triton-100 Calbiochem 9410-OP
Tween 20 Sigma-Aldrich P7949
Name Company Catalog Number Comments
Commercial buffers and solutions
BugBuster Master Mix Nogagen 71456-4
Ni-NTA superflow Qiagen 1018401
Phosphate-buffered saline (PBS) pH 7.4 (1X) Life Technoligies P5493
UltraPure Distilled Water Invitrogen 10977015
Name Company Catalog Number Comments
Standards and commercial kits
Express Autoinduction System 1 Novagen 71300-4
Pierce BCA Protein Assay Kit ThermoFisher Scientific 23227
Name Company Catalog Number Comments
Equipment setup
AKTA protein purification systems FPLC GE Healthcare Life Sciences
Beckman Avanti J-25 Centrifuge Beckman Coulter
Beckman rotor JA-25.50 Beckman Coulter
Beckman rotor JA-10 Beckman Coulter
FLUOstar Omega microplate reader BMG Labtech
gentleMACS Dissociator Miltenyi Biotec 130-093-235
Name Company Catalog Number Comments
Sofware
MARS Data Analysis BMG Labtech
GraphPad Prism6 GraphPad software

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Cheng, Y. C., Hannaoui, S., John, T. R., Dudas, S., Czub, S., Gilch, S. Real-time Quaking-induced Conversion Assay for Detection of CWD Prions in Fecal Material. J. Vis. Exp. (127), e56373, doi:10.3791/56373 (2017).

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