Workflow basiert auf der Kombination der isotopischen Tracer Experimente zu untersuchen, mikrobiellen Stoffwechsel von mehreren Nährstoffquellen

Audrey Bloem; Stephanie Rollero; Pauline Seguinot; Lucie Crépin; Marc Perez; Christian Picou; Carole Camarasa

doi:10.3791/56393

Methodenartikel

Workflow basiert auf der Kombination der isotopischen Tracer Experimente zu untersuchen, mikrobiellen Stoffwechsel von mehreren Nährstoffquellen

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DOI:

10.3791/56393

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22. Januar 2018

Audrey Bloem¹ , Stephanie Rollero² , Pauline Seguinot¹ , Lucie Crépin³ , Marc Perez¹ , Christian Picou¹ , Carole Camarasa¹

¹UMR SPO, INRA, SupAgroM, Université de Montpellier, ²IWBT Stellenbosch University, ³PILI, Toulouse White Biotechnology

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt ein experimentelles Verfahren, um den Stoffwechsel von mehreren Nährstoffquellen quantitativ und umfassend zu untersuchen. Dieser Workflow, basierend auf einer Kombination von isotopischen Tracer Experimente und ein Analyseverfahren ermöglicht das Schicksal der konsumierten Nährstoffe und die metabolische Herkunft der Moleküle können durch Mikroorganismen bestimmt werden.

Zusammenfassung

Studien auf dem Gebiet der Mikrobiologie verlassen sich auf die Umsetzung einer Vielzahl von Methoden. Insbesondere trägt die Entwicklung geeigneter Methoden wesentlich zur bietet umfangreiche Kenntnisse des Stoffwechsels von Mikroorganismen in chemisch definierten Medien mit einzigartigen Stickstoff und Kohlenstoffquellen wachsen. Im Gegensatz dazu bleibt die Verwaltung durch den Stoffwechsel von mehreren Nährstoffquellen, trotz ihrer breite Präsenz in natürlichen oder industriellen Bereichen nahezu unerforscht. Diese Situation ist vor allem der Mangel an geeigneten Methoden, der Ermittlungen zu behindern.

Wir berichten über eine experimentelle Strategie, quantitativ und umfassend zu erforschen wie Stoffwechsel funktioniert, wenn eine Nährstoff als eine Mischung aus verschiedenen Moleküle, d. h., eine komplexe Ressource bereitgestellt wird. Hier beschreiben wir die Anwendung für die Beurteilung der Partitionierung von mehreren Quellen von Stickstoff durch die Hefe metabolischen Netzwerkes. Der Workflow kombiniert bei stabiler Isotope Tracers Experimente mit ausgewählten ¹³C- oder ¹⁵N-markierten Substraten. Es besteht zunächst parallel und reproduzierbare Fermentationen in demselben Medium, beinhaltet eine Mischung aus N-haltige Moleküle; ausgewählten Stickstoffquelle ist jedoch jedes Mal beschriftet. Eine Kombination von analytischen Verfahren (HPLC, GC-MS) erfolgt die Kennzeichnung Muster gezielt Verbindungen zu bewerten und den Verbrauch und die Wiederherstellung von Substraten in anderen Metaboliten zu quantifizieren. Eine integrierte Analyse des kompletten Datensatzes gibt einen Überblick über das Schicksal der verbrauchten Substrate innerhalb der Zellen. Dieser Ansatz erfordert eine genaueste Protokoll für die Sammlung von Proben – erleichtert durch ein Roboter-gestützte System zur Online-Überwachung von Fermentationen – und die Erreichung der zahlreichen zeitaufwendige Analysen. Trotz dieser Einschränkungen erlaubt es, Verständnis, zum ersten Mal die Partitionierung von mehreren Quellen von Stickstoff in der Hefe metabolischen Netzwerkes. Wir aufgeklärt die Umverteilung von Stickstoff aus reichlicher Quellen gegenüber anderen N-Verbindungen und die metabolische Ursprünge des flüchtigen Molekülen und proteinogene Aminosäuren bestimmt.

Einleitung

Verständnis wie mikrobiellen Stoffwechsel funktioniert, ist ein zentrales Thema für die Gestaltung von effizienten Strategien zur Gärungsprozesse zu verbessern und die Produktion von fermentativen Verbindungen zu modulieren. Fortschritte in der Genomik und funktionelle Genomik in den letzten zwei Jahrzehnten weitgehend zur Erweiterung der Kenntnisse über die Topologie des metabolischen Netze in vielen Mikroorganismen beigetragen. Zugang zu diesen Informationen führten zu die Entwicklung von Konzepten, die für einen umfassenden Überblick über die Zellfunktionen¹abzielen. Diese Methoden setzen häufig auf eine modellbasierte Interpretation von mes....